Anti-micro rna-221 a promising genetic therapy of oral squamous cell carcinoma (scc-25)

Abstract Micro-RNA-221(miR-221) is one of oncogenic miRNAs that plays a vital role in the development and progression of oral cancers. The aim of this study is to introduce a new gene therapy for oral squamous cell carcinoma by blocking the expression of oncogenic miR-221 by its inhibitor. The present work was performed on squamous cell carcinoma cell line SCC-25 and anti-miR-221 was delivered to the cells using an ultrasound micro bubbles. Assessment of the effect of miR-221 inhibitor on SCC-25 cells was done using MTT assay, cell cycle analysis and apoptosis detection. In addition, reverse transcription-polymerase chain reaction was also used to detect the expression -miR-221 and its target genes. Using ANOVA, statistical analysis of the results showed significant inhibition of cell viability with and induction of cell apoptosis of SCC-25 cell line after transfection. Moreover, the expression of miR-221, Epidermal growth factor receptor (EGFR) and CDKNIB/p27 were downregulated without significant difference. Transfection of SCC-25 by inhibitor of miR-221 resulting in blockage of its expression leading to arresting of tumor growth. These results proved the effective role of micro-RNA inhibitors as novel therapeutic agent for oral cancers.

Resumo Micro-RNA-221 (miR-221) é um dos miRNAs oncogênicos que desempenham um papel vital no desenvolvimento e progressão de carcinomas orais. O objetivo deste estudo é apresentar uma nova terapia gênica para o carcinoma epidermóide oral por meio do bloqueio da expressão do miR-221 oncogênico por seu inibidor. O presente trabalho foi realizado na linhagem de células de carcinoma de células escamosas SCC-25 e o anti-miR-221 foi administrado às células usando micro-bolhas de ultrassom. A avaliação do efeito do inibidor miR-221 em células SCC-25 foi feita usando ensaio de MTT, análise do ciclo celular e detecção de apoptose. Além disso, a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa também foi usada para detectar a expressão -miR-221 e seus genes-alvo. Usando ANOVA, a análise estatística dos resultados mostrou inibição significativa da viabilidade celular e indução da apoptose celular da linhagem celular SCC-25 após a transfecção. Além disso, a expressão de miR-221, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e CDKNIB/p27 foram regulados para baixo sem diferença significativa. A transfecção de SCC-25 por inibidor de miR-221 resultou no bloqueio de sua expressão, levando à interrupção do crescimento do tumor. Esses resultados comprovaram o papel eficaz dos inibidores de micro-RNA como novo agente terapêutico para carcinomas orais.

Calcium and phosphorus levels in saliva are influenced by genetic polymorphisms in estrogen receptor alpha and microrna17

Abstract Homeostasis between salivary calcium and phosphorus is important for maintaining oral health. The aim of this study was to evaluate if polymorphisms in ESR1 (Estrogen Receptor Alpha), ESR2 (Estrogen Receptor Beta) and miRNA17 (microRNA17) are associated with calcium and phosphorus levels in saliva. Saliva from 276 12-year-old children were collected by masticatory stimulation and calcium and phosphorus levels were determined by Mass Spectrometry. Genomic DNA was extracted from remaining saliva and genetic polymorphisms in ESR1 (rs12154178, rs1884051, rs9340799 and rs2234693), in ESR2 (rs4986938 and rs1256049) and in miRNA17 (rs4284505) were genotyped using TaqMan chemistry and a real-time PCR equipment. Statistical differences in genotype and allele distributions between 'low' and 'high' calcium and phosphorus levels were determined using chi-square or Fisher´s exact tests. The analysis was also adjusted by sex (alpha of 5%). ESR1 rs9340799 had the less common genotype associated with higher calcium levels (p=0.03). The less common allele of ESR1 rs1884051 was associated with lower phosphorus levels (p=0.005) and there was an excess of heterozygotes for miRNA17 rs4284505 among individuals with lower calcium levels (p=0.002), both adjusted by sex. This study provides evidence that genetic polymorphisms in ESR1 and miRNA17 are involved in determining salivary calcium and phosphorus levels.

Resumo A homeostasia entre cálcio e fósforo salivares é importante para a manutenção da saúde bucal. O objetivo deste estudo foi avaliar se polimorfismos genéticos no receptor de estrógeno alfa (ESR1), receptor de estrógeno beta (ESR2) e no microRNA17 (microRNA17) estão associados com os níveis salivares de cálcio e fósforo. Saliva de 276 crianças com 12 anos de idade foi coletada com estímulo mastigatório e os níveis de cálcio e fósforo foram determinados por Espectrofotometria de Massa. O DNA genômico foi extraído da saliva remanescente e os polimorfismos genéticos em ESR1 (rs12154178, rs1884051, rs9340799 e rs2234693), em ESR2 (rs4986938 e rs1256049) e no miRNA17 (rs4284505) foram genotipados pela reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando sondas TaqMan. As diferenças estatísticas nas distribuições alélicas e genotípicas entre "baixo" e "alto" níveis de cálcio e fósforo foram determinadas usando os testes qui-quadrado e teste exato de Fisher. As análises foram ajustadas por sexo (alfa de 5%). O polimorfismo rs9340799 em ESR1 foi o genótipo menos comum associado com altos níveis de cálcio (p=0,03). O alelo menos comum em ESR1 rs1884051 foi associado com baixos níveis de fósforo (p=0,005) e houve um excesso de heterozigotos para miRNA17 rs4284505 entre os indivíduos com baixos níveis de cálcio salivar (p=0,002), ambos ajustados pelo sexo. Este estudo fornece evidências de que polimorfismos genéticos em ESR1 e miRNA17 estão envolvidos na determinação dos níveis de cálcio e fósforo salivares.

The effect of Maras powder and smoking on the microRNA deregulation of oral mucosa

Abstract Objective This study aimed to investigate the effects of Maras powder (a type of smokeless tobacco obtained from Nicotiana rustica Linn and mixed with the ashes of wood, especially from oak, walnut or grapevine) on the microRNA (miRNA) deregulation of oral mucosa, and it compares these effects with those of smoking. Methodology Oral mucosal samples were collected from 74 patients, consisting of 16 nonusers, 26 smokers, and 32 Maras powder users. Genes associated with oral cancer were selected and 90 microRNAs targeting these genes were identified. MicroRNA were isolated and purified using the microRNA isolation kit. MicroRNA were expressed using Fluidigm RT-PCR. Results A positive correlation between the duration of Maras powder use with miR-31 expression levels, and a negative correlation between the Maras powder chewing time and miR-372 expression levels was found. In addition, there is a negative correlation between the amount of Maras powder consumed and expression levels of miR-375, miR-378a, miR-145, and miR-10b; moreover, another negative correlation is observed between the number of cigarettes consumed and the expression levels of miR-23a, miR-23b, miR-203a, miR-200b, and miR-375. However, miR-200b and miR-92a levels were downregulated significantly more in Maras powder users when compared with smokers and nonusers (p<0.05). Conclusion The results show both chewing Maras powder and smoking have an effect on deregulation of miR-200b and miR-92a expressions. This leads to the belief that assessing the expression of these two miRNAs is a promising noninvasive method of analysis, especially in mutagen exposures. Finally, large-scale and high-throughput studies may help to identify an extensive miRNA expression profile associated with tobacco use and improve the understanding of oral malignancies.

miR-9-1 gene methylation and DNMT3B (rs2424913) polymorphism may contribute to periodontitis

Abstract Genetic and epigenetic changes have been associated with periodontitis in various genes; however, little is known about genes involved in epigenetic mechanisms and in oxidative stress. Objective: This study aims to investigate the association of polymorphisms C677T in MTHFR (rs1801133) and −149C→T in DNMT3B (rs2424913), as well as the methylation profiles of MTHFR, miR-9-1, miR-9-3, SOD1, and CAT with periodontitis. The association between polymorphisms and DNA methylation profiles was also analyzed. Methodology: The population studied was composed of 100 nonsmokers of both sexes, divided into healthy and periodontitis groups. Genomic DNA was extracted from the epithelial buccal cells, which were collected through a mouthwash. Polymorphism analysis was performed through polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), while methylation-specific PCR (MSP) or combined bisulfite restriction analysis techniques were applied for methylation analysis. Results: For DNMT3B, the T allele and the TT genotype were detected more frequently in the periodontitis group, as well as the methylated profile on the miR-9-1 promoter region. There was also a tendency towards promoter region methylation on the CAT sequence of individuals with periodontal disease. Conclusion: The polymorphism −149C→T in DNMT3B (rs2424913) and the methylated profile of the miR-9-1 promoter region are associated with periodontitis.

Estudo genético e epigenético do fibroma cemento-ossificante / Genetic and epigenetic study of cemento-ossifying fibroma

Fibroma cemento-ossificante (FCO) é uma neoplasia odontogênica benigna cuja patogenia não é bem estabelecida. Para o estudo molecular do FCO realizamos sequenciamento de nova geração (SNG) em sete casos utilizando o painel Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2, que investiga 2.855 mutações em 207 amplicons de 50 genes. Uma análise dos níveis transcricionais de 44 genes pertencentes à via Wnt/ß-catenina foi realizada em seis espécimes de FCO e em seis de osso saudável. O perfil de expressão de miRNAs foi estabelecido em nove amostras de FCO e dez controles através do painel TaqMan® OpenArray® Human MicroRNA, contendo 754 miRNAs. Ferramentas de bioinformática foram usadas para definição de genes líderes, além da investigação de vias de sinalização reguladas pelo conjunto de miRNAs diferentemente expressos no FCO. O SNG revelou cinco variantes de nucleotídeo único: TP53 (rs1042522), PIK3CA (rs2230461), MET (rs33917957), KIT (rs3822214) e APC (rs33974176), mas nenhuma mutação patogênica. A análise de expressão gênica revelou quatro genes com expressão aumentada (CTNNB1, TCF7, NKD1 e WNT5A) e oito subexpressos no FCO (CTNNBIP1, FRZB, FZD6, RHOU, SFRP4, WNT10A, WNT3A e WNT4), sugerindo ativação da via de sinalização Wnt/ß-catenina. O perfil de expressão de miRNAs demonstrou onze miRNAs subexpressos (hsa-miR-95-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-200c-3p) e cinco superexpressos (hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-149-5p, hsa-miR138-5p, hsa-miR-199a-3p) no FCO. Os genes alvos de miRNAs, XIAP, EZH2, MET e TGFBR1 foram identificados como genes líderes. Enquanto nenhuma mutação oncogênica foi detectada a desregulação de genes chaves da via de sinalização Wnt/ß-catenina e de miRNAs pode estar envolvida na patogênese do FCO. Os genes XIAP, EZH2, MET e TGFBR são potenciais alvos para validação funcional.(AU)

Cemento-ossifying fibroma (COF) is an odontogenic neoplasm with an uncertain pathogenesis. We performed the next generation sequencing (NGS), using the Ion AmpliSeq™Cancer Hotspot Panel v2, which investigate 2855 mutations in 207 amplicons of 50 genes in seven COF samples. Moreover, we performed a transcriptional analysis of 44 genes of Wnt/ß-catenin pathway in six COF samples and six controls of healthy jaw bones. The miRNAs expression profile was established in nine COF cases and ten control samples using the TaqMan® OpenArray® Human MicroRNA panel containing 754 validated human miRNAs. Bioinformatics tools were used to determinate the leader genes and to investigate the signaling pathways regulated by differently expressed miRNAs in COF. NGS revealed five SNV: TP53 (rs1042522), PIK3CA (rs2230461), MET (rs33917957), KIT (rs3822214) and APC (rs33974176), but no pathogenic mutation. The expression assay revealed twelve genes of Wnt/ß-catenin pathway differentially expressed in COF compared to healthy bone, including up-regulation of CTNNB1, TCF7 , NKD1 and WNT5A, and down-regulation of CTNNBIP1, FRZB, FZD6, RHOU, SFRP4, WNT10A, WNT3A and WNT4. This gene expression profile suggests the activation of Wnt/ß-catenin signaling pathway. Expression profiling revealed eleven downregulated miRNAs (hsa-miR-95-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-223- 3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-31- 3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-200c-3p) and five up-regulated (hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-149-5p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-199a-3p) in COF. The miRNAs target genes XIAP, EZH2, MET and TGFBR1 were defined as leader genes. While no oncogenic mutation was detected in the 50 cancer genes investigated by NGS, deregulation of miRNAs and key genes associated with Wnt/ß-catenin signaling pathway appears to be relevant to the molecular pathogenesis of COF. The genes XIAP, EZH2, MET and TGFBR are potential targets for functional analysis validation.(AU)

Modulação da expressão de miRNAs na diferenciação de osteoblastos em nanosuperfícies / Modulation of miRNA expression in osteoblast differentiation in nanosurfaces

Proposição: Este estudo teve como objetivo avaliar a modulação dos miRNAs que afetam o potencial osteogênico de CTMs em diferentes topografias de superfície de discos de vidro. Material e Métodos: Células tronco mesenquimais humanas foram plaqueadas nas diferentes superfícies e comparadas após 3, 7 e 14 dias para atividade de fosfatase alcalina, expressão de genes (Osteocalcina, Osteopontina, Sialo Proteína Óssea, Osterix, Runx2, BMP2 e ALP) e expressão de miRNAs. Microscopia eletrônica de varredura das superfícies com células foram obtidas para avaliação de adesão celular. Resultados: Atividade de fosfatase alcalina nas diferentes superfícies foi significantemente maior na superfície com nanotopografia. Do mesmo modo, a expressão de genes relacionados com osteoblastos foi mais elevada na superfície nano. Com 14 dias foi observado um aumento de 3.5 e 9 vezes para os genes Runx2 e Osterix, respectivamente. O gene da BMP2 e ALP também apresentou um aumento de 4 e 7 vezes comparado ao controle. Utilizando a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) onde todos os RNAs existentes foram sequenciados, um total de 123 miRNAs com diferença de expressão foram encontrados comparando a superfície controle (dia 7) com a superfície nano (dia 14). 48 miRNAs apresentaram uma redução na expressão e 75 apresentaram um aumento de expressão. Alguns destes apresentaram marcadores para genes osteogênicos já identificados, tais como hsa-miR-135b-5p marcador para OCN, BSP, Runx2, CO15A1 e OSX, hsa-miR-122-5p marcador para OPN, hsa-miR-196a-5p marcador para BMP4, hsa-miR-26b-5p marcador para BMP2 e hsa-miR-148b-3p marcador para OPN. Conclusão: As superfícies com nanotopografia tem o potencial de melhorar a resposta de osseointegração de maneira a reduzir o tempo de osseointegração e também aumentar a produção de tecido ósseo ao redor dos implantes favorecendo assim áreas de qualidade óssea baixa. A utilização de miRNAs para alterar a resposta de diferenciação pode também ajudar a controlar o processo de osseointegração(AU)

Purpose: This study aimed to evaluate the modulation of miRNAs that affect the osteogenic potential of MSCs in different surface topographies of glass disks. Material and Methods: Human mesenchymal stem cells (hMSCs) were plated on different surfaces of glass disks and compared at 3,7 and 14 days for alkaline phosphatase (ALP) activity, expression of genes (Osteocalcin, Osteopontin, Bone Sialo Protein, Osterix, Runx2, BMP2 and ALP) and expression of miRNAs. Scanning electron microscopy of surfaces with cells were obtained to analyse the attachment of cells. Results: ALP activity on different surfaces was significantly greater in the nanotopography surface. At day 14 there was a 3.5-fold and a 9-fold increase for Runx2 and Osterix gene, respectively. BMP2 and ALP also increased by 4- and 7-fold compared to control. Using RNA sequencing technology (RNA-Seq) a total of 123 miRNAs were found differently expressed comparing control (day 7) to nano surface (day 14). 48 miRNAs were downregulated and 75 were upregulated. Some of them regulated osteogenic genes such as hsa-miR-135b-5p that targets OCN, BSP, RUNX2, CO15A1 and OSX, hsamiR-122-5p wich targets OPN, hsa-miR-196a-5p targets BMP4, hsa-miR-26b-5p that targets BMP2 and hsa-miR-148b-3p that targets OPN. Conclusion: Surfaces with nanotopography have the potential to improve osseointegration response in order to reduce the time of osseointegration and also increase the production of bone tissue around the implants improving low bone quality areas. The use of miRNAs to affect differentiation response may also help control the osseointegration process(AU)

Associação entre nível de expressão de microRNAS e aspectos hitopatológicos de displasia em leucoplasia bucal / Relationship between microRNA expression levels and histopathological features of dysplasia in oral leukoplasia

A leucoplasia bucal (LB) é a principal lesão cancerizável da boca. O diagnóstico deve ser confirmado pelos achados histológicos, para excluir qualquer outra alteração da mucosa bucal e verificar sinais de malignidade, além da gradação da displasia epitelial, microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas com função importante no processo de expressão gênica. Aumento de expressão de microRNAs (miRNAs) - miR-21, miR-345 e miR-181b - tem sido demonstrado em LB que evoluíram para o carcinoma de células escamosas de boca (CCEB). Este achado sugere um potencial valor prognóstico para os miRNAs. Com base nesses resultados, este estudo objetiva-se investigar a associação dos níveis de expressão desses 3 miRNAs com as características citológicas e histopatológicas que são usados para determinar o grau de displasia bucal...

Estudo funcional de microRNAs associados ao carcinoma epidermóide em cultura de células orais / Functional studies of microRNAs associated with oral squamous carcinoma in cell culture

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura.

O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular.

Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line.

Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.

MicroRNas: biogênese, funções e seu papel potencial na carcinogênese oral / MicroRNas: biogênesis, functions and its potential role in oral carcinogenesis

MicroRNas (miRNAs) são pequenos RNAs não codantes, conservados ao longo da evolução, capazes de regular a expressão gênica através da degradação ou repressão da tradução de moléculas-alvo de RNA mensageiro. A expressão dos miRNAs se apresenta desregulada em diversos processos patológicos, incluindo o câncer. Dependendo do contexto e do tipo celular em que são expressos, um mesmo miRNAs pode exibir atividade oncogênica ou supressora tumoral. Dessa forma, a função dos miRNAs pode, em última instância, depender do microambiente específico de determinado tipo celular, o qual pode prover diferentes repertórios de genes-alvo. Entretanto, as alterações na expressão dos miRNAs podem constituir um achado secundário ao próprio fenótipo tumoral e, dessa forma, ainda não está completamente claro se a expressão alterada dos miRNAs constitui causa ou consequência da transformação maligna. O presente estudo realiza uma revisão da literatura sobre miRNAs, enfocando aspectos relacionados à biogênese, mecanismos de ação e o papel potencial destes pequenos RNAs na carcinogênese oral.

MicroRNAs (miRNA) are small noncoding RNAs, preserved throughout evolution, able to regulate gene expression through repression of translation or degration of target molecules of messenger RNA. The expression of miRNA is deregulated in several pathological processes, including cancer. Depending on the context and the cell type they are expressed, one can view miRNAs oncogenic or tumor suppressor activity. Thus, the functon of miRNA may ultimately depend on the specific microenvironment of a particular cell type, which can provide different repertoire of target genes. However, changes in expression of miRNA may be secondary to the tumor phenotype. Thus, is not completely clear whether the altered expression of miRNAs is cause or consequence of malignant transformation. This study performs a literature review of miRNA, focusing on aspects related to biogenesis, mechanisms of action and potential role of these small RNAs in oral carcinogenesis.