RESUMO
O vírus Epstein Barr (EBV) é oncogênico e relacionado com a etiologia de inúmeras neoplasias malignas, como linfomas de Burkitt, Hodgkin(LH), não-Hodgkin (LNH), nasal de células NK, além de carcinoma nasofaríngeo, desordens linfoproliferativas, bem como outras lesões não malignas. A incidência de LNH em pacientes HIV positivos é maior em relação a indivíduos saudáveis, sendo 75% desses linfomas, EBV positivos, com alta taxa de DNA e expressão de genes virais. Além disso, aumento da carga viral em pacientes transplantados é preditivo de uma neoplasia maligna associada ao EBV. EBV é facilmente transmitido pela saliva e estudos apontam uma maior quantidade do DNA-EBV em saliva em relação ao sangue. Os métodos clássicos de diagnóstico - Imunoabsorbância (ELlSA); Imunoistoquímica; Reação de Polimerase em Cadeia (PCR); e Hibridização in situ - são realizados em laboratórios bem equipados e por profissionais qualificados, com reagentes específicos e onerosos, e tempo de análise com variação de horas ou até mesmo dias. O desenvolvimento de métodos analíticos rápidos, seguros e de baixo custo para diagnóstico e controle de doenças em humanos tem despertado grande interesse científico através dos biossensores. Simplicidade de utilização e grande sensibilidade nos resultados, diagnóstico em tempo reduzido, uso de pequenas quantidades de amostras e baixo custo, despontam como grandes vantagens para investimento em pesquisa no desenvolvimento dos biossesores, com potencial substituinte de técnicas analíticas tradicionais. Nesse trabalho foi desenvolvido um biossensor para diagnóstico do EBV, isto é, presença ou ausência, em saliva de pacientes HIV positivos. Este sistema foi formado pela imobilização de sequências oligonucleotideos modificados com grupo tiol, complementares ao gene alvo do EBV (EBV-DNA), em nanopartículas de ouro (AuNp) baseado no princípio de detecção colori métrica visual direta. O resultado positivo apresenta mudança de cor da solução do conjugado (AuNp/EBV-DNA) em contato com saliva, e o negativo não mostra mudança de cor sob as mesmas condições. Foi padronizado a partir de amostras de saliva previamente analisadas pela técnica de quantificação absoluta por PCR em Tempo Real. Apresentou linearidade de resposta entre 495.000 e 495 cópias de vírus/uL (R2=0,982), detecção limite de 0,29 cópia/uL e a sensibilidade foi de 0,022 cópias/uL em testes com saliva. Portanto, desenvolvemos um biossensor para diagnóstico do EBV em saliva, de baixo custo, sensível e específico, para ser utilizado em laboratórios, consultórios e/ou ambulatórios, sem a necessidade de equipamento e capacitação profissional para interpretação de resultados.
Epstein Barr (EBV) is an oncogenic vírus that is related to several diferent malignant neoplasms, such as, Burkitl, Hodgkin (HL) and non-Hodgkin (NHL) Iymphomas, nasal NK-cell Iymphoma, besides nasopharyngeal carcinoma, Iymphoproliferative disorders, and other non-neoplastic disorders. NHL is more incident in HIV patients than in healthy individuais, and 75% of these Iymphomas are EBV positive. Also, an increase in the viral load of transplanted patients is considered predictive of an EBV related neoplasm. EBV may be transmitled by the saliva of and infected person, and the literatures shows a higher DNA amount in this fluid than in blood. The classical diagnostic methods: immunoassay (ELlSA); immunohistochemistry; polymerase chain reaction (PCR); and "in situ" hybridization, are performed in well-equipped laboratories, by trained professionals, with specific and expensive reagents. Usually it takes hours or even days to analyze the results. The development of safe, quick and low-cost innovative methods for diagnosis and control of human diseases has challenged scientists, and biosensors are receiving a great deal of focus. Usability, sensitivity, short-term results, low sample amount and low-cost made biosensors a potential substitute for traditional analytical methods. In this work we developed a biosensor for EBV diagnosis, that is, its presence or absence, in HIV patients. The biosensor is based on the immobilization of EBV specific oligonucleotides sequences in gold nanoparticles by a thiol group. The system is based on a colorimetric detection by direct visualization. A positive result shows a change in color when the conjugate (AuNp/EBV-DNA) is in contact with an EBV infected saliva. EBV DNA copies in saliva were analyzed by absolute quantification with real time PCR. Results present linearity between 495000 and 495 copies/ul (R2=0.982), the detection limit was 0.29 copies/uL, and the sensitivity was 0.022 copies/uL. Therefore, a low-cost, sensitive and specific biosensor for salivary EBV diagnosis was developed. The system is possible to be used in laboratories, clinics, medical and dental offices, with no need of special equipment or training to understand the results.
