Identification of Proteins Associated with the Formation of Oral Biofilms

ABSTRACT Objective: To identify proteins associated with the formation of Streptococcus gordonii and Fusobacterium nucleatum biofilms. Material and Methods: Biofilms composed of two bacterial species, S. gordonii and F. nucleatum, were cultured for 1, 4, 7, and 10 days. The presence of both species was confirmed via amplification of the srtA and radD genes using real-time PCR. The concentrations of proteins associated with the biofilms and individual species were quantified using Western blotting. Results: The protein profiles of S. gordonii and F. nucleatum from individual cultures determined using one-dimensional electrophoresis revealed proteins found in S. gordonii and in F. nucleatum. Ct and reciprocal Ct values were determined for the exposed S. gordonii and F. nucleatum biofilms. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) protein was detected in biofilms and F. nucleatum, whereas HSP40 protein was present only in biofilms after 7 and 10 days of formation. Conclusion: HSP40 was detected only in the formed biofilms; thus, HSP40 is an essential proteins for adhesion.

Differences in Proteomic Profiles Between Caries Free and Caries Affected Children

Abstract Objective: To determine if there are differences in protein profiles in saliva depending if children of caries-free versus caries affected. Material and Methods: A cohort of 91 children with ages between 6 and 19 years, along clinical status of caries experience. Protein profiles in saliva were determined using electrophoresis and the calculation of the percentage of a specific band at a specific molecular weight in relationship to the total protein in that sample (% of total) using molecular weight standards. This quantification was repeated for each protein band across a range of molecular weights for each sample. Chi-square, Fisher's exact, and Student t-tests were used to compare the distributions between caries-free and caries affected children (α=0.05). Results: Histatin was more likely to be non-detectable or reduced in caries-free children (OR=7.56; 95% CI 1.62-35.13) and these children had on average one less gel band detected by the assay we used. Conclusion: We have found differences in proteins between caries affected and caries-free children, suggesting that this line of investigation holds the promise of providing new tools for caries management.

Avaliação proteômica da saliva da glândula parótida sob fluxo contínuo: um estudo exploratório / Proteomic profile of parotid saliva under continuous flux: an exploratory study

A saliva humana é um fluído, que exerce diversas funções na saúde oral e geral. A análise do proteoma das glândulas salivares em especial da glândula parótida, são importantes para a compreensão das proteínas individuais presentes na saliva humana e do seu comportamento na saúde, para desta forma entender a patogênese de certas doenças. Esse trabalho é um catálogo de todas as proteínas expressas na saliva da glândula parótida de indivíduos saudáveis em fluxo contínuo de alta intensidade (1ml/min), de baixa intensidade (0,25ml/min) e na situação de estresse. Também foram realizadas as análises quantitativas e qualitativas da saliva avaliada em pool salivar ou individualmente. As proteínas foram identificadas através de técnicas em espectrometria de massas. Os resultados mostraram uma grande variação individual e as proteínas identificadas estão envolvidas em numerosos processos celulares, desde função estrutural até atividades catalíticas/enzimáticas. Esse estudo tenta, pela primeira vez, criar um padrão ouro para a coleta salivar, possibilitando a comparação entre pesquisas para melhor compreensão da composição salivar.

Investigations of the prevalence and virulence of Candida albicans in periodontal and endodontic lesions in diabetic and normoglycemic patients

Abstract Pulpal and periodontal tissues have similar microbiota that allows cross-contamination between the pulp and periodontal tissues. Objective The aim of this study was to investigate the prevalence of isolated Candida albicans from periodontal endodontic lesions in diabetic and normoglycemic patients, and the fungi's virulence in different atmospheric conditions. Material and Methods A case-control study was conducted on 15 patients with type 2 diabetes mellitus (G1) and 15 non-diabetics (G2) with periodontal endodontic lesions. Samples of root canals and periodontal pockets were plated on CHROMagar for later identification by polymerase chain reaction (PCR) and virulence test. Results C. albicans was identified in 79.2% and 20.8% of the 60 samples collected from diabetic and normoglycemic patients, respectively. Of the 30 samples collected from periodontal pockets, 13 showed a positive culture for C. albicans, with 77% belonging to G1 and 23% to G2. Of the 11 positive samples from root canals, 82% were from G1 and 18% from G2. Production of proteinase presented a precipitation zone Pz<0.63 of 100% in G1 and 72% in G2, in redox and negative (Pz=1), under anaerobic conditions in both groups. Hydrophobicity of the strains from G1 indicated 16.4% with low, 19.3% with moderate, and 64.3% with high hydrophobicity in redox. In G2, 42.2% had low, 39.8% had moderate, 18% had high hydrophobicity in redox. In anaerobic conditions, G1 showed 15.2% with low, 12.8% with moderate, and 72% with high hydrophobicity; in G2, 33.6% had low, 28.8% had moderate, and 37.6% had high hydrophobicity. There was statistical difference in the number of positive cultures between G1 and G2 (p<0.05) with predominance in G1. There was statistical difference for all virulence factors, except hemolysis (p=0.001). Conclusions Candida albicans was isolated more frequently and had higher virulence in diabetic patients.

Human DNA extraction from whole saliva that was fresh or stored for 3, 6 or 12 months using five different protocols

Abstract Saliva when compared to blood collection has the following advantages: it requires no specialized personnel for collection, allows for remote collection by the patient, is painless, well accepted by participants, has decreased risks of disease transmission, does not clot, can be frozen before DNA extraction and possibly has a longer storage time. Objective and Material and Methods This study aimed to compare the quantity and quality of human DNA extracted from saliva that was fresh or frozen for three, six and twelve months using five different DNA extraction protocols: protocol 1 – Oragene™ commercial kit, protocol 2 – QIAamp DNA mini kit, protocol 3 – DNA extraction using ammonium acetate, protocol 4 – Instagene™ Matrix and protocol 5 – Instagene™ Matrix diluted 1:1 using proteinase K and 1% SDS. Briefly, DNA was analyzed using spectrophotometry, electrophoresis and PCR. Results Results indicated that time spent in storage typically decreased the DNA quantity with the exception of protocol 1. The purity of DNA was generally not affected by storage times for the commercial based protocols, while the purity of the DNA samples extracted by the noncommercial protocols typically decreased when the saliva was stored longer. Only protocol 1 consistently extracted unfragmented DNA samples. In general, DNA samples extracted through protocols 1, 2, 3 and 4, regardless of storage time, were amplified by human specific primers whereas protocol 5 produced almost no samples that were able to be amplified by human specific primers. Depending on the protocol used, it was possible to extract DNA in high quantities and of good quality using whole saliva, and furthermore, for the purposes of DNA extraction, saliva can be reliably stored for relatively long time periods. Conclusions In summary, a complicated picture emerges when taking into account the extracted DNA’s quantity, purity and quality; depending on a given researchers needs, one protocol’s particular strengths and costs might be the deciding factor for its employment.

Binômio mãe-bebê: saúde bucal, perfil salivar e leite materno / Mother-baby binomial: oral health, salivary profile and breast milk

A boa saúde bucal da criança é estabelecida desde o seu nascimento, e o papel da mãe é essencial para a sua obtenção. O diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças bucais direcionados para a mulher no período gestacional e pósgestacional diminui o risco da mãe ter doenças com o potencial impacto em sua respectiva criança. O objetivo desse estudo foi avaliar se há evidência científica que comprove a transmissibilidade de Streptococcus mutans da mãe para o bebê (Artigo1) e avaliar a saúde bucal, perfil salivar da mãe e do bebê e as características do leite materno (Artigo 2). Para o primeiro estudo foi realizada uma revisão sistemática da literatura nas bases PubMed, Cochrane Library e Biblioteca Virtual em Saúde e como critério de inclusão foram selecionados os artigos que tinham análises genéticas para a confirmação de cepas idênticas entre mãe e filho. Para o segundo estudo sobre a avaliação da condição bucal e dos biofluidos corpóreos foram recrutadas 47 mães e seus respectivos bebês. Os participantes foram submetidos a uma entrevista e foi coletada saliva total não estimulada e amostras de leite materno. Foi realizado exame intrabucal da mucosa da mãe e dos bebês. No exame intrabucal da mãe foi verificado se tinha presença de placa, gengivite, cálculo, sangramento à sondagem e supuração. A bolsa periodontal e o nível de inserção foram mensurados. O índice de cárie foi realizado em todos os participantes. As amostras biológicas foram analisadas por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Foram analisadas proteína total e eletroforese das amostras representativas de saliva de pares de mães e bebês. Ao final da pesquisa da literatura foram selecionados 36 estudos. Esta avaliação demonstrou que a mãe era responsável pela transmissão de Streptococcus mutans para seus filhos, principalmente quando a mãe era o cuidador principal. Os resultados do artigo 2 mostraram que a média de idade das mães foi de 27 anos. Com relação as condições bucais das mães observou-se uma média de 8,20 do índice CPO-D; 72,4 % apresentavam gengivite e 62 % tinham biofilme dental visível. O exame intra-oral dos bebês demonstrou que 4,18% apresentavam candidíase e 2,08% nódulo de Bohn. A análise de eletroforese mostrou diferenças entre a quantidade de proteínas na saliva de mães e bebês. Quanto à análise de 1H RMN das amostras de saliva, notou-se diferença entre mães e bebês em relação à intensidade de metabólitos como n-butirato, propionato, etanol, acetato, além da lactose, que dominou a saliva de bebês quando comparada com a de mães. Bebês edêndulos também apresentavam menor quantidade de ácidos orgânicos comparados aos que apresentavam dentes erupcionados. Conclui-se que as mães apresentavam baixa atividade de cárie atual, porém com relevante história pregressa de cárie, o que pode ter um impacto sobre a saúde bucal de seus respectivos filhos. Foi encontrada grande quantidade de açucares no leite materno, com destaque para a lactose. (AU)

Child`s oral health is determined from the birth and their mother play a role in this matter. The diagnosis, prevention and treatment of oral diseases targeted for women during pregnancy and post-pregnancy reduces the risk of the mother having diseases which have a potential impact on their respective children. The aim of this study was to evaluate whether there scientific evidence that proves transmission of Streptococcus mutans from mother to baby (Manuscript 1) and assess the oral health and salivary profile of the baby's mother and the characteristics of breast milk (Manuscript 2). For the first objective a systematic review of the literature in PubMed and Cochrane Library Virtual Health Library (VHL) was performed using the terms "dental caries" and "transmission. The assessment of oral health status and saliva were recruited 47 mothers and their babies. Participants underwent an interview and intraoral examination and mothers and babies were submitted to unstimulated whole saliva collection and breast milk samples were also acquired. Then intraoral examination of the mother was evaluated the presence and absence of plaque, gingivitis, calculus, bleeding on probing and suppuration. Pocket depth and attachment level was measured. Index caries was done for all participants.The biologic samples were analyzed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. Total protein was analyzed and electrophoresis of representative samples of saliva pairs of mothers and babies. For systematic review, 36 studies were selected. This review demostrated that the mother was responsible for the transmission of Streptococcus mutans to their children, especially when the mother was the primary caregiver. The article the mother average age was 27 years, 53.8% were overweight and 97.8 % belong to the group that received less than five minimal salary. Sixty four percentage of the women breastfeeding their babies and 70% babies were delivered by cesarean. Regarding oral conditions, it was observed 1.7 of decayed teeth, 16.4 missing teeth; 72.4% with gingivitis and 62 % with dental biofilm. The intraoral examination showed that babies had oral candidiasis 4.18% and 2.08% Bohn nodule. The electrophoresis analysis showed differences in the protein quantity in the saliva of mothers and babies. As for the 1H NMR analysis of saliva samples, it was noted difference between mothers and infants in relation to the intensity of metabolites such as n-butyrate, propionate, ethanol, acetate and lactose which dominated the saliva of infants compared to mothers. Babies without teeth also presented lower intensities of organic acid compared to those that had erupted teeth. It is concluded that mothers had low actual caries activity, however with important past caries history and this may have an impact on the oral hygiene of their children. (AU)

Avaliação da diluição do DNA extraído de material parafinado para amplificação em PCR / Evaluation of DNA dilution extracted of paraffin-embedded material for PCR amplification

Introdução: Alguns fatores, como a presença de substâncias inibidoras e degradação do DNA, podem contribuir para a falha na detecção de genes, através da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir de DNA extraído de material parafinado. A diluição do DNA frequentemente pode reduzir o número de inibidores e contaminantes e ainda assim conter DNA suficiente para a amplificação em PCR. Objetivo: Avaliar a influência da diluição de soluções de DNA extraído de material parafinado na amplificação por PCR do gene ß-globina humana. Material e método: Foram utilizados 30 blocos parafinados de carcinomas epidermoides de orofaringe referentes a pacientes diagnosticados e tratados no Centro de Oncologia Bucal da FOA-UNESP. A extração do DNA foi realizada com o sistema QIAamp DNA minikit (Quiagen). O DNA obtido foi quantificado e avaliado quanto à pureza por espectrofotometria. Dois grupos foram formados com diferentes quantidades de DNA, sendo que o Grupo I foi constituído pelo DNA originalmente extraído e o Grupo II com o mesmo DNA , porém diluído com adição de água ultrapura.

Foi realizada a PCR utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores para ß-globina. Resultados: No grupo I, 33,33% das amostras foram positivas para o gene ß-globina, enquanto no Grupo II, 23,33% foram positivas. Conclusão: Neste estudo, a diluição do DNA extraído de material parafinado não alterou estatisticamente a quantidade de amostras positivas por PCR para o gene ß-globina, embora os resultados obtidos sugiram que esta seja uma das formas de aumentar a eficácia do método de amplificação por PCR

Suscetibilidade genética para fluorose dentária: um estudo metabólico e proteômico com diferentes linhagens de camundongos / Genetic susceptibility for dental fluorosis: a metabolic and proteomic study with different strains of mice

A fluorose dentária é uma patologia que ocorre durante a formação dos dentes na presença de doses excessivas de fluoreto (F-). Os mecanismos pelos quais o Fprovoca a fluorose ainda são poucos conhecidos. A influência de fatores genéticos tem sido considerada na suscetibilidade/resistência do indivíduo em desenvolver a fluorose. Duas linhagens de camundongos (A/J e 129P3/J) com diferença na resistência ou suscetibilidade à fluorose dentária foram utilizadas para determinar se a suscetibilidade à fluorose pode ser explicada pela diferença no metabolismo e se há diferença no perfil protéico dos rins e urina destes animais. Para isso, um estudo metabólico foi conduzido com 18 camundongos A/J (suscetível) e 18 129P3 / J (resistente) após o desmame. Cada amostra foi dividida em 3 grupos, com diferentes concentrações de F- na água de beber (0, 10 e 50 ppm F). Uma vez que um estudo piloto revelou que os camundongos A/J ingeriam um maior volume de água quando comparado com o 129P3/J, a concentração de F- na água dada aos camundongos A/J foi ajustada semanalmente a fim de fornecer doses semelhantes de F- para ambas linhagens. Os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas (n = 2/gaiola) por 7 semanas, com livre acesso à água e dieta de baixa ingestão de F- (0,95 ppm). A ingestão e excreção de F- foram calculadas, bem como os níveis de F- no plasma, no fêmur e no rim. O grau de fluorose dentária foi avaliado usando análise de fluorescência quantitativa (QLF) e exame clínico. Os perfis proteômicos renal e urinário foram examinados utilizando 2D-PAGE e coloração com azul de Coomassie.. Os dados do estudo metabólico foram testados para diferenças significativas pela ANOVA a 2 critérios (p <0,05). As imagens dos géis e as diferenças estatísticas (ANOVA, p<0,05) foram analisadas pelo programa Image Master Platinum 7.0. Os camundongos da linhagem A/J submetidos à alta concentração de fluoreto apresentaram um grau de fluorose significativamente maior quando comparado com a...

Dental fluorosis occurs during tooth formation when excessive doses of fluoride (F) are ingested. The mechanisms that underlie the pathogenesis of dental fluorosis are not known so far. The influence of genetic factors has been considered in individual susceptibility/resistance to develop fluorosis. Two inbred mice strains (A/J and 129P3/J) have been reported to have different susceptibilities to dental fluorosis. They were used in the present study to determine if the susceptibility to dental fluorosis can be explained by alterations in F metabolism and to evaluate if there is difference in the profile of protein expression in kidney and urine of these animals. For this, a metabolic study was conducted with 18 A/J (susceptible) and 18 129P3/J (resistant) weanling mice. Each strain was divided into 3 groups, with differed according to the F concentration given in the drinking water (0, 10 and 50 ppm F). Since a pilot study showed that the A/J mice drank a higher volume of water when compared with the 129P3/J, the F concentration in the water given to the A/J mice was weekly adjusted in order to provide similar F intakes for both strains. The mice were housed in metabolic cages (n=2/cage) for 7 weeks, with free access to water and low-F diet (0.95 ppm). F intake and excretion were calculated, as well as plasma, femur and kidney F levels. The degree of dental fluorosis was assessed using QLF and clinical examination. Renal and urinary proteome profiles were examined using 2D-PAGE and coomassie brilliant blue staining. Data were tested for significant differences by 2-way repeated-measures ANOVA (p<0.05). The gels images and statistical differences (ANOVA, p <0.05) were analyzed by the Image Master Platinum 7.0 software. Significantly higher QLF scores were observed for the A/J mice submitted to 50 ppm F. The total F intake did not significantly differ between the strains. The total F excretion was significantly higher for the A/J mice, due to the higher urinary...

Triagem de mutação no éxon 3 do gene IRF6 em indivíduos com fissura labiopalatina e agenesia dentária: padronização de protocolo para seqüenciamento de DNA genômico a partir de saliva / Screening of mutation in IRF6 gene of subjects with cleft lip and palate and tooth agenesis: protocol standardization for sequencing of genomic DNA extracted from saliva

A fissura labiopalatina e a agenesia dentária são consideradas alterações do desenvolvimento embrionário. Esses fenótipos ocorrem em decorrência da interação de fatores genéticos e ambientais, caracterizando um padrão de herança multifatorial. Entre os genes candidatos a esses fenótipos destaca-se o IRF6. Para esses estudos genéticos podem ser usadas diferentes metodologias, dentre elas o seqüenciamento direto. A proposta deste estudo foi primeiramente padronizar um protocolo para seqüenciamento direto de DNA genômico a partir de saliva e então investigar mutações ou polimorfismos no éxon 3 do gene IRF6 em indivíduos com fissura de lábio e palato unilateral não-sindrômica e agenesia dentária. Fizeram parte do estudo 120 voluntários distribuídos em quatro grupos: Grupo 1 30 indivíduos com fissura e agenesia dentária; Grupo 2 - 30 indivíduos somente com fissura; Grupo 3 - 30 indivíduos somente com agenesia dentária e Grupo 4 - Controle. Para análise do éxon 3 do gene IRF6 foi coletada saliva, e a partir desse material foram testados três protocolos para extração de DNA genômico. Além disso, durante a padronização do protocolo para seqüenciamento direto foram avaliadas metodologias diferentes para outras três etapas da preparação das amostras: purificação do produto de PCR, otimização na utilização do BigDye® v3.1 Terminator na reação de seqüenciamento e purificação do produto da reação de seqüenciamento. As amostras foram seqüenciadas em Analisador Genético ABI 3130XL e os resultados analisados por meio de programas de computador específicos. Foram pesquisadas, nos eletroferogramas referentes ao éxon 3 do gene IRF6, variações nas seqüências de cada indivíduo. Os resultados mostraram que o protocolo de extração de DNA a partir de saliva utilizando InstaGeneTM Matrix associado à proteinase K e dodecil sulfato de sódio 1% foi o que apresentou melhores resultados na quantidade e qualidade do DNA extraído. Em relação à purificação do produto de PCR, o método de...

Cleft lip and palate and tooth agenesis are considered changes in embryonic development. These phenotypes occur as a result of the interaction of genetic and environmental factors, suggesting a multifactorial inheritance pattern. Among the candidate genes for these phenotypes IRF6 appears as one of the most important. Direct sequencing, among other techniques, can be used to perform such genetic studies. The aim of this study was to standardize a protocol for direct sequencing of genomic DNA extracted from whole saliva to allow further search of mutations or polymorphisms in exon 3 of IRF6 gene in individuals with nonsyndromic cleft lip and palate and tooth agenesis. Volunteers were 120 subjects divided into four groups: Group 1 - 30 individuals with tooth agenesis and cleft, Group 2 - 30 individuals with cleft only, Group 3 - 30 individuals with tooth agenesis only, and Group 4 - Control. For the analysis of the exon 3 of IRF6 gene, saliva was collected to test three protocols for the extraction of genomic DNA. Additionally, during the protocol standardization for direct sequencing, different methodologies for the other three steps of sample preparation were evaluated: purification of PCR product, optimization of the use of BigDye® v3.1 Terminator, and purification of the sequencing product. The samples were sequenced on ABI 3130XL Genetic Analyzer, and the results were analyzed using specific softwares. Heterozygous and homozygous variations in the sequences of the exon 3 of IRF6 gene of each individual were searched in the electropherograms. The results showed that the protocol for DNA extraction from saliva using InstageneTM Matrix associated with proteinase K and 1% sodium dodecyl sulfate showed the best results in the quantity and quality of the extracted DNA. As far as the purification of the PCR product, the method of choice was the purification in specific columns. BigDye® v3.1 was used with success in a volume 2 L per reaction, and the purification...

Aplicaçäo de flúor por eletroforese dessensibilizaçäo dentinária / Fluor application by iontophoresis dentine dessensitizing

Revisäo da literatura sobre a aplicaçäo de fluoretos por eletroforese, enfocando os mecanismos de açäo, transporte de íons, pesquisas histológicas e pesquisas clínicas. Os trabalhos demonstraram que a aplicaçäo de fluoretos por eletroforese é altamente eficaz e seguro no tratamento da dentina hipersensível. A corrente aplicada ao dente deve ser de no máximo um miliampere, e o eletrólito de preferência tem sido o fluoreto de sódio 1-2 por cento, ou o fluoreto estanhoso a 2 por cento, 4 por cento ou 8 por cento. Percebeu-se que o único aparelho brasileiro de que se tem conhecimento é o Eletroflúor Marcon. Este método de tratamento para a dentina hipersensível tem se mostrado bem mais eficiente que a aplicaçäo tópica de flúor ou mesmo o uso sistemático de pastas abrasivas dessensibilizadoras

Eletroforese de vasodilatadores coronarianos / Electrophoresis of coronary vasodilators

Os vasodilatadores coronarianos dinitrato de isossorbida e 1, 1, 1-tris (nitratometil) propano foram completamente separados por eletroforese unidimensional em papel (qualitativo Klabin), nos tempos de 15, 30, 60, 90 e 120 minutos, empregando-se eletrólitos de diversas concentraçöes, sob um gradiente de potencial de 12,6 v/cm