Reposicionamento de fármacos para cryptococose: avaliação experimental do cloridrato de duloxetina em Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii / Repositioning of drugs for cryptococcosis: experimental evaluation of duloxetine hydrochloride in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gatti

Infecções fúngicas como as causadas por Cryptococcus spp. são de alta mortalidade e morbidade. O reposicionamento de fármaco, ou seja, a utilização de compostos para finalidade diferente da qual esse foi desenvolvido, pode ser uma alternativa para identificar fármacos mais eficazes. Assim, este estudo tem como propósito avaliar a atividade antifúngica, in vitro e in vivo, do fármaco cloridrato de duloxetina (CD), antidepressivo pertencente a classe dos Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina e Norepinefrina frente a cepas padrões e clínicas de Cryptococcus neoformans e C. gattii. Foi utilizada a técnica de microdiluição de acordo com o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) para determinar a Concentração Inibitória Mínima (MIC), e a técnica do "tabuleiro de xadrez" para avaliar o efeito sinérgico de anfotericina B (AmB) em associação com CD. Além disso, foi avaliado o efeito de CD na quantidade do ergosterol. O efeito do CD também foi avaliado em biofilmes de C. neoformans e C. gattii, analisando a biomassa por cristal violeta, a viabilidade celular por XTT e morfologia através das imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). In vivo, a eficácia de CD foi avaliada por curvas de sobrevivência no modelo invertebrado Galleria mellonella. CD foi ativo frente a todas as cepas clínicas e padrões de C. neoformans e C. gattii, apresentando valores de CIM e CFM na faixa de 15,62 ­ 62,5 µg/mL. A combinação de CD com AmB apresentou uma combinação sinérgica, reduzindo o valor da CIM em 4 vezes tanto para CD quanto para AmB. CD não produziu redução na quantidade de ergosterol presente na membrana de C. gattii ATCC e C. neoformans ATCC. Em biofilmes, foi observada a redução da biomassa do biofilme em até 82,16% e redução de 99,6% na viabilidade celular de C. gattii. Em biofilmes de C. neoformans a redução foi de 81,13% e 99,5% respectivamente para a análise de biomassa e viabilidade. As imagens de MEV corroboraram com os achados dos ensaios realizados para análise do efeito de CD em biofilmes. Em G. mellonella aumentou a sobrevivência da larva quando utilizado na concentração de 3,125 mg/larva. Assim, os ensaios validaram a hipótese de que o cloridrato de duloxetina tem ação antifúngica e antibiofilme in vitro frente a cepas clínicas e cepas padrões de C. neoformans e C. gattii. (AU)

Fungal infections such as those caused by Cryptococcus spp. are of high mortality and morbidity. Drug repositioning, that is, the use of compounds for a purpose different from the one for which it was developed, can be an alternative to identify more effective drugs. Thus, this study aims to evaluate the antifungal activity, in vitro and in vivo, of the drug duloxetine hydrochloride (CD), an antidepressant belonging to the class of Selective Serotonin and Norepinephrine Reuptake Inhibitors against standard and clinical strains of Cryptococcus neoformans and C. gattii. The microdilution technique according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) was used to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), and the "chessboard" technique was used to evaluate the synergistic effect of amphotericin B (AmB) on association with CD. In addition, the effect of CD on the amount of ergosterol was evaluated. The effect of CD was also evaluated in C. neoformans and C. gattii biofilms, analyzing the biomass by crystal violet, cell viability by XTT and morphology through Scanning Electron Microscopy (SEM) images. In vivo, the effectiveness of CD was evaluated by survival curves in the Galleria mellonella invertebrate model. CD was active against all clinical strains and patterns of C. neoformans and C. gattii, with MIC and CFM values in the range of 15.62 ­ 62.5 µg/mL. The combination of CD with AmB showed a synergistic combination, reducing the MIC value by 4 times for both CD and AmB. CD did not produce a reduction in the amount of ergosterol present in the membrane of C. gattii ATCC and C. neoformans ATCC. In biofilms, a reduction in biofilm biomass of up to 82.16% and a 99.6% reduction in cell viability of C. gattii were observed. In C. neoformans biofilms the reduction was 81.13% and 99.5% respectively for biomass and viability analysis. The SEM images corroborated the findings of the tests carried out to analyze the effect of CD on biofilms. In G. mellonella, larval survival increased when used at a concentration of 3.125 mg/larvae. Thus, the tests validated the hypothesis that duloxetine hydrochloride has antifungal and antibiofilm action in vitro against clinical strains and standard strains of C. neoformans and C. gattii.(AU)

Efeito do cloridrato de verapamil, cloridrato de fluoxetina e paroxetina isolados e combinados com anfoteicina B contra Cryptococcus neoformans: estudo in vitro e in vivo / Effect of verapamil hydrochloride, fluoxetine hydrochloride and paroxetine alone and combined with amphotericin B against Cryptococcus neoformans: in vitro and in vivo study

Cryptococcus neoformans são leveduras que acometem principalmente indivíduos imunocomprometidos, podendo causar a meningoencefalite dependendo do estado imunológico do hospedeiro. Os tratamentos convencionais têm enfrentado grandes desafios. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos antifúngicos dos fármacos cloridrato de verapamil (CV), cloridrato de fluoxetina (CF) e cloridrato de paroxetina (CP) isolados e combinados com anfotericina B (AmB) contra C. neoformans. Foram determinados os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) de acordo com a técnica de microdiluição em caldo proposta pelo Comitê Europeu de Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST). Posteriormente, foi avaliada a atividade sinérgica dos fármacos combinados com AmB (EUCAST). Os efeitos das CIMs e das concentrações sinérgicas selecionadas foram avaliados em biofilmes, quantificando a biomassa por cristal violeta e sua viabilidade por contagem de colônias (UFC/mL). Além disso, foram analisados os efeitos dos mesmos na cápsula induzida desta levedura. Os ensaios in vivo foram realizados em Galleria mellonella avaliando a toxicidade dos compostos e a eficácia por análise de curva de sobrevivência e também o efeito em concentração de hemócitos. Os fármacos CV, CF e CP apresentaram valores de CIM de 113, 9,6 e 41µg/mL, respectivamente, e quando combinados com AmB resultaram em vinte concentrações sinérgicas, e uma concentração de cada combinação foi eleita para os ensaios seguintes. CV reduziu a biomassa do biofilme em até 38%, já CF e CP reduziram a biomassa de 22-30% quando isolados, e as combinações reduziram até 35 % da biomassa. O CP diminuiu a viabilidade do biofilme em até 25 % e quando o CF e CP foram combinados com AmB a redução chegou a 11 %. Além disso, todos os fármacos isolados e combinados reduziram o tamanho da cápsula da levedura, de 48-72 %. Em G. mellonella os fármacos não apresentaram toxicidade, eficácia ou ação na concentração de hemócitos. Assim, os fármacos avaliados apresentaram potencial antifúngico frente C. neoformans em todos os ensaios in vitro, podendo ser considerados novas alternativas para o tratamento destes patógenos(AU)

Cryptococcus neoformans are yeasts that mainly affect immunocompromised individuals, and may cause meningoencephalitis depending on the immunological state of the host. Conventional treatments have faced major challenges. Verapamil hydrochloride (CV), fluoxetine hydrochloride (CF) and paroxetine hydrochloride (CP) were isolated and combined with amphotericin B (AmB) against C. neoformans. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and minimum Fungicidal Concentration (CFM) values were determined according to the broth microdilution technique proposed by the European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Subsequently, the synergistic activity of drugs combined with AmB (EUCAST) was evaluated. The effects of MICs and selected synergistic concentrations were evaluated in biofilms, quantifying the biomass by violet crystal and its viability by colony-forming unit analysis (CFU / mL). In addition, the effects of the same in the induced capsule of this yeast were evaluated. In vivo assays were performed in Galleria mellonella evaluating the toxicity of the compounds and the efficacy by analysis of survival curve and also the effect on hemocyte concentration. The CV, CF and CP drugs had MIC values of 113, 9.6 and 41 µg / mL, respectively, and when combined with AmB resulted in twenty synergistic concentrations, and a concentration of each combination was chosen for the following trials. CV reduced biofilm biomass to 38%, while CF and CP reduced biomass to 22-30% when isolated, and combinations reduced to 35% of biomass. CP decreased biofilm viability to 25% and when CF and CP were combined with AmB the reduction reached to 11%. In addition, all drugs isolated and combined reduced the size of the yeast capsule to 48-72%. In G. mellonella the drugs did not present toxicity, efficacy or action in the concentration of hemocytes. We suggest that the liposolubility of the compounds has been a limiting factor in vivo analyzes. Thus, the evaluated drugs presented antifungal potential against C. neoformans in all in vitro assays, and could be considered new alternatives for the treatment of these pathogens(AU)

Reposicionamento de fármacos no câncer de boca: Identificação de possíveis agentes / Drug repositioning for oral cancer: Identifying candidate therapeutic agents

Objetivos: O objetivo deste estudo foi o de identificar compostos seletivamente tóxicos ao carcinoma espinocelular de boca in vitro por meio do reposicionamento de fármacos. Material e Métodos: Por meio de um escaneamento baseado na viabilidade celular de 1.280 fármacos, nós selecionamos três princípios ativos (luteolin, metixene hydrochloride e nitazoxanide) letais às células de câncer de boca SCC-25 e pouco tóxicos às células de queratinócitos cutâneos imortalizados HaCaT. Os fármacos candidatos foram investigados quanto à sua dose- e tempo-resposta bem como comparados e combinados à agentes quimioterápicos padrão por meio do ensaio por colorimetria com brometo de tiazolil azul de tetrazolio (MTT). O impacto dos fármacos na motilidade do SCC-25 e do HaCaT foi verificado pelo ensaio de migração celular e seus mecanismos de ação também foram explorados por meio da verificação dos níveis das proteínas fosforiladas pelo western blotting. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e, pelo menos, três vezes independentes. O teste t de student foi utilizado para confrontar as variáveis e nível de significância de 5% foi estabelecido para todos os testes. Resultados: O flavonoide natural luteolin exerceu citotoxicidade potente contra as células de câncer de boca in vitro, apresentando baixa toxicidade ao HaCaT e alta eficiência quando comparado a quimioterápicos como a cisplatina e o AG1478. Do ponto de vista molecular, a luteolin ativou a via de sinalização do dano do DNA e, combinada com um inibidor do Chk, apresentou efeitos potencializados. Além disso, nós demonstramos que a nitazoxanide e o metixene hydrochloride são capazes de destruir células SCC-25 porém não as HaCaT de maneira proporcional à dose e ao tempo de tratamento. As combinações entre os três fármacos hit e com a cisplatina ou o AG1478 potencializaram seus efeitos contra as células malignas. Conclusões: O presente estudo traz a luteolin, o metixene hydrochloride e a nitazoxanide como...

Objectives: Here we aimed at identifying and reposition approved drugs that could be selectively toxic towards oral squamous cell carcinoma cells. Materials and Methods: Through a cell-based drug screening of 1,280 chemical molecules, we selected 3 compounds (luteolin, metixene hydrochloride, and nitazoxanide) lethal to oral cancer SCC-25 cells, while sparing immortalized keratinocyte HaCaT cells. The drugs were then further challenged for their time- and dose-responses, as well as their comparison and combination to standard chemotherapeutic agents by colorimetric assay 1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan, Thiazolyl blue formazan (MTT). The impact on SCC-25 and HaCaT motility as well as the mode of action of the drugs was then further explored by scratching assay and western blotting, respectively. All the experiments were performed in triplicated and, at least, three independent times. Students t test was performed to verify the differences among the variables and the level of significance was set at 5%. Results: The natural flavonoid luteolin was a potent cytotoxic agent against oral cancer cells in vitro, presenting low toxicity against HaCaT cells and high efficiency as compared to standard-of-care, such as cisplatin and AG1478. From a molecular standpoint, luteolin coopted the DNA-damage pathway and could be efficiently combined with Chk pharmacological inhibitor. Moreover, we demonstrated that nitazoxanide and metixene hydrochloride kill the SCC-25 but not the HaCaT cells in a dose- and time-dependent. The combinations among the three drugs hit and with cisplatin and AG1478 improved their effect against the malignant cells. Conclusions: Luteolin, metixene hydrochloride, and nitazoxanide emerge as strong cytotoxic and/or adjuvant therapy in oral cancer, as these compounds present higher efficiency and lower toxicity against oral cancer cells in vitro than conventional chemotherapeutic agents.