RESUMO
Introduction: Amaranthus retroflexus (Redroot Pigweed) is one of the main sources of allergenic pollens in temperate areas. Polcalcin is a well-known panallergen involved in cross-reactivity between different plants. The aim of this study was the molecular cloning and expression of polcalcin, as well as evaluating its IgE-reactivity with A. retroflexus sensitive patients' sera. Methods: Allergenic extract was prepared from A. retroflexus pollen and the IgE-reactivity profile was determined by ELISA and immunoblotting using sera from twenty A. retroflexus sensitive patients. Polcalcin-coding sequence was amplified by conventional PCR method and the product was inserted into pET-21b(+) vector. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by metal affinity chromatography. The IgE-binding capability of the recombinant protein was analyzed by ELISA and immunoblotting assays, and compared with crude extract. Results: Of 20 skin prick test positive patients, 17 patients were positive in IgE-specific ELISA. Western blotting confirmed that approximately 53% of ELISA positive patients reacted with 10kDa protein in crude extract. The A. retroflexus polcalcin gene, encoding to 80 amino acid residues was cloned and expressed as a soluble protein and designated as Ama r 3. The recombinant polcalcin showed rather identical IgE-reactivity in ELISA and western blotting with 10 kDa protein in crude extract. These results were confirmed by inhibition methods, too. Conclusion: The recombinant form of A. retroflexus polcalcin (Ama r 3) could be easily produced in E. coli in a soluble form and shows rather similar IgE-reactivity with its natural counterpart
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Humanos , Masculino , Feminino , Adolescente , Adulto Jovem , Adulto , Alérgenos/imunologia , Amaranthus/imunologia , Antígenos de Plantas/imunologia , Proteínas de Ligação ao Cálcio/imunologia , Pólen/imunologia , Rinite Alérgica Sazonal/imunologia , Testes Cutâneos , Alérgenos/isolamento & purificação , Antígenos de Plantas/isolamento & purificação , Proteínas de Ligação ao Cálcio/isolamento & purificação , Clonagem Molecular , Reações Cruzadas , Escherichia coli/genética , Expressão Gênica , Imunoglobulina E/metabolismo , Extratos Vegetais , Proteínas Recombinantes/isolamento & purificaçãoRESUMO
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Humanos , Masculino , Feminino , Adolescente , Adulto Jovem , Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Idoso , Venenos de Artrópodes/efeitos adversos , Anafilaxia/imunologia , Dermatite Atópica/imunologia , Himenópteros , Clonagem Molecular , Estudos Retrospectivos , Estudos Transversais , Células-Tronco/imunologiaRESUMO
Introducción: Con el objetivo de estudiar la evolución del brote por Enterococcus faecalis ST6 genotipo vanB2 descrito en 2009-2010 en 3 hospitales de Zaragoza, se caracterizaron todos los aislados clínicos E.faecalis resistentes a vancomicina obtenidos entre 2011 y 2013 en dichos hospitales. Métodos: Caracterización molecular de los aislados y estudio de su relación clonal por electroforesis en campos pulsados. Revisión de las historias clínicas de los pacientes. Resultados: Se detectaron 79 aislados E.faecalis genotipo vanB2 de 73 pacientes de 2 de los 3 hospitales analizados, la mayoría de origen urinario. El 46,5% de los casos fueron nosocomiales. La distribución según servicios hospitalarios mostró gran variabilidad, no pudiéndose identificar una fuente de infección común. Todas las cepas fueron multirresistentes (vancomicina, eritromicina, tetraciclina, ciprofloxacino, estreptomicina, gentamicina, kanamicina) y pertenecieron al clon ST6. El 93,7% eran indistinguibles al clon del inicio del brote o subtipos estrechamente relacionados. Conclusión: El brote se mantiene constante en los 3 años posteriores a su descripción, lo que señala la necesidad de mantener un control activo que limite la emergencia y diseminación de clones resistentes a vancomicina (AU)
Introduction: In order to study the evolution of the outbreak that occurred between 2009 and 2010 in 3 hospitals in Zaragoza, all vancomycin-resistant clinical Enterococcus faecalis isolates identified between 2011 and 2013 at these hospitals were characterised. Methods: Molecular characterisation of the isolates and analysis of their clonal relationships was performed using pulsed field electrophoresis, along with a retrospective review of the patient records. Results: A total of 79 vancomycin-resistant E.faecalis isolates with genotype vanB2 of 73 patients were recovered in 2 of the 3 hospitals, most of them from urine specimens. About 46% of the cases were nosocomial. Distribution of the isolates among hospital services demonstrated high variability, making it difficult to predict a common source of infection. All the strains were multiresistant (vancomycin, erythromycin, tetracycline, ciprofloxacin, streptomycin, gentamicin, kanamycin) and belonged to lineage ST6. Seventy-four isolates (93.7%) were identical or closely related to the dominant one in the origin of the outbreak. Conclusion: The outbreak remains constant over three years after being initially described, indicating the need to implement an active control in order to limit the emergence and spread of vancomycin-resistant clones (AU)
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Humanos , Clonagem Molecular , Enterococos Resistentes à Vancomicina/genética , Infecções por Bactérias Gram-Positivas/epidemiologia , Resistência a Vancomicina/imunologia , Eletroforese em Gel de Campo Pulsado/métodos , Estudos Retrospectivos , Surtos de Doenças/estatística & dados numéricos , Testes de Sensibilidade Microbiana/estatística & dados numéricos , EspanhaRESUMO
Actualmente, el problema de la resistencia entre los bacilos gramnegativos es especialmente preocupante ya que están desarrollando resistencias a la práctica totalidad de los antibióticos, limitando las opciones terapéuticas en el tratamiento de las infecciones que producen. El proceso por el que una bacteria desarrolla un fenotipo de multirresistencia es complejo y los antibióticos actúan como agentes selectores de estas bacterias. La diseminación de cepas multirresistentes en gran medida es consecuencia de la expansión de los clones de alto riesgo que, en presencia de una elevada presión antibiótica, son capaces de seleccionarse y persistir a lo largo del tiempo (AU)
Current antimicrobial resistance in Gram negative bacilli is particularly worrisome due to development of resistance to all available antimicrobial agents. This situation dramatically limits therapeutic options. The microorganisms acquire a multiresistance phenotype as a consequence of different complex processes in which the antimicrobials acts as selective driver of resistance. Dissemination of multiresistant bacteria is driven by the expansion of the high-risk clones. These clones can be selected in the presence of antimicrobials allowing their persistence over time (AU)
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Humanos , Bactérias Gram-Negativas/patogenicidade , Infecções por Bactérias Gram-Negativas/epidemiologia , Anti-Infecciosos/uso terapêutico , Resistência a Múltiplos Medicamentos , Clonagem MolecularRESUMO
Introduction: The epidemiology of Burkholderia cepacia complex (Bcc) in cystic fibrosis (CF) is not widely known. Methods All CF patients with Bcc between 2002 and 2011 were reviewed, and a molecular analysis of isolates was performed. Results The prevalence of Bcc infection was 7.2% (18/250). Molecular analysis of 16 Bcc isolates showed 5 species (7 B. contaminans, 6 B. cepacia, 1 B. cenocepacia, 1 B. multivorans, and 1 B. stabilis) and 13 sequence types. There were no cases of cross-transmission. Conclusion A high diversity of Bcc species was found in infected CF patients (AU)
Introducción: La epidemiología de Burkholderia cepacia complex (Bcc) en fibrosis quística (FQ) no es bien conocida. Métodos: Se revisaron todos los pacientes con Bcc entre 2002-2011. Se realizó análisis molecular de los aislamientos. Resultados: La prevalencia fue de 7.2% (18/250). El análisis molecular de 16 aislamientos representativos mostró 5 especies (7 B. contaminans, 6 B. cepacia, 1 B. cenocepacia, 1 B. multivorans, and 1 B. stabilis), y13 tipos de secuencia. No hubo casos de transmisión cruzada. Conclusiones: Se encontró una alta diversidad de especies de Bcc causantes de infecciones en FQ (AU)
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Humanos , Burkholderia cepacia/genética , Infecções por Burkholderia/epidemiologia , Fibrose Cística/complicações , Clonagem Molecular/métodos , Epidemiologia Molecular/métodos , Estudos Retrospectivos , Especificidade da EspécieRESUMO
Lactic acid bacteria (LAB) species are envisioned as promising vehicles for the mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules, including the development of oral vaccines. In this study, we report on the expression of a synthetic nucleocapsid (NP) gene of influenza A virus in Lactobacillus casei. The NP gene was re-designed based on the tRNA pool and the codon usage preference of L. casei BL23. The codon-optimized NP gene was then cloned and expressed in L. casei RCEID02 under the control of a constitutive promoter, that of the lactate dehydrogenase (ldh) gene. The synthetic NP gene was further expressed in L. casei EM116 under the control of an inducible promoter, that of the structural gene of nisin (nisA) from Lactococcus lactis. Based on Western blot analysis, the specific protein band of NP, with a molecular mass of 56.0 kDa, was clearly detected in both expression systems. Thus, our study demonstrates the success of expressing a codon-optimized influenza A viral gene in L. casei. The suitability of the recombinant LAB strains for immunization purposes is currently under evaluation (AU)
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Lacticaseibacillus casei/genética , Influenzavirus A/genética , Proteínas do Nucleocapsídeo/genética , Clonagem Molecular , Expressão Gênica , Códon/genéticaRESUMO
"Regulatory T cell" is a generic name that globally covers a number of T cell subsets that can mediate suppression of cellular immunity in some in vitro and in vivo experiments. One of these subsets becomes differentiated in the thymus and is chiefly characterized by the expression of the Foxp3 transcription factor. It is postulated that these natural T reg cells recognize self peptides complexed to self MHC with moderate affinity and are thought to contribute to the preservation of self tolerance beyond negative thymic selection against high affinity anti-self T cell receptors. This is illustrated by mice and human patients devoid of these cells, who develop aggressive and extended autoimmune lymphoid infiltrates in different organs. CD4+ T cells producing anti-inflammatory cytokines also down regulate cellular immunity although they might cooperate with certain humoral responses. The rapidly progressing knowledge on the surface phenotype, and the transcriptome/proteome of these cells is offering plenty of opportunities for immune intervention. Deactivation or depletion of Treg cells might lead to increased immunity against viral chronicity or malignant diseases, whereas adoptive transfer or agonist stimulations of their function might have a role in the treatment of organ specific autoimmunity. However, abundant experimental discrepancies and uncertainties challenge and complicate this promising field for translational research
El nombre de "células T reguladoras" define a una subpoblación de células T con capacidad supresora tanto in vitro como in vivo. Parte de esa subpoblación tiene origen tímico y se caracteriza por la expresión del factor de transcripción Foxp3; estas células son conocidas como T reguladoras naturales y contribuyen a preservar la tolerancia a lo propio. Se ha descrito que dichas células reconocen péptidos propios con afinidad intermedia tras un proceso de selección negativa en el timo donde previamente se habrían eliminado los clones de células T con alta afinidad por péptidos propios. Tanto en el hombre como en modelos animales, la ausencia de esta población de células T se traduce en fenómenos agresivos de autoinmunidad con un importante infiltrado linfocitario en diferentes órganos. Las células T CD4+ producen citocinas anti-inflamatorias que también colaboran en la supresión de la inmunidad celular. Los últimos hallazgos sobre el fenotipo de las células T reguladoras, así como en su genoma, están haciendo posible el desarrollo de múltiples estrategias para la inmunoterapia. La inactivación o depleción de las Treg podría aumentar la respuesta inmune frente a enfermedades virales crónicas, mientras que la transferencia adoptiva o la estimulación de estas células mediante agonistas sería de gran ayuda para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, la existencia de ciertas discrepancias en los modelos experimentales, hace que aún queden puntos por resolver antes de iniciar la inmunoterapia en clínica
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Humanos , Linfócitos T/fisiologia , Imunoterapia/métodos , Neoplasias/terapia , Fatores de Transcrição/análise , Clonagem Molecular , Autoimunidade/imunologia , Neoplasias/imunologiaRESUMO
The structural genes for the nickel and cobalt resistance of the conjugative plasmid pEJH 501 of Hafnia alvei 5-5, contained on a SalI-EcoRI fragment of 4.8 kb, were cloned and sequenced. The DNA sequence included five genes in the following order: ncrA, ncrB, ncrC, ncrY, and ncrX. The predicted amino acid sequences of ncrA were homologous to the amino acid sequences of nreB of Achromobacter xylosoxidans 31A. Expression of ncr with the T7 RNA polymerase-promoter system allowed Escherichia coli BL21 (DE3) to overexpress NcrA, NcrB, and NcrC but not NcrY, and NcrX. The apparent molecular masses of NcrA, NcrB, and NcrC were 30, 33, and 17 kDa, respectively. Primer-extension analysis showed that ncr mRNA started at nucleotide position 23 upstream from ncrA. The promoter region of the ncr operon possessed a strong, putative -35 element of sigma(32)-type promoter sequence, and transcriptional 'lacZ fusion studies indicated that the -35 element influenced sigma(32)-specific transcription (AU)
Los genes estructurales de la resistencia a níquel y cobalto del plásmido conjugativo pEJH 501 de Hafnia alvei 5-5, contenido en un fragmento SalI-EcoRI de 4,8 kb, fueron clonados y secuenciados. La secuencia de DNA incluye cinco genes en el siguiente orden: ncrA, ncrB, ncrC, ncrY, y ncrX. Las secuencias de aminoácidos equivalentes a ncrA fueron homólogas a las secuencias de aminoácidos codificadas por nreB en Achromobacter xylosoxidans 31A. La expresión de los genes ncr mediante el sistema promotor de la RNA polimerasa T7 permite a Escherichia coli BL21 (DE3) sobreexpresar NcrA, NcrB, y NcrC, pero no NcrY ni NcrX. Los pesos moleculares aparentes de NcrA, NcrB y NcrC fueron 30, 33, y 17 kDa, respectivamente. El análisis de extensión de los cebadores mostró que el mRNA de ncr se iniciaba a una distancia de 23 nucleótidos corriente arriba del ncrA.La región promotora del operón ncr posee una fuerte secuencia promotora de tipo sigma32 en la posición -35, y estudios transcripcionales de fusión con ´lacZ indicaron que el elemento situado en -35 influye sobre la transcripción específica de sigma32 (AU)
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Primers do DNA , Cobalto/farmacologia , DNA Bacteriano , Farmacorresistência Bacteriana , Hafnia/genética , Dados de Sequência Molecular , Níquel/farmacologia , Clonagem Molecular , Sequência de Bases , Transcrição Gênica , Genótipo , Óperon/genética , Plasmídeos/genética , Mapeamento por RestriçãoRESUMO
Hafnia alvei 5-5, isolated from a soil-litter mixture underneath the canopy of the nickel-hyperaccumulating tree Sebertia acuminata (Sapotaceae) in New Caledonia, was found to be resistant to 30 mM Ni(2+) or 2 mM Co(2+). The 70-kb plasmid, pEJH 501, was transferred by conjugation to Escherichia coli, Serratia marcescens, and Klebsiella oxytoca. Transconjugant strains expressed inducible nickel resistance to between 5 and 17 mM Ni(2+), and cobalt resistance to 2 mM Co(2+). A 4.8-kb Sal- EcoRI fragment containing the nickel resistance determinant was subcloned, and the hybrid plasmid was found to confer a moderate level of resistance to nickel (7 mM Ni(2+)) even to E. coli. The expression of nickel resistance was inducible by exposure to nickel chloride at a concentration as low as 0.5 mM Ni(2+). By random Tn phoA'-1 insertion mutagenesis, the fragment was shown to have structural genes as well as regulatory regions for nickel resistance. Southern hybridization studies showed that the nickel-resistance determinant from pEJH501 of H. alvei 5-5 was homologous to that of pTOM9 from Alcaligenes xylosoxydans 31A (AU)
Hafnia alvei 5-5, aislada en un vertedero bajo la copa del árbol hiperacumulante de níquel Sebertia acuminata (Sapoteacea) en Nueva Caledonia, resultó ser resistente a 30 mM Ni2+ y 2 mM Co2+. El plásmido de 70 kilopares de bases (kb), pEJH501 se transfirió por conjugación a Escherichia coli, Serratia marcescens y Klebsiella oxytoca. Las cepas transconjugantes expresaron resistencia inducible a entre 5 y 17 mM Ni2+, y a 2 mM Co2+. Se subclonó un fragmento Sal-EcoRI que contenía el determinante de resistencia al níquel, y el plásmido híbrido se descubrió que confería un nivel de resistencia moderado al níquel (7 mM Ni2+), incluso en E. coli. La expresión de la resistencia al níquel era inducible por exposición a concentraciones de cloruro de níquel de como mínimo 0,5 mM Ni2+. Mediante mutagénesis por inserción aleatoria de TnphoA'-1, se encontraron en el fragmento tanto genes estructurales como regiones reguladoras para la resistencia al níquel. Estudios de hibridación southern mostraron que el determinante de la resistencia al níquel del plásmido pEJH501 en H. alvei 5-5 era homólogo al de pTOM9 de Alcaligenes xylosoxydans 31A (AU)
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Plasmídeos/genética , Hafnia alvei/genética , Farmacorresistência Bacteriana/genética , Níquel/farmacologia , Testes de Sensibilidade Microbiana , Sondas de DNA , Conjugação Genética , Clonagem Molecular , Bactérias/classificação , Mutação , Modelos Genéticos , Homologia de Sequência do Ácido NucleicoRESUMO
Introducción: Establecer la diferencia entre poblaciones linfocitarias monoclonales y reactivas puede ser de gran ayuda en el diagnóstico del linfoma cerebral primario (LCP), especialmente en pequeñas muestras obtenidas por biopsia estereotáxica. El objetivo de este estudio ha sido evaluar la frecuencia de reordenamientos clonales del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IgH) en el LCP. Métodos: Se han estudiado 24 LCP, 16 en pacientes inmunocompetentes y 8 asociados a SIDA. Mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se analizó el gen IgH utilizando ADN extraído de tejido fijado en formol e incluido en parafina. Para ello se amplificaron las regiones CDR II y CDR III de dicho gen mediante cebadores consenso para las regiones VH (Fr2 y Fr3, respectivamente) y JH (LJH y VLJH). Resultados: El análisis molecular confirmó la existencia de clones de células B en un importante numero de casos de LCP. Al usar ambas combinaciones de cebadores (Fr2 y Fr3) se detectaron reordenamientos clonales del gen IgH en 19 de los 24 casos (79%), observándose en 5 de éstos un patrón biclonal debido a la presencia de dos bandas discretas con Fr3. La frecuencia de detección de clonalidad fue similar en los dos grupos de pacientes. Conclusiones: Nuestras observaciones apoyan que el estudio de la clonalidad del gen IgH mediante PCR en biopsias incluidas en parafina es de utilidad en el diagnóstico del LCP (AU)
Introduction: To determine differences between monoclonal and reactive lymphoid populations may be a great help in the diagnosis of primary brain lymphoma (PBL). The aim of this study was to evaluate the frequency of clonal immunoglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangements in PBL. Methods: Twenty-four PBL were studied, 16 of them from immunocompetent patients and another 8 from AIDS patients. DNA was extracted from formalin-fixed, paraffin- embedded tissue. IgH gene rearrangements were analyzed using the polymerase chain reaction method (PCR) by amplifying CDRII and CDRIII regions using consensus primers directed to framework regions VH (Fr2 and Fr3 respectively) and JH (LJH and VLJH). Results: Molecular analysis confirmed the existence of B-cell clones in an important number of cases of PBL. Using both primer combinations (Fr2 and Fr3) we detected clonal IgH gene rearrangements in 19 of the 24 cases (79%), and 5 of these cases showed a biclonal pattern due to the presence of two discrete bands with Fr3. The frequency of detection of clonality was similar in both groups of patients. Conclusions: Our data confirm that PCR analysis of IgH rearrangements in paraffin-embedded biopsies is useful in the diagnosis of PBL (AU)
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Humanos , Linfoma/patologia , Neoplasias Encefálicas/patologia , Rearranjo Gênico , Clonagem Molecular , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , Infecções por HIV/complicaçõesRESUMO
La tecnología del ADN recombinante, popularmente llamada ingeniería genética, tiene numerosas aplicaciones, que han fascinado y alarmado al público. Desde mediados de la década de los 70, los beneficios de esta tecnología superan, por lo general, a los riesgos. Estos beneficios, plasmados en un aumento del conocimiento y en la mejora de los productos de diagnóstico y terapéuticos, han tenido un amplio impacto no sólo en el laboratorio, sino también en la vida diaria. El desarrollo de la ciencia y las nuevas direcciones científicas en la biología dictan la necesidad de que los científicos tengan una avanzada concepción filosófica del mundo para valorar acertadamente los resultados y perspectivas de cualquier ciencia biológica, incluso los de la ingeniería genética; es muy importante que tenga el enfoque biosocial. Se debe luchar irreconciliablemente contra las ideas pseudocientíficas y los intentos de utilizar los recientes adelantos de la biología con fines reaccionarios, antihumanos (AU)
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Masculino , Feminino , Humanos , Neurologia , Temas Bioéticos , Agendamento de Consultas , Assistência Ambulatorial , Espanha , Bancos de Esperma , Doenças do Sistema Nervoso , Aceitação pelo Paciente de Cuidados de Saúde , Estudos Retrospectivos , Melhoramento Genético , Clonagem Molecular , DNA Recombinante , Engenharia Genética , Acesso aos Serviços de SaúdeRESUMO
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