Frequency of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) in non-clinical Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium strains / Frequência das repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPRs) em cepas não-clínicas de Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium

Abstract The fidelity of the genomes is defended by mechanism known as Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) systems. Three Type II CRISPR systems (CRISPR1- cas, CRISPR2 and CRISPR3-cas) have been identified in enterococci isolates from clinical and environmental samples. The aim of this study was to observe the distribution of CRISPR1-cas, CRISPR2 and CRISPR3-cas in non-clinical strains of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates from food and fecal samples, including wild marine animals. The presence of CRISPRs was evaluated by PCR in 120 enterococci strains, 67 E. faecalis and 53 E. faecium. It is the first report of the presence of the CRISPRs system in E. faecalis and E. faecium strains isolated from wild marine animal fecal samples. The results showed that in non-clinical strains, the CRISPRs were more frequently detected in E. faecalis than in E. faecium. And the frequencies of CRISPR1-cas and CRISPR2 were higher (60%) in E. faecalis strains isolated from animal feces, compared to food samples. Both strains showed low frequencies of CRISPR3-cas (8.95% and 1.88%). In conclusion, the differences in the habitats of enterococcal species may be related with the results observe in distribution of CRISPRs systems.

Resumo A fidelidade dos genomas ​​é defendida por mecanismos conhecidos como sistemas de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPRs). Três tipos de sistemas CRISPR II (CRISPR1-cas, CRISPR2 e CRISPR3-cas) têm sido identificados em cepas de enterococos isolados de amostras clínicas e ambientais. O objetivo deste estudo foi observar a distribuição dos CRISPR1-cas, CRISPR2 e CRISPR3-cas em cepas não-clínicas de Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium isoladas de amostras alimentícias e fecais, incluindo animais marinhos selvagens. A presenca dos CRISPRs foi determinada por PCR em 120 cepas de enterococos, sendo 67 E. faecalis e 53 E. faecium. É o primeiro relato da presença do sistema CRISPRs nas estirpes E. faecalis e E. faecium isoladas de amostras fecais de animais marinhos selvagens. Os resultados mostraram que em cepas não-clínicas, os CRISPRs foram mais frequentemente detectados em E. faecalis do que em E. faecium. E as frequências de CRISPR1-cas e CRISPR2 foram maiores (60%) em cepas de E. faecalis isoladas de fezes de animais, quando comparadas à amostras de alimentos. Ambas as cepas apresentaram baixas freqüências de CRISPR3-cas (8,95% e 1,88%). Em conclusão, as diferenças nos habitats das espécies de enterococos podem estar relacionadas com os resultados observados na distribuição dos sistemas CRISPRs.

Fatal pulmonary parafilaroidiasis in a free-ranging subantarctic fur seal (Arctocephalus tropicalis) coinfected with two gammaherpesviruses and Sarcocystis sp / Parafilaroidose pulmonar fatal em um lobo-marinho-subantártico (Arctocephalus tropicalis) de vida livre coinfectado com dois gammaherpesvírus e Sarcocystis sp

Abstract A juvenile subantarctic fur seal (Arctocephalus tropicalis) found dead in Santa Catarina state, southern Brazil, presented with disseminated verminous pneumonia due to Parafilaroides sp. A concomitant infection with two different gammaherpesviruses was identified by PCR in different tissues; one of them possibly a novel species (tentatively named Otariid herpesvirus 7). Sarcocystis sp. DNA was identified molecularly in skeletal muscle samples with intrasarcoplasmic bradyzoites and no apparent tissue response. All analyzed samples (mandibular, laryngeal, tracheal, and mesenteric lymph nodes, and lung) were PCR-negative for Brucella spp. The most likely cause of death was severe pulmonary parafilaroidiasis. The pathogenic role of the gammaherpesviruses in several of the tissues was not evident. This study describes the pathogenicity of Parafilaroides sp. in a subantarctic fur seal, widens the host range of herpesvirus in pinnipeds, and reports the first molecular identification of Sarcocystis sp. in this species.

Resumo Um lobo-marinho-subantártico (Arctocephalus tropicalis) juvenil foi achado morto no Estado de Santa Catarina, sul do Brasil, apresentando pneumonia parasitária disseminada por Parafilaroides sp. Infecção concomitante por dois gammaherpesvírus diferentes foi identificada pela PCR em diversos tecidos, um desses herpesvírus possivelmente uma nova espécie (denominada provisoriamente Otariid herpesvirus 7). DNA de Sarcocystis sp. foi identificado molecularmente em amostras de músculo esquelético que apresentavam bradizoítos intra-sarcoplasmáticos sem aparente resposta tecidual. Todas as amostras analisadas (linfonodo mandibular, laríngeo, traqueal e mesentérico, e pulmão) pela PCR para Brucella spp. foram negativas. A causa mais provável da morte do animal foi parafilaroidose pulmonar severa. O papel patogénico dos gammaherpesvírus em vários tecidos não foi evidente. Este estudo descreve a patogenicidade de Parafilaroides sp. em um lobo-marinho-subantártico, amplia a variedade de hospedeiros de herpesvírus em pinípedes e reporta a primeira identificação molecular de Sarcocystis sp. para essa espécie.

Anomalous colour in Neotropical mammals: a review with new records for Didelphis sp. (Didelphidae, Didelphimorphia) and Arctocephalus australis (Otariidae, Carnivora) / Coloração anômala em mamíferos Neotropicais: uma revisão com novos registros para Didelphis sp. (Didelphidae, Didelphimorphia) e Arctocephalus australis (Otariidae, Carnivora)

Anomalous colourations occur in many tropical vertebrates. However, they are considered rare in wild populations, with very few records for the majority of animal taxa. We report two new cases of anomalous colouration in mammals. Additionally, we compiled all published cases about anomalous pigmentation registered in Neotropical mammals, throughout a comprehensive review of peer reviewed articles between 1950 and 2010. Every record was classified as albinism, leucism, piebaldism or eventually as undetermined pigmentation. As results, we report the new record of a leucistic specimen of opossum (Didelphis sp.) in southern Brazil, as well as a specimen of South American fur seal (Arctocephalus australis) with piebaldism in Uruguay. We also found 31 scientific articles resulting in 23 records of albinism, 12 of leucism, 71 of piebaldism and 92 records classified as undetermined pigmentation. Anomalous colouration is apparently rare in small terrestrial mammals, but it is much more common in cetaceans and michrochiropterans. Out of these 198 records, 149 occurred in cetaceans and 30 in bats. The results related to cetaceans suggest that males and females with anomolous pigmentation are reproductively successful and as a consequence their frequencies are becoming higher in natural populations. In bats, this result can be related to the fact these animals orient themselves primarily through echolocation, and their refuges provide protection against light and predation. It is possible that anomalous colouration occurs more frequently in other Neotropical mammal orders, which were not formally reported. Therefore, we encourage researchers to publish these events in order to better understand this phenomenon that has a significant influence on animal survival.

Colorações anômalas ocorrem em muitos vertebrados tropicais. Entretanto, estas são consideradas raras em populações selvagens, havendo poucos registros para a maioria dos táxons. Reportam-se, neste estudo, dois novos casos de coloração anômala em mamíferos. Além disso, por meio de uma extensa revisão bibliográfica, foram compilados os casos publicados sobre coloração anômala em mamíferos neotropicais entre 1950 e 2010. Cada registro foi classificado como albinismo, leucismo, piebaldismo ou, eventualmente, como coloração indeterminada. Como resultados, reportou-se o registro de um espécime leucístico de gambá (Didelphis sp.) no sul do Brasil e de um espécime de lobo-marinho sul-americano (Arctocephalus australis) com piebaldismo no norte do Uruguai. Também foram analisados 31 artigos científicos, resultando em 23 registros de albinismo, 12 de leucismo, 71 de piebaldismo e 92 registros classificados como de pigmentação indeterminada. A coloração anômala aparentemente é rara em pequenos mamíferos terrestres, mas é muito mais comum em cetáceos e microquirópteros. Dos 198 registros encontrados, 149 ocorreram em cetáceos e 30 em morcegos. No caso dos cetáceos, este resultado sugere que machos e fêmeas com este padrão anômalo de pigmentação são reprodutivamente exitosos e, consequentemente, sua frequência está aumentando nas populações naturais. Com relação aos morcegos, este fenômeno pode estar relacionado ao fato de estes animais orientarem-se primariamente por meio de ecolocalização e seus refúgios oferecerem proteção contra luz e predação. É possível que a coloração anômala ocorra mais frequentemente em outras ordens de mamíferos neotropicais, as quais não foram formalmente reportadas. Desta forma, mostra-se importante encorajar os pesquisadores a publicar estes eventos em vida selvagem para um melhor entendimento deste fenômeno, que tem influência significativa na sobrevivência destes organismos.

Campylobacter insulaenigrae: first isolation report from South American sea lion (Otaria flavescens, (Shaw, 1800)

Campylobacter insulaenigrae have been isolated from different pinnipeds but not from South American sea lion (Otaria flavescens). The aim of this work is to report the first isolation of C. insulaenigrae from South American sea lion (Otaria flavescens). The isolate, identified by its phenotypic and molecular characteristics, allow recognizing O. flavescens as a new host for C. insulaenigrae.

Clareamento da melanina na epiderme do lobo-marinho-sul-americano e sua aplicação na imunohistoquímica enzimática / Bleaching of melanin in the epidermis of south American fur seal and its application on enzyme immunohistochemistry

O Lobo-marinho-sul-americano (Arctocephalus australis) é um mamífero marinho anfíbio distribuído ao longo da Costa do Atlântico e do Pacífico da América do Sul. Esta espécie está bem adaptada a diferentes habitats devido à morfologia dos membros em forma de nadadeira e de seu sistema tegumentar. Estudos imuno-histoquímicos são importantes para avaliar os mecanismos de adaptação da pele devido a diferencial expressão dos antígenos presentes no tecido dependendo da região da superfície corporal. Entretanto, sua epiderme altamente pigmentada (melanina) impede a visualização dos marcadores cromógenos utilizados na imunohistoquímica. Neste trabalho foi desenvolvido um método de clarear a melanina para permitir a visualização dos cromógenos sem alterar a afinidade antígeno-anticorpo para a imuno-histoquímica. A análise do índice do PCNA (proliferating cell nuclear antigen) na epiderme de A. australis, com diaminobenzidina (DAB) como cromógeno foi usada para testar o método. O clareamento da melanina permitiu obter o índice de proliferação celular na epiderme e evitar resultados falso-positivos sem afetar os resultados imuno-histoquímicos.

The South American fur seal (Arctocephalus australis) is an amphibious marine mammal distributed along the Atlantic and Pacific coasts of South America. The species is well adjusted to different habitats due to the morphology of its fin-like members and due to some adaptations in their integumentary system. Immunohistochemical studies are very important to evaluate the mechanisms of skin adaptation due the differential expression of the antigens present in the tissue depending of the region of the body surface. However, its strongly pigmented (melanin) epidermis prevents the visualization of the immunohistochemical chromogens markers. In this study a melanin bleaching method was developed aimed to allow the visualization of the chromogens without interfering in the antigen-antibody affinity for immunohistochemistry. The analysis of PCNA (proliferating cell nuclear antigen) index in the epidermis of A. australis by immunohistochemistry with diaminobenzidine (DAB) as chromogen was used to test the method. The bleaching of the melanin allowed to obtain the cell proliferation index in epidermis and to avoid false positive results without affecting the immunohistochemical results.

Formação do plexo braquial e sistematização dos territórios nervosos em membros torácicos de lobos marinhos / Arctocephalus australis Brachial plexus formation and the nervous territories on thoracic limb of Arctocephalus australis

Para a realização do estudo acerca do plexo braquial (PB) e dos territórios nervosos do membro torácico de lobosmarinhos (Arctocephalus australis) foram utilizados dois animais. A pele foi retirada e procedeu-se a identificação da musculatura do membro torácico e região peitoral. Em seguida foram aplicadas compressas de solução de ácido acético glacial 3% na musculatura, com o intuito de facilitar a dissecação realizada macroscopicamente. Nos espécimes analisados notou-se a emergência do plexo braquial a partir do sexto nervo cervical até o primeiro nervo torácico. Destas quatro raízes se formam os troncos de nervos de mesmo número, cujos ramos ventrais constituirão seu arranjo e distribuição territorial. Destes quatro troncos surgem os 12 nervos componentes do PB, sendo encontrados nervos que se formam a partir de apenas um segmento (supra-escapular, peitoral cranial, torácico lateral, toracodorsal e torácico longo) e também nervos que surgem a partir de mais de um segmento, sendo assim denominados plurissegmentares (subescapular, músculo-cutâneo, axilar, mediano, peitoral caudal, ulnar e radial). Nesse sentido, foi observada uma constância na inervação da musculatura, articulações e ossos do membro torácico, de onde podemos assim inferir que existe um padrão claramente definido na delimitação dos territórios nervosos.

For the study concerning the brachial plexus (BP) and the nervous territories of the thoracic limb of South American Fur Seal (Arctocephalus australis), two animals had been used. Their skin was removed and the musculature of the thoracic limb and pectoral region was identified. After that compresses of glacial acetic acid solution of 3% had been applied in the musculature, in order to facilitate the carried through dissection. In analyzed specimens it was observed the emergency of BP from the sixth cervical nerve until the first thoracic nerve. From these four roots trunks of nerves of the same number are formed, whose ventral branches will constitute its arrangement and territorial distribution. From these four trunks emerge the 12 component nerves of the BP, some of them come from only one segment (supra scapular, cranial pectoral, lateral thoracic, thoraco-dorsal and long thoracic), while others come from more than a segment (sub scapular, muscle-cutaneous, axillary, median, caudal pectoral, ulnar and radial). In this direction,this observed constancy in the innervation of the musculature, joints and bones of the thoracic limb, led us to infer that a definite pattern in the delimitation of the nervous territories clearly exists.

Sistematização e distribuição da inervação lombar e sacral em Arctocephalus australis / The lumbar and sacral innervation of the Arctocephalus australis: sistematization and distribution

Objetivando descrever a inervação originada a partir dos ramos ventrais lombares e sacrais, fez-se um estudo, mediante a dissecação de dois exemplares de lobos-marinhos (Arctocephalus australis), oriundos do CRAM-FURG, onde chegaram em óbito. As estruturas nervosas constituintes dos plexos lombar e sacral possuem origem dos ramos ventrais dos nervos espinhais que formam-se dos segmentos medulares L1 a S3. Assim, pode-se observar que, os formados dos segmentos L1 a L3 são unissegmentares, sendo respectivamente os nervos Ílio-hipogástrico e Ílio-inguinal e Cutâneo Femoral Lateral. Da união dos segmentos L3-L4 surgem os nervos Genito-femoral, Obturatório e Femoral. Da confluência dos segmentos L4-5-S1 forma-se um tronco nervoso, o plexo isquiático, que emite os nervos: Glúteos Cranial e Caudal, Cutâneo Femoral Caudal e Isquiático. O nervo Isquiático ramifica-se em Cutâneos Surais Lateral e Caudal, Tibial, Fibular Comum. O nervo Pudendo (divide-se nos nervos dorsal do pênis ou clitóris e perineais superficial e profundo) e Retal Caudal têm origem dos segmentos S2-3. Com base nestes dados podemos inferir que a inervação lombar e sacral têm origem similar a outras espécies de mamíferos, contudo sua organização e distribuição refletem as modificações adaptativas aos hábitos destes animais, principalmente a locomoção em meio aquático.

In order to describe the innervation originated from ventral lumbar and sacral branches, a study was made through dissection of two specimens of south american fur seals (Arctocephalus australis), originated from CRAM-FURG, where they arrived deceased. The nervous structures that constitute the lumbar and sacral plexes are originated from ventral branches of spinal nerves which come from medullary segments L1 to S3. Thus, one can observe that the nerves originated form L1 to L3 are monosegmentary, being respectively iliohypogastric, ilioinguinal and lateral femoral cutaneous nerves. From the reunion of L3 and L4 segments arise genitofemoral, obturator and femoral nerves. From the confluence of segments L4-5-S1 arises a nervous trunk – the sciatic plexus, which gives the following nerves: cranial and caudal gluteal, caudal femoral cutaneous and sciatic. Sciatic nerve splits into lateral and caudal sural cutaneous, tibial, common peroneal. Pudendal nerve (which divides into dorsal nerve of the penis or clitoris, deep and superficial perineal) and caudal rectal are formed from the S2-3 segments. With these data, one can conclude that the lumbar and sacral innervation have similar origin to other mammal species, however its organization and distribution reflect the adaptative changes to this animals’ habits, specially its locomotionin water.

In vitro susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex strains isolated from seals to antituberculosis drugs

Mycobacteria strains belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex were isolated from seals found in the South Atlantic. The animals were received in Mundo Marino installations and treated for Mycobacterium tuberculosis complex by conventional therapy of intensive care and enriched food supply; however, in all cases treatment failed. Necropsies of all animals revealed extensive lesions compatible with tuberculosis involving lungs, liver, spleen and lymphatic nodes. Classical biochemical methods as well as molecular techniques using the IS 6110 probes were performed for mycobacterial identification. Furthermore, the LCx M. tuberculosis assay (Abbott Laboratories) identified all strains as Mycobacterium tuberculosis complex members. The in vitro susceptibility pattern was examined in mycobacterial strains isolated from seven seals and in 3 reference strains - BCG, H37Rv ( M. tuberculosis) and AN5 ( Mycobacterium bovis) - to 4 medications - isoniazid, rifampin, streptomycin and ethambutol. Minimal inhibitory drug concentrations were determined by the Mycobacterial Growth Indicator Tube (BD Argentina) method and a microdilution and colorimetric assay using 3-(4-5 dimethyltiazol-2)-2,5 diphenyltetrazolium bromide. All the isolates and the reference strains BCG and AN5 were inhibited by MIC values similar to those of H37Rv with good agreement obtained by both techniques. These findings suggest that a therapeutic regimen aimed to seals diagnosed with tuberculosis play an important role in the prevention of tuberculosis transmission from infected animals to humans that are in routine contact with them.

Susceptibilidad in vitro a los medicamentos anti-tuberculosos de aislados de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis obtenidos a partir de lobos marinos Se han hallado cepas de micobacterias aisladas de lobos marinos del Atlántico sur y pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis. Los animales se recibieron en las instalaciones del Oceanario Mundo Marino y fueron tratados apropiadamente para su recuperación con la terapia convencional, cuidados intensivos y suplemento alimentario pero no se observó mejoría en su estado general. Se practicaron necropsias en todos los animales y se observaron lesiones extensas compatibles con tuberculosis en pulmones, hígado, bazo y ganglios linfáticos. Para la identificación de las micobacterias, se realizaron pruebas bioquímicas y técnicas de biología molecular con la sonda IS 6110. Además, se identificaron todas las cepas como pertenecientes al complejo M. tuberculosis mediante el equipo LCx M. tuberculosis Assay (Abbott Laboratories). El objetivo de este estudio fue determinar in vitro la sensibilidad de las cepas patrón BCG, H37Rv ( M. tuberculosis) y AN5 ( Mycobacterium bovis) y la de las siete aisladas de lobos marinos a isoniacida, rifampicina, estreptomicina y etambutol. La concentración inhibitoria mínima (CIM) de las drogas antituberculosas se llevó a cabo con el equipo Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT, BD, Argentina) y la microdilución con el ensayo colorimétrico con bromuro de 3-(4-5 dimetiltiazol-2)-2,5 difeniltetrazolio. Todos los aislamientos y las cepas de referencia BCG y AN5 se inhibieron con valores CIM de los de H37Rv con buena concordancia entre los resultados obtenidos con ambas técnicas. Los hallazgos permiten sugerir que podrían ser una importante ayuda terapéutica en los lobos marinos con diagnóstico de tuberculosis y evaluar el posible papel sanitario en la prevención y transmisión de la tuberculosis de los animales a los humanos y el trabajo en conjunto.