Antileishmanial activity and immunomodulatory effect of secosubamolide, a butanolide isolated from Nectandra oppositifolia (Lauraceae)

Visceral leishmaniasis is a complex neglected tropical disease caused by Leishmania donovani complex. Its current treatment reveals strong limitations, especially high toxicity. In this context, natural products are important sources of new drug alternatives for VL therapy. Therefore, the antileishmanial and immunomodulatory activity of compounds isolated from Nectandra oppositifolia (Lauraceae) was investigated herein. Methods: The n-hexane extract from twigs of N. oppositifolia were subjected to HPLC/HRESIMS and bioactivity-guided fractionation to afford compounds 1 and 2 which were evaluated in vitro against Leishmania (L.) infantum chagasi and NCTC cells. Results: The n-hexane extract displayed activity against L. (L.) infantum chagasi and afforded isolinderanolide E (1) and secosubamolide A (2), which were effective against L. (L.) infantum chagasi promastigotes, with IC50 values of 57.9 and 24.9 µM, respectively. Compound 2 was effective against amastigotes (IC50 = 10.5 µM) and displayed moderate mammalian cytotoxicity (CC50 = 42 µM). The immunomodulatory studies of compound 2 suggested an anti-inflammatory activity, with suppression of IL-6, IL-10, TNF with lack of nitric oxide. Conclusion: This study showed the antileishmanial activity of compounds 1 and 2 isolated from N. oppositifolia. Furthermore, compound 2 demonstrated an antileishmanial activity towards amastigotes associated to an immunomodulatory effect.(AU)

Leishmania donovani infection activates Toll-like receptor 2, 4 expressions and Transforming growth factor-beta mediated apoptosis in renal tissues

Abstract The present study was aimed to identify the underlying mechanisms of improper renal function in Leishmania donovani infection that causes VL. Mice (BALB/c) were infected with L. donovani and different parameters for proteinuria were assessed. The levels of superoxide anion (O2 -), hydrogen peroxide (H2O2), lipid peroxidation (MDA), inflammatory cytokines, and toll-like receptor (TLR) 2 and 4 expression were found significantly elevated at 60th day in these animals and declined at 90th day post infection. However, TGF-β and caspase 3 activities were higher at 90th day in comparison to 60th day post infection. These findings suggested that exacerbated inflammatory conditions correlate with abnormal renal functions in L. donovani infection, which is further augmented by activated TLRs expressions by circulating leishmanial antigens. Further, the increased levels of TGF-β and caspase 3 at 90th day suggested TGF-β mediated apoptotic cell death of renal and other cells during later stages of disease that may eventually result in release of host and parasitic factors in urine during visceral leishmaniasis.

Avaliação de desempenho e custos diretos de kits comercialmente disponíveis no Brasil e do protótipo DAT-LPC para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana

A leishmaniose visceral (LV) humana é uma doença potencialmente fatal se não diagnosticada e tratada precocemente. Assim, a disponibilização de testes diagnósticos com elevado desempenho, simplicidade de uso e baixo custo, são de extrema importância para o controle da LV. Uma das dificuldades para o diagnóstico da LV no Brasil é a atual comercialização de testes diagnósticos não validados no país. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho e estimar os custos diretos dos kits diagnósticos para LV humana registrados na Agência Nacional de Vigilância Sanitária e comercialmente disponíveis no Brasil. Para avaliação de desempenho dos testes, foram incluídos no estudo amostras de soro de 237 pacientes residentes em área endêmica para LV, que apresentavam clínica sugestiva da doença e exame parasitológico de aspirado de medula óssea realizado, sendo 160 pacientes não portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e 77 portadores de HIV. Os custos diretos foram estimados através da técnica de microcusteio sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde. Os seguintes testes foram incluídos nas análises: IFI Leishmaniose Humana (Fundação Oswaldo Cruz); IT LEISH® (BIO-RAD Laboratories, Inc.); Kalazar Detect™ (Inbios International, Inc.); Leishmania ELISA IgG +IgM (Vircell S. L.); Ridascreen Leishmania Ab (R-Biopharm AG); Leishmania IFA IgG (Vircell S. L.) e DAT-LPC protótipo

Na análise global dos testes, apenas o teste não comercial DAT-LPC e o IT LEISH® apresentaram acurácia diagnóstica acima de 90%, sendo 93,7% e 91,1%, respectivamente. Para os pacientes não portadores de HIV, os testes com melhor desempenho foram IT LEISH®, DAT-LPC e Kalazar Detect™, apresentando sensibilidade e especificidade de 96,3% e 96,3%; 93,8% e 97,5%; 92,5 e 95,0%, respectivamente. Já para os pacientes portadores de HIV, o DAT-LPC foi o único teste que apresentou desempenho satisfatório, com sensibilidade de 89,5% e especificidade de 89,7%. Os testes Leishmania ELISA IgG +IgM, Ridascreen Leishmania Ab e Leishmania IFA IgG, apresentaram acurácia inferior a 88%, tanto na análise global como nas estratificada. Em termos de custo, o DAT-LPC foi o teste que apresentou menor custo direto, estimado em R$ 15,47, seguido do Kalazar Detect™ e do IT LEISH® realizado em sangue capilar digital, estimado em R$ 22,34 e R$ 26,82, respectivamente. Para os testes Leishmania IFA IgG, Leishmania ELISA IgG+IgM e Ridascreen® Leishmania Ab, o elevado custo não foi compensado pelo desempenho obtido no presente estudo. Os dados alcançados permitem recomendar o estabelecimento de critérios rigorosos para registro de testes para o diagnóstico da LV no país. O erro diagnóstico é agravado pela toxicidade dos medicamentos atualmente disponíveis para o tratamento da doença, em caso de resultados falso-positivos e pelo atraso do início do tratamento e manutenção da elevada letalidade, em caso de resultados falso-negativos

Buparvaquone nanostructured lipid carrier development: physicochemical and in vitro leishmanicidal performances / Desenvolvimento de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo buparvaquona: caracterização físico-química e avaliação da atividade leishmanicida in vitro

Leishmaniases is a group of diseases caused by parasites of the genus Leishmania. The estimated number of deaths from visceral leishmaniases ranges from 20,000 to 50,000 annually. The most common treatment over the past 60 years has been pentavalent antimonials. Besides the doubtful effectiveness, they present several disadvantages such as the need for parenteral administration, large doses, long treatment, severe toxicity and parasite resistance. Buparvaquone (BPQ), a drug used for veterinary treatment of theileriosis, showed promising activity against Leishmania spp. However, due to its low aqueous solubility and bioavailability, it has failed in in vivo tests. The use of nanotechnologies has the potential to overcome these drawbacks due to the following advantages: increase in drug water-solubility, increase in therapeutic efficacy and treatment toxicity reduction. Therefore, the present work aimed the development, optimization, physical-chemical evaluation and in vitro performances of nanostructured lipid carriers (NLC) for BPQ encapsulation. The NLC preparation was performed by high pressure homogenization, and surface response and factorial design were applied to formulation optimization. In vitro dissolution profiles were evaluated in phosphate buffer pH 7.4 with tween 80 0.07% w/v or sodium dodecyl sulfate 1% w/v and simulated body fluid pH 7.4. Cytotoxicity was evaluated in mouse peritoneal macrophages and leishmanicidal activity in L. infantum amastigotes. Six optimized NCL were prepared and they showed solubility improvement from 1.5- fold to 611-fold when compared with free BPQ, depending on the formulation and medium. Dissolution profiles showed the NLC formulation suitability for BPQ regarding oral administration, the release could reach 83.29% of a 4mg dose in 30 minutes for formulation of 175.1 nm, while the free drug could be dissolved only 2.89% of the same dose after 4 hours. Moreover, formulation of 230.7 nm showed 81.42% of drug release in in phosphate buffer pH 7.4 with dodecyl sulfate 1.0% w/v after 30 minutes, while BPQ did not dissolved. Cytotoxicity assay showed the safety of all formulations. The iv CC50 values were close to 500 µM, while the IC50 against amastigotes was only 456.5 nM for free BPQ. Developed NLCs showed an increase in IC50 from 2.0 to 3.1-fold when compared to free drug in the in vitro leishmanicidal evaluation. Therefore, the NLC containing BPQ are a promising alternative for the treatment of leishmaniases as oral and parenteral drug dosage forms. Additionally, they have a potential use for lymphatic targeted drug delivery, which can be an innovative approach for this neglected disease.

Leishmanioses são um grupo de doenças causadas por parasitas do gênero Leishmania. O número estimado de óbitos por leishmaniose visceral varia entre 20.000 e 50.000 por ano. O tratamento mais comum nos últimos 60 anos tem sido os antimônios pentavalentes. Além da eficácia duvidosa, eles apresentam várias desvantagens, como a necessidade de administração parenteral, altas doses, tratamento prolongado, toxicidade severa e resistência parasitária. Buparvaquona (BPQ), um fármaco usado para tratamento veterinário da teileriose, mostrou atividade promissora contra Leishmania donovani. No entanto, devido à sua baixa solubilidade e biodisponibilidade aquosa, falhou em testes in vivo. O uso das nanotecnologias tem o potencial de superar esses obstáculos devido às seguintes vantagens: aumento da solubilidade em água, aumento da eficácia terapêutica e redução da toxicidade do tratamento. Portanto, o presente trabalho objetivou o desenvolvimento, otimização, avaliação físico-química e avaliação do desempenho in vitro de carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) para o encapsulação da BPQ. A preparação do NLC foi realizada por homogeneização de alta pressão e superfície de resposta e planejamento fatorial foram aplicados à otimização das formulações. Os perfis de dissolução in vitro foram avaliados em tampão fosfato pH 7.4 com tween 80 a 0.07% p/v ou dodecilsulfato de sódio 1.0% p/v e fluido corporal simulado pH 7.4. A citotoxicidade foi avaliada em macrófagos peritoneais de camundongos e atividade leishmanicida em amastigotas de L. infantum. Foram preparados quatro NCL otimizados e mostraram melhora da solubilidade de 1,5 a 611 vezes quando comparado com a BPQ livre, dependendo da formulação e do meio. Os perfis de dissolução mostraram a adequação da formulação NLC para BPQ em relação à administração oral. A dissolução pode atingir 83,29% de uma dose de 4.0 mg em 30 minutos para a formulação de 175,1 nm, enquanto o fármaco livre dissolveu apenas vi 2,89% da mesma dose após 4 horas. Além disso, a formulação de 230,7 nm mostrou 81,42% de liberação do fármaco em tampão fosfato pH 7.4 com dodecil sulfato de sódio 1.0% p/v após 30 minutos, enquanto o BPQ não se dissolveu. O teste de citotoxicidade mostrou a segurança de todas as formulações. Os valores CC50 foram próximos de 500 µM, enquanto o IC50 em amastigotas foi de apenas 456,5 nM para BPQ livre. Os NLC desenvolvidos mostraram um aumento no IC50 de 2,0 a 3,1 vezes quando comparado ao;fármaco livre na avaliação leishmanicida in vitro. Logo, as NLC contendo BPQ são uma alternativa promissora para o tratamento de leishmanioses como formas farmacêuticas oral e parenteral. Além disso, eles têm um uso potencial para a sítio-específico ao sistema linfático, o que pode ser uma abordagem inovadora para esta doença negligenciada.

Increasing potential risk for American visceral leishmaniasis in Amapá, Brazil

Abstract: INTRODUCTION: The present note discusses some evidence on the increasing potential risk for American visceral leishmaniasis (AVL) transmission in the Northern Brazilian State of Amapá, the Guianan-Amazon biome. METHODS Early and present data about AVL were collected, including our recent entomological findings. RESULTS: The spread of the sand fly vector Lutzomyia longipalpis, and a sylvatic reservoir host, the crab-eating fox Cerdocyon thous in that region represents important findings related to the epidemiology of AVL in the Guianan-Amazon biome. CONCLUSIONS: These observations suggest that Brazilian authorities need to develop surveillance strategies in these risk areas.

Induction of apoptosis by zerumbone isolated from Zingiber zerumbet (L.) Smith in protozoan parasite Leishmania donovani due to oxidative stress

Abstract In the present context of emergence of resistance aligned with the conventional anti-leishmanial drugs and occasional treatment failure compelled us to continue the search for replaceable therapeutic leads against Leishmaniainfection. Various ginger spices of the Zingiberaceae family are widely used as spices, flavouring agents, and medicines in Southeast Asia because of their unique flavour as well as due to their medicinal properties. Zerumbone, a natural component of Zingiber zerumbet (L.) Smith, has been studied for its pharmacological potential as antiulcer, antioxidant, anticancer, and antimicrobial. In this study, we have shown that zerumbone could induce ROS mediated apoptosis in Leishmania donovani promastigotes and also found effective in reducing intracellular amastigotes in infected-macrophages. We emphasized the potential of zerumbone to be employed in the development of new therapeutic drugs against L. donovaniinfection and provided the basis for future research on the application of transitional medicinal plants.

Polymerase chain reaction detection of LeishmaniaDNA in skin biopsy samples in Sri Lanka where the causative agent of cutaneous leishmaniasis is Leishmania donovani

Leishmania donovani is the known causative agent of both cutaneous (CL) and visceral leishmaniasis in Sri Lanka. CL is considered to be under-reported partly due to relatively poor sensitivity and specificity of microscopic diagnosis. We compared robustness of three previously described polymerase chain reaction (PCR) based methods to detectLeishmania DNA in 38 punch biopsy samples from patients presented with suspected lesions in 2010. Both, Leishmaniagenus-specific JW11/JW12 KDNA and LITSR/L5.8S internal transcribed spacer (ITS)1 PCR assays detected 92% (35/38) of the samples whereas a KDNA assay specific forL. donovani (LdF/LdR) detected only 71% (27/38) of samples. All positive samples showed a L. donovani banding pattern upon HaeIII ITS1 PCR-restriction fragment length polymorphism analysis. PCR assay specificity was evaluated in samples containing Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, and human DNA, and there was no cross-amplification in JW11/JW12 and LITSR/L5.8S PCR assays. The LdF/LdR PCR assay did not amplify M. leprae or human DNA although 500 bp and 700 bp bands were observed in M. tuberculosis samples. In conclusion, it was successfully shown in this study that it is possible to diagnose Sri Lankan CL with high accuracy, to genus and species identification, using Leishmania DNA PCR assays.

Avaliação da infecciosidade em cães vacinados com Leish-Tec® (Hertape Saúde Animal S/A) para Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae)

O presente trabalho avaliou a transmissibilidade de Leishmania spp. para Lutzomyialongipalpis em 136 cães nativos e beagles-sentinelas, vacinados ou não (placebo) com Leish-Tec® (vacina anti-leishmaniose visceral canina), domiciliados em Porteirinha, município endêmico para leishmaniose visceral, em Minas Gerais. Esses animais foram selecionados a partir da amostra total de cães que compõem o ensaio clínico de fase III que determinou a eficácia da vacina Leish-Tec®, conforme diretrizes estabelecidas pelo Ministério da Saúde do Brasil. Além da técnica de xenodiagnóstico, esses cães também foram submetidos aos testes diagnósticos ELISA, RIFI, teste rápido Kalazar DetectTM e exames de detecção do parasito. Uma tendência de redução da infectividade (p-valor 0,052) foi observada no grupo de cães vacinados com Leish-Tec®que apresentaram resposta sorológica positiva ao antígeno vacinal A2. Os testes RIFI, Kalazar DetectTM e xenodiagnóstico apresentaram maior percentual de positividade entre os cães sintomáticos da amostra (p<0,05), quando comparados aos cães assintomáticos, na análise global.

Na análise estratificada e, para o grupo de cães que recebeu vacina, as diferenças se mantiveram para a RIFI e o teste rápido, mas não para o xenodiagnóstico; já para os cães que receberam placebo, as diferenças entre grupos clínicos se mantiveram para o xenodiagnóstico e teste rápido, mas não para a RIFI. Nossos resultados sugerem que a Leish-Tec® possui potencial de redução da infectividade em cães vacinados e desafiados em área endêmica e que a vacinação com Leish-Tec® pode contribuir para a redução da transmissão da leishmaniose visceral canina, desde que utilizada como medida protetiva individual e em conjunto com as demais estratégias, individuais e coletivas, de prevenção e controle da doença. Com relação à diferença de desempenho dos testes diagnósticos entre grupos clínicos, nossos resultados apontam para a necessidade de desenvolvimento de testes mais eficazes no diagnóstico da infecção assintomática por Leishmania e demonstra que essas diferenças interferem nos resultados e devem ser consideradas na avaliação de ensaios clínicos.

Evaluation of parasitological examination, kDNA polymerase chain reaction and rK39-based immunochromatography for the diagnosis of visceral leishmaniasis in seropositive dogs from the screening-culling program in Brazil

Introduction Dogs play a primary role in the zoonotic cycle of visceral leishmaniasis (VL). Therefore, the accurate diagnosis of infected dogs, primarily asymptomatic dogs, is crucial to the efficiency of VL control programs. Methods We investigated the agreement of four diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis (CVL): parasite detection, either after myeloculture or by direct microscopic examination of tissue imprints; kinetoplast-deoxyribonucleic acid-polymerase chain reaction (kDNA-PCR); and an immunochromatographic test (ICT). An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and an indirect immunofluorescence test (IFAT), both of which were adopted as part of the screening-culling program in Brazil, were used as reference tests. Our sample set consisted of 44 seropositive dogs, 25 of which were clinically asymptomatic and 19 were symptomatic for CVL according to ELISA-IFAT. Results The highest and lowest test co-positivities were observed for ICT (77.3%) and myeloculture (58.1%), respectively. When analyzed together, the overall percentage of co-positive tests was significantly higher for the symptomatic group compared to the asymptomatic group. However, only ICT was significantly different based on the results of a separate analysis per test for each group of dogs. The majority (93.8%) of animals exhibited at least one positive test result, with an average of 2.66 positive tests per dog. Half of the symptomatic dogs tested positive for all four tests administered. Conclusions The variability between test results reinforces the need for more efficient and reliable methods to accurately diagnose canine VL, particularly in asymptomatic animals. .

Estandarización de la técnica de aglutinación directa para el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas / Standardization of a direct agglutination test for the immunodiagnosis of Chagas disease

Introducción. La enfermedad de Chagas es causada por el parásito Trypanosoma cruzi y su diagnóstico inmunológico se basa principalmente en la detección de anticuerpos contra T. cruzi mediante pruebas tales como ELISA, inmunofluorescencia indirecta (IFI) y hemaglutinación indirecta (HAI). Esta última tiene el inconveniente de requerir la preparación de eritrocitos de carnero, difíciles de obtener y de poca duración. Sin embargo, existen pruebas alternativas, como la técnica de aglutinación directa. Objetivo. Estandarizar la técnica de aglutinación directa para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Materiales y métodos. Se prepararon parásitos epimastigotes de T. cruzi mediante dos protocolos, con tratamiento con tripsina y sin él. Los parásitos se colorearon, y se determinaron las condiciones óptimas de concentración parasitaria y diluciones de suero. Se utilizaron sueros de pacientes con enfermedad de Chagas, de individuos sanos y con otras parasitosis. Resultados. La concentración parasitaria óptima fue de 500 x10 6 parásitos/ml, utilizando parásitos coloreados y sin tratamiento con tripsina. Las diluciones de suero óptimas fueron de 1/25, 1/50 y1/100, y el punto de corte, la dilución de 1/50. La técnica estandarizada mostró índices diagnósticos de sensibilidad de 94,3 % (IC 95% 79,5-99,0) y de especificidad de 96,3 % (IC 95% 88,8-99,0); se encontró reacción cruzada en tres sueros de individuos con leishmaniasis visceral, con valores pronósticos positivo y negativo de 91,7 % (IC 95% 76,4-97,8) y de 97,5 % (IC 95% 90,4-99,6), respectivamente. Se compararon los resultados con los obtenidos por HAI, ELISA e IFI y la concordancia fue de 96 % con un índice kappa de 0,90 (IC 95% 0,81-0,99). Conclusión. La técnica de aglutinación directa estandarizada podría ser útil para el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas.

Introduction: Chagas´ disease is caused by the parasite Trypanosoma cruzi and its immunological diagnosis is mainly based on the detection of antibodies against T. cruzi using tests such as the ELISA, the indirect fluorescence antibody test (IFAT) and the indirect hemagglutination test (IHAT). The main disadvantage of the IHAT is the need to prepare sheep erythrocytes, whose availability is limited and they have a short duration once prepared. However, there are alternative tests, such as the direct agglutination test (DAT). Objective: To standardize the direct agglutination test for the diagnosis of Chagas disease. Materials and methods: Trypanosoma cruzi epimastigotes were prepared using two protocols, with and without trypsin treatment. The parasites were stained and optimal conditions for parasitic concentration and serum dilutions were determined. We evaluated the technique using sera from patients with Chagas disease, from healthy individuals and from individuals with other parasitic diseases. Results: The optimal parasitic concentration was 500 x 10 6 parasites/ml using stained parasites without trypsin treatment. The optimal serum dilutions were 1/25, 1/50 y 1/100 and the cut-off point was the 1/50 dilution. The diagnostic indices for the standardized technique were as follows: Sensitivity, 94.3% (95% CI: 79.5-99.0) and specificity, 96.3% (95% CI: 88.8-99.0), with positive and negative predictive values ?? of 91.7% (95% CI: 76.4-97.8) and 97.5% (95% CI: 90.4-99.6), respectively. Cross-reaction was observed only in three sera from individuals with visceral leishmaniasis. The results were compared with those obtained by IHA, ELISA, and IFA, and the concordance rate was 96% and the kappa index, 0.90 (95% CI: 0.81-0.99). Conclusion: The standardized direct agglutination test could be useful for immunodiagnosis of Chagas disease.

Epidemiologia da leishmaniose visceral no município de Sabará, Região Metropolitana de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil

A proposta deste trabalho foi estudar algumas das variáveis envolvidas na transmissão da leishmaniose visceral (LV) em oito bairros do município de Sabará(MG). Para o levantamento da fauna de flebotomíneos, influência dos fatores climáticos, identificação de repasto sanguíneo e infecção natural por Leishmania,para isso foram realizadas capturas utilizando armadilhas luminosas do tipo HP,tanto no peri como no intradomicílio, nos seguintes bairros: Alvorada, Novo Alvorada, Alvorada Velho, Bom Retiro, Nova Vista, Casa Branca, Rio Negro e Ana Lúcia, no período de janeiro de 2011 a dezembro 2012. Além desses estudos, foram realizados dois inquéritos caninos censitários nos mesmos bairros, nos anos de 2011 e 2012, para o cálculo da taxa de positividade. Para análises parasitológicas e moleculares, foram selecionados aleatoriamente 50 cães soropositivos para os testes de RIFI e ELISA, que foram eutanasiados e necropsiados para obtenção de amostras de pele, linfonodo mesentérico e baço, além de aspirado de medula óssea.Com essas amostras, foram realizados os testes: exame direto (parasitológico), PCRe mielocultura visando confirmar a infecção e identificar a espécie de Leishmania circulante.

A fauna flebotomínica foi constituída de quatro espécies, sendo Lutzomyia longipalpis a mais abundante, totalizando 95,0% dos exemplares capturados. Destes, 23,0% foi capturado no intradomicílio. Verificou-se uma tendência no aumento do número de espécimens após o período chuvoso. Das 28 fêmeas ingurgitadas, 67,9% se alimentaram no homem (Homo sapiens) e 25,0%tiveram como fonte alimentar a ave (Gallus gallus). Nove pools foram utilizados para verificar a infecção natural, destes três se apresentaram positivos e, após sequenciamento de DNA, foi observado que a espécie circulante nos vetores foi Leishmania infantum. A taxa média de infecção canina foi de 4,25% em 2011 e 3,34% em 2012. A positividade das amostras (pele, baço, medula e linfonodo)obtidas dos cães soropositivos foi de 100,0% pela PCR, 76,0% pela mielocultura e 66,0% pelo exame parasitológico direto. Entre os quatro tipos de amostras estudadas, o linfonodo foi o tecido que apresentou maior positividade (98,0%). O sequenciamento de DNA das amostras positivas de linfonodo indicou Le. infantum como sendo a espécie circulante nos cães do município. Após se correlacionarem os casos humanos, caninos e a presença da espécie Lu. longipalpis, encontrada positiva para Le. infantum, pode-se sugerir que os bairros Alvorada e Nova Vista merecem atenção especial como importantes áreas de risco para LV no município.

Epidemiologia da leishmaniose visceral no município de Sabará, Região Metropolitana de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil / Epidemiology of visceral leishmaniasis in the municipality of Sabara metropolitan region of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil

A proposta deste trabalho foi estudar algumas das variáveis envolvidas na transmissão da leishmaniose visceral (LV) em oito bairros do município de Sabará(MG). Para o levantamento da fauna de flebotomíneos, influência dos fatores climáticos, identificação de repasto sanguíneo e infecção natural por Leishmania,para isso foram realizadas capturas utilizando armadilhas luminosas do tipo HP,tanto no peri como no intradomicílio, nos seguintes bairros: Alvorada, Novo Alvorada, Alvorada Velho, Bom Retiro, Nova Vista, Casa Branca, Rio Negro e Ana Lúcia, no período de janeiro de 2011 a dezembro 2012. Além desses estudos, foram realizados dois inquéritos caninos censitários nos mesmos bairros, nos anos de 2011 e 2012, para o cálculo da taxa de positividade. Para análises parasitológicas e moleculares, foram selecionados aleatoriamente 50 cães soropositivos para os testes de RIFI e ELISA, que foram eutanasiados e necropsiados para obtenção de amostras de pele, linfonodo mesentérico e baço, além de aspirado de medula óssea.Com essas amostras, foram realizados os testes: exame direto (parasitológico), PCRe mielocultura visando confirmar a infecção e identificar a espécie de Leishmania circulante...

A fauna flebotomínica foi constituída de quatro espécies, sendo Lutzomyia longipalpis a mais abundante, totalizando 95,0% dos exemplares capturados. Destes, 23,0% foi capturado no intradomicílio. Verificou-se uma tendência no aumento do número de espécimens após o período chuvoso. Das 28 fêmeas ingurgitadas, 67,9% se alimentaram no homem (Homo sapiens) e 25,0%tiveram como fonte alimentar a ave (Gallus gallus). Nove pools foram utilizados para verificar a infecção natural, destes três se apresentaram positivos e, após sequenciamento de DNA, foi observado que a espécie circulante nos vetores foi Leishmania infantum. A taxa média de infecção canina foi de 4,25% em 2011 e 3,34% em 2012. A positividade das amostras (pele, baço, medula e linfonodo)obtidas dos cães soropositivos foi de 100,0% pela PCR, 76,0% pela mielocultura e 66,0% pelo exame parasitológico direto. Entre os quatro tipos de amostras estudadas, o linfonodo foi o tecido que apresentou maior positividade (98,0%). O sequenciamento de DNA das amostras positivas de linfonodo indicou Le. infantum como sendo a espécie circulante nos cães do município. Após se correlacionarem os casos humanos, caninos e a presença da espécie Lu. longipalpis, encontrada positiva para Le. infantum, pode-se sugerir que os bairros Alvorada e Nova Vista merecem atenção especial como importantes áreas de risco para LV no município...

Performance of a rapid diagnostic test for the detection of visceral leishmaniasis in a large urban setting

Introduction Rapid diagnostic tests (RDTs) may improve the early detection of visceral leishmaniasis (VL), but their real-world performance requires additional study. Therefore, we evaluated the performance of an rK39-based RDT (Kalazar Detect™) for the detection of VL in an endemic, large urban area. Methods Data were collected from a registry of rK39 RDT performed at 11 emergency care units in Belo Horizonte, Brazil, and from a national database of reportable communicable diseases of the Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN). Results The rapid rK39 test was performed in 476 patients, with 114 (23.9%) positive results. The analysis of rK39 RDT performance was based on 381 (80%) cases reported to the SINAN database, of which 145 (38.1%) were confirmed cases. Estimates for sensitivity and specificity were 72.4% (95% CI: 64.6-79%) and 99.6% (95%CI: 97.6-99.9%), respectively. Positive and negative predictive values were estimated at 99.1% (95%CI: 94.9-99.8%) and 85.5% (95%CI: 80.8-89.1%), respectively. In addition, close agreement between the rK39 RDT and indirect immunofluorescence was observed. Conclusions In summary, the rK39 RDT showed a high specificity but only moderate sensitivity. In endemic areas for VL, treatment may be considered in cases with clinical manifestations and a positive rK39 RDT, but those with a negative test should be subjected to further investigation. .

Canine visceral leishmaniasis and Chagas disease among dogs in Araguaina, Tocantins / Leishmaniose visceral canina e doença de Chagas em cães de Araguaina, Tocantins

The present study analyzed serum samples from 111 male and female dogs of various ages from the municipality of Araguaína in the State of Tocantins, Brazil. Serological diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) was initially performed at the Central Laboratory (Laboratório Central ­ LACEN) of Araguaína, resulting in 61 positive samples by an indirect immunofluorescence assay (IIFA) (≥1:40) and 50 non-reactive samples. The same samples were analyzed at the São Paulo Institute of Tropical Medicine (Instituto de Medicina Tropical de São Paulo ­ IMTSP) by an enzyme-linked-immunosorbent assay (ELISA), resulting in 57 positive samples (51.35%) and 54 negative samples (48.64%). The Kappa coefficient of agreement between the tests was 0.74. The serum samples were also subjected to a diagnostic assay for Trypanosoma cruzi (Trypomastigote Excreted/Secreted Antigens -TESA-blot) that detected five suspect animals; three of those animals were positive for leishmaniasis by ELISA but negative by IIFA. These findings suggest that the canine population of Araguaína may be simultaneously infected with Leishmania chagasi and T. cruzi. The results obtained demonstrate the difficulty of using serology to detect CVL, thus emphasizing the necessity for a reference test to diagnose CVL, particularly in regions where the infection is endemic.

Neste estudo foram analisadas amostras de soros de 111 cães machos e fêmeas, de idades variadas, provenientes do município de Araguaína, estado do Tocantins, Brasil. O diagnóstico sorológico para leishmaniose visceral canina foi realizado, inicialmente, no Laboratório Central (LACEN) de Araguaína, resultando em 61 amostras positivas na Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI (≥1:40) e 50 amostras não reativas. As mesmas amostras foram analisadas no Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMTSP) pelo Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay (ELISA), sendo 57 amostras positivas (51,35%) e 54 amostras negativas (48,64%), com coeficiente de concordância entre os testes (Kappa = 0,74). Os soros foram submetidos também a um teste de diagnóstico para Trypanosoma cruzi (Trypomastigote Excreted/Secreted Antigens-TESA-blot), o qual detectou cinco animais suspeitos, dos quais três foram positivos para leishmaniose no ELISA, mas negativos na RIFI. Estas observações mostram que a população canina de Araguaína pode também estar infectada simultaneamente com Leishmania chagasi e T. cruzi. Estes resultados mostram a dificuldade da sorologia na detecção da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), reforçando a necessidade de um teste de referência para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, principalmente em regiões endêmicas para tais infecções.

Desenvolvimento e validação de um ensaio de PCR-ELISA para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em amostras de sangue periférico

Nas últimas décadas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) com diferentes objetivos: o diagnóstico da infecção, da doença e o controle de cura. Para utilização em larga escala, a etapa de eletroforese para detecção dos produtos amplificados na PCR, torna a técnica complexa e onerosa. A PCR-ELISA representa uma alternativa de detecção do produto amplificado por PCR através de um ensaio imunoenzimático (ELISA). Esta técnica é capaz de conferir maior sensibilidade e rapidez para a análise de grandes números de amostras clínicas com o uso de equipamentos utilizados para processamento de ELISA e, portanto, permite realizar PCR para fins de diagnóstico em laboratórios de média complexidade. Assim, este estudo objetivou desenvolver e validar o método de detecção colorimétrica dos produtos de amplificação gerados pela reação de PCR para o diagnóstico da LV em amostras de sangue periférico.O método de PCR-ELISA foi desenvolvido para detecção de fragmento de DNA do cinetoplasto(kDNA), complexo Donovani-específico. Utilizando-se cepas referências de Leishmania em cultivo e de painel de amostras de sangue periférico humano de 11 indivíduos não infectados, moradores de área endêmica e 14 casos de LV, caracterizadas clínica e parasitologicamente, determinou-se o limite de detecção da reação, medidas de precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) e limite entre positivo e negativo (cut-off).

A avaliação do desempenho do ensaio foi realizada com amostras de sangue periférico de 105 pacientes portadores de LV, 25 pacientes portadores da co-infecção Leishmania/HIV e de 73 indivíduos moradores de área endêmica para a LV. Foi desenvolvido ainda um ensaio de PCR-ELISA para detecção do DNA amplificado do gene humano ACTB, para uso como controle do processo de extração de DNA e amplificação por PCR das amostras clínicas. O ensaio PCR-ELISA kDNA desenvolvido apresentou limite de detecção de 1 parasito/mL de sangue e 0,07fg/μL de DNA de L. (L.) infantum, sensibilidade de 100% (IC 95%: 97,1 a 100%) e especificidade de 95% (IC 95%: 83,5 a 98,6%). Todos os indivíduos assintomáticos de área endêmica, com positividade por outras técnicas diagnósticas, foram também positivos pela PCR-ELISA. Todas as amostras foram testadas satisfatoriamente para o ensaio de PCR-ELISA ACTB. O ensaio de PCR-ELISA kDNA, desenvolvido e validado neste estudo, apresenta simplicidade metodológica e operacional, permite interpretação objetiva da amplificação por PCR do DNA de Leishmania do complexo Donovani e desempenho adequado no diagnóstico da LV em laboratórios de referência.

Abordagem clínica da leishmaniose visceral entre adultos infectados pelo HIV: acurácia diagnóstica, fatores prognósticos e eficácia terapêutica

Leishmaniose visceral (LV) entre infectados pelo HIV tem incidência crescente em regiões onde as duas infecções são endêmicas. Reconhece-se hoje que a doença está associada a maior mortalidade, menor taxa de resposta clínica e parasitológica e maior toxicidade ao tratamento que as observadas em pacientes não infectados pelo HIV. Várias são as incertezas e dificuldades a cerca do diagnóstico, tratamento e seguimento dos pacientes coinfectados com Leishmania-HIV. Esta tese é composta por três revisões sistemáticas e um estudo clínico e busca contribuir para a redução de algumas lacunas do conhecimento à cerca da coinfecção Leishmania-HIV. Por meio de revisões sistemáticas da literatura e de um estudo transversal, que comparou a acurácia de métodos invasivos e não invasivos para o diagnóstico de LV entre infectados pelo HIV, confirmamos baixa sensibilidade dos testes sorológicos, à exceção do teste de aglutinação direta, que deve ser preferido em rotinas de investigação. Incluindo nossos próprios resultados, foram identificados apenas três estudos que avaliaram o desempenho de testes imunocromatográficos rápidos, baseados na pesquisa do anticorpo contra o antígeno recombinante K39, entre infectados pelo HIV. Por sua vez, testes baseados na reação em cadeia da polimerase, incluindo a técnica que utiliza como alvo a subunidade ribossomal do RNA e testada em nosso meio, apresentam alto desempenho global e despontam como alternativa menos invasiva ao exame parasitológico.

De acordo com a evidência disponível, a terapia antirretroviral altamente potente não constitui intervenção suficiente para evitar a recidiva. Por outro lado, o uso de profilaxia secundária reduz significativamente a ocorrência de episódios subsequentes de LV. A revisão da literatura nos permitiu ainda identificar algumas condições marcadoras do risco de recidiva que, se presentes, reforçam a indicação de profilaxia secundária: ausência de elevação da contagem de linfócitos T CD4+ no seguimento; história prévia e recidiva de LV; contagem de linfócitos T CD4+ abaixo de 100 células/mL na ocasião do primeiro diagnóstico de LV. Os trabalhos publicados revelam maior taxa de resposta clínica com o uso de anfotericina B em relação ao tratamento com derivados de antimônio, o que parece estar relacionado à menor toxicidade que à maior eficácia. Os derivados de antimônio são drogas mal toleradas pelos pacientes coinfectados com HIV, associando-se a alta taxa de descontinuidade do tratamento e mortalidade três vezes maior que a observada com o tratamento com anfotericina B. Os dados disponíveis até o momento são insuficientes para se comparar a eficácia entre as várias formulações de anfotericina ou se definir a dose e o tempo de tratamento ideais para LV entre infectados pelo HIV.

Uso de Leishmania donovani geneticamente modificada(LdCen-/-) como modelo de vacina protetora contra aleishmaniose visceral canina

A leishmaniose visceral zoonótica (LVZ), causada pelo parasito intracelular Leishmania infantum, é uma doença tropical negligenciada que pode ser fatal quando não tratada. Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de L. infantum na LVZ, já que a presença de cães infectados pode aumentar o risco de infecção humana. A leishmaniose visceral canina (LVC) representa um dos maiores problemas veterinários e de saúde pública no sul da Europa, Oriente Médio e América do Sul. O controle de reservatórios animais é baseado na eliminação de cães soropositivos em áreas endêmicas. Contudo, o tratamento de cães infectados não é indicado no Brasil, pois esse procedimento pode levar a seleção de parasitos resistentes já que as mesmas drogas são usadas no tratamento de infecções em humanos. Sendo assim, o uso de vacinas contra a LVC continua sendo a melhor alternativa no controle de parasitos. Nesse trabalho, nós apresentamos dados de perfil de imunogenicidade e proteção conferido pelo uso de parasitos vivos atenuados LdCen-/- em modelo canino, comparando com Leishmune®, uma vacina disponível comercialmente.

A imunogenicidade e proteção foram avaliadas através da produção de anticorpos, proliferação e ativação celular, expressão de receptores TLR, produção de citocinas intracitoplasmáticas e secretadas no sobrenadante, e carga parasitária por Real Time PCR. A vacinação com LdCen-/- resultou em alta imunogenicidade e proteção, observado pela maior produção de IgG Total, IgG1, e IgG2, e maior linfoproliferação em resposta a antígenos solúveis. Além disso, cães vacinados com LdCen-/- apresentaram maior frequência de células T CD4+ e CD8+ ativadas, maior produção de IFN-γ e menor produção de IL-4 por essas células, secreção aumentada de TNF-α e IL-12/IL-23p40 e menor secreção de IL-4 em sobrenandante de culturas estimuladas. Também podemos observar alta expressão de receptores TLR2, 4 e 9 por linfócitos T CD4+, maior expressão de TLR4 por células T CD8+, e menor carga parasitária em cães vacinados. Os dados sugerem que a vacinação com parasitos LdCen-/- induz a produção de anticorpos, proliferação e ativação celular, expressão de receptores Toll e produção de citocinas pró-inflamatórias, sendo que esse conjunto de fatores permitiu a indução de proteção contra o desafio com L. infantum. Baseando nesses dados, a imunização com esses parasitos se mostrou segura e imunogênica, conferindo proteção em cães

Uso de Leishmania donovani geneticamente modificada(LdCen-/-) como modelo de vacina protetora contra aleishmaniose visceral canina / Use of Leishmania donovani genetically modified (LdCen-/ -) as a model for protective vaccine against canine visceral leishmaniasis

A leishmaniose visceral zoonótica (LVZ), causada pelo parasito intracelular Leishmania infantum, é uma doença tropical negligenciada que pode ser fatal quando não tratada. Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de L. infantum na LVZ, já que a presença de cães infectados pode aumentar o risco de infecção humana. A leishmaniose visceral canina (LVC) representa um dos maiores problemas veterinários e de saúde pública no sul da Europa, Oriente Médio e América do Sul. O controle de reservatórios animais é baseado na eliminação de cães soropositivos em áreas endêmicas. Contudo, o tratamento de cães infectados não é indicado no Brasil, pois esse procedimento pode levar a seleção de parasitos resistentes já que as mesmas drogas são usadas no tratamento de infecções em humanos. Sendo assim, o uso de vacinas contra a LVC continua sendo a melhor alternativa no controle de parasitos. Nesse trabalho, nós apresentamos dados de perfil de imunogenicidade e proteção conferido pelo uso de parasitos vivos atenuados LdCen-/- em modelo canino, comparando com Leishmune®, uma vacina disponível comercialmente. A imunogenicidade e proteção foram avaliadas através da produção de anticorpos, proliferação e ativação celular, expressão de receptores TLR, produção de citocinas intracitoplasmáticas e secretadas no sobrenadante, e carga parasitária por Real Time PCR. A vacinação com LdCen-/- resultou em alta imunogenicidade e proteção, observado pela maior produção de IgG Total, IgG1, e IgG2, e maior linfoproliferação em resposta a antígenos solúveis. Além disso, cães vacinados com LdCen-/- apresentaram maior frequência de células T CD4+ e CD8+ ativadas, maior produção de IFN-γ e menor produção de IL-4 por essas células, secreção aumentada de TNF-α e IL-12/IL-23p40 e menor secreção de IL-4 em sobrenandante de culturas estimuladas. Também podemos observar alta expressão de receptores TLR2, 4 e 9 por linfócitos T CD4+, maior expressão de TLR4 por células T CD8+, e menor carga parasitária em cães vacinados. Os dados sugerem que a vacinação com parasitos LdCen-/- induz a produção de anticorpos, proliferação e ativação celular, expressão de receptores Toll e produção de citocinas pró-inflamatórias, sendo que esse conjunto de fatores permitiu a indução de proteção contra o desafio com L. infantum. Baseando nesses dados, a imunização com esses parasitos se mostrou segura e imunogênica, conferindo proteção em cães.

Desenvolvimento e validação de um ensaio de PCR-ELISA para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em amostras de sangue periférico / Development and validation of an ELISA-PCR assay for the diagnosis of visceral leishmaniasis in human peripheral blood samples

Nas últimas décadas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) com diferentes objetivos: o diagnóstico da infecção, da doença e o controle de cura. Para utilização em larga escala, a etapa de eletroforese para detecção dos produtos amplificados na PCR, torna a técnica complexa e onerosa. A PCR-ELISA representa uma alternativa de detecção do produto amplificado por PCR através de um ensaio imunoenzimático (ELISA). Esta técnica é capaz de conferir maior sensibilidade e rapidez para a análise de grandes números de amostras clínicas com o uso de equipamentos utilizados para processamento de ELISA e, portanto, permite realizar PCR para fins de diagnóstico em laboratórios de média complexidade. Assim, este estudo objetivou desenvolver e validar o método de detecção colorimétrica dos produtos de amplificação gerados pela reação de PCR para o diagnóstico da LV em amostras de sangue periférico.O método de PCR-ELISA foi desenvolvido para detecção de fragmento de DNA do cinetoplasto(kDNA), complexo Donovani-específico. Utilizando-se cepas referências de Leishmania em cultivo e de painel de amostras de sangue periférico humano de 11 indivíduos não infectados, moradores de área endêmica e 14 casos de LV, caracterizadas clínica e parasitologicamente, determinou-se o limite de detecção da reação, medidas de precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) e limite entre positivo e negativo (cut-off). A avaliação do desempenho do ensaio foi realizada com amostras de sangue periférico de 105 pacientes portadores de LV, 25 pacientes portadores da co-infecção Leishmania/HIV e de 73 indivíduos moradores de área endêmica para a LV. Foi desenvolvido ainda um ensaio de PCR-ELISA para detecção do DNA amplificado do gene humano ACTB, para uso como controle do processo de extração de DNA e amplificação por PCR das amostras clínicas. O ensaio PCR-ELISA kDNA desenvolvido apresentou limite de detecção de 1 parasito/mL de sangue e 0,07fg/μL de DNA de L. (L.) infantum, sensibilidade de 100% (IC 95%: 97,1 a 100%) e especificidade de 95% (IC 95%: 83,5 a 98,6%). Todos os indivíduos assintomáticos de área endêmica, com positividade por outras técnicas diagnósticas, foram também positivos pela PCR-ELISA. Todas as amostras foram testadas satisfatoriamente para o ensaio de PCR-ELISA ACTB. O ensaio de PCR-ELISA kDNA, desenvolvido e validado neste estudo, apresenta simplicidade metodológica e operacional, permite interpretação objetiva da amplificação por PCR do DNA de Leishmania do complexo Donovani e desempenho adequado no diagnóstico da LV em laboratórios de referência.

Abordagem clínica da leishmaniose visceral entre adultos infectados pelo HIV: acurácia diagnóstica, fatores prognósticos e eficácia terapêutica / Clinical management of visceral leishmaniasis among HIV-infected adults: diagnostic accuracy, prognostic and therapeutic efficacy

Leishmaniose visceral (LV) entre infectados pelo HIV tem incidência crescente em regiões onde as duas infecções são endêmicas. Reconhece-se hoje que a doença está associada a maior mortalidade, menor taxa de resposta clínica e parasitológica e maior toxicidade ao tratamento que as observadas em pacientes não infectados pelo HIV. Várias são as incertezas e dificuldades a cerca do diagnóstico, tratamento e seguimento dos pacientes coinfectados com Leishmania-HIV. Esta tese é composta por três revisões sistemáticas e um estudo clínico e busca contribuir para a redução de algumas lacunas do conhecimento à cerca da coinfecção Leishmania-HIV. Por meio de revisões sistemáticas da literatura e de um estudo transversal, que comparou a acurácia de métodos invasivos e não invasivos para o diagnóstico de LV entre infectados pelo HIV, confirmamos baixa sensibilidade dos testes sorológicos, à exceção do teste de aglutinação direta, que deve ser preferido em rotinas de investigação. Incluindo nossos próprios resultados, foram identificados apenas três estudos que avaliaram o desempenho de testes imunocromatográficos rápidos, baseados na pesquisa do anticorpo contra o antígeno recombinante K39, entre infectados pelo HIV. Por sua vez, testes baseados na reação em cadeia da polimerase, incluindo a técnica que utiliza como alvo a subunidade ribossomal do RNA e testada em nosso meio, apresentam alto desempenho global e despontam como alternativa menos invasiva ao exame parasitológico. De acordo com a evidência disponível, a terapia antirretroviral altamente potente não constitui intervenção suficiente para evitar a recidiva. Por outro lado, o uso de profilaxia secundária reduz significativamente a ocorrência de episódios subsequentes de LV. A revisão da literatura nos permitiu ainda identificar algumas condições marcadoras do risco de recidiva que, se presentes, reforçam a indicação de profilaxia secundária: ausência de elevação da contagem de linfócitos T CD4+ no seguimento; história prévia e recidiva de LV; contagem de linfócitos T CD4+ abaixo de 100 células/mL na ocasião do primeiro diagnóstico de LV. Os trabalhos publicados revelam maior taxa de resposta clínica com o uso de anfotericina B em relação ao tratamento com derivados de antimônio, o que parece estar relacionado à menor toxicidade que à maior eficácia. Os derivados de antimônio são drogas mal toleradas pelos pacientes coinfectados com HIV, associando-se a alta taxa de descontinuidade do tratamento e mortalidade três vezes maior que a observada com o tratamento com anfotericina B. Os dados disponíveis até o momento são insuficientes para se comparar a eficácia entre as várias formulações de anfotericina ou se definir a dose e o tempo de tratamento ideais para LV entre infectados pelo HIV.