Porcine circovirus 2 and 3 in wild boars in Southern Brazil / Circovírus suíno 2 e 3 em javalis no Sul do Brasil

Porcine circovirus 2 (PCV2) has a considerable economic impact on the pork industry worldwide for more than two decades. In 2016, a new circovirus, porcine circovirus 3 (PCV3), was described; since then, it has been reported to be associated with diseased or even in clinically healthy swine in several countries. Considering the importance of wild boars as reservoirs of swine pathogens and the extensive distribution of these animals in Rio Grande do Sul and throughout the national territory, we searched for PCV2 and PCV3 in twenty-six wild boars coupled with necropsy and histologic examination of the sampled animals. Using PCR, 182 tissue samples were analyzed, including the heart, kidneys, liver, lung, lymph nodes, spleen, and tonsils. PCV2 and PCV3 were detected in 57.7% (15/26) and 15.4% (4/26) of wild boars, respectively. Furthermore, co-infection with PCV2 and PCV3 was detected in one of these animals, with PCV2 or PCV3 DNA detection in multiple organs. Histological examination showed mild to moderate and multifocal lymphoplasmacytic interstitial nephritis distributed randomly throughout the renal cortex, apparently unrelated to PCV2 or PCV3 detection. The wild boar population in Brazil is extensive, indicating the presence of a larger number of swine pathogen hosts. In the present study, more than half of the wild boars harbored PCV2; and although less frequently, PCV3 was also detected. Therefore, free-living wild boars can serve as reservoirs of swine circoviruses in southern Brazil.

O circovírus suíno 2 (PCV2) tem causado impacto econômico na indústria suína em todo o mundo por mais de duas décadas. Em 2016, um novo circovírus foi descrito - circovírus suíno 3 (PCV3) - e desde então tem sido relatado em vários países associado a doenças ou mesmo suínos saudáveis. Diante da importância dos javalis como reservatórios de patógenos suínos, e da ampla distribuição desses animais no Rio Grande do Sul e em todo o território nacional, foi realizada pesquisa de PCV2 e PCV3 em vinte e seis javalis (10 fêmeas e 16 machos). Necropsia e exame histológico foram realizados. Utilizando PCR, foram analisadas 182 amostras de tecidos incluindo: coração, rins, fígado, pulmão, linfonodos, baço e tonsila. PCV2 e PCV3 foram detectados por PCR em 57,7% (15/26) e 15,4% (4/26) dos javalis, respectivamente. Um destes animais estava co-infectado por PCV2 e PCV3. O DNA do PCV2 ou PCV3 foi detectado em multiplos órgãos. No exame histológico foi observada nefrite intersticial linfoplasmocitária multifocal leve a moderada, distribuída aleatoriamente pelo córtex renal, aparentemente sem relação com a detecção de DNA viral. A população de javalis no Brasil é extensa, resultando em maior número de hospedeiros para patógenos de suínos. No presente estudo, mais da metade dos javalis capturados abrigavam PCV2 e, embora menos frequente, PCV3 também foi detectado. Os javalis de vida livre podem servir como reservatórios de circovírus suínos no sul do Brasil.

Molecular detection and clinical aspects of porcine circovirus 3 infection in pigs from Brazil / [Detecção molecular e aspectos clínicos da infecção por circovírus suíno 3 em suínos do Brasil]

Porcine circovirus 3 (PCV-3) DNA has been detected in serum samples from apparently healthy pigs as well as pigs with different clinical conditions. Molecular detection of PCV-3 was observed in swine serum samples from Southeastern - Brazil using a nested PCR designed specifically for this study. The epidemiology and clinical aspects of PCV-3 infection were evaluated. The samples originated from 154 pigs of both genders from different production phases and with different clinical presentations, sampled from 31 pig farms visited between 2013 and 2018. In this study, PCV-3 was detected in 26.7% of samples from all populations across varying ages. Statistical association (P=0.0285) was observed only between animals with respiratory signs and PCV-3; no PCV-3-positive animal had diarrhea. No statistical association was observed between PCV-3 and age, or gender of the pigs. Because PCV-3 is a newly discovered virus, there is very little information about its epidemiology. We hope that these data can help in future studies investigating PCV-3 epidemiology.(AU)

O DNA do circovírus suíno 3 (PCV-3) foi detectado em amostras de soro de suínos aparentemente saudáveis, bem como em suínos com diferentes condições clínicas. A detecção molecular do PCV-3 foi observada em amostras de soro de suínos da região Sudeste do Brasil, com uma nested PCR desenhada especificamente para este estudo. A epidemiologia e os aspectos clínicos da infecção por PCV-3 foram avaliados. As amostras foram coletadas de 154 suínos de ambos os sexos, de diferentes fases de produção e com diferentes sinais clínicos. Os animais pertenciam a 31 granjas visitadas entre 2013 e 2018. Neste estudo, o PCV-3 foi detectado em 26,7% das amostras de animais saudáveis e de animais com variados sinais clínicos, de ambos os sexos e de idades variadas. Associação estatística (P=0,0285) foi observada apenas entre animais com sinais respiratórios e PCV-3; nenhum animal positivo para PCV-3 apresentava diarreia. Não foi observada associação estatística entre o PCV-3 e a idade ou o sexo dos suínos. Por se tratar de um vírus recém-descoberto, existem poucas informações sobre sua epidemiologia. Espera-se que os dados deste trabalho possam contribuir para futuros estudos sobre a epidemiologia do PCV-3.(AU)

Infectious diseases dynamics in growing/finishing pigs in Southern Brazil (2005-2016) / Dinâmica de ocorrência das doenças infecciosas em suínos nas fases de crescimento e terminação no sul do Brasil (2005-2016)

This study aimed to determine the frequency and distribution of infectious diseases diagnosed through necropsy examination and histopathological analysis in growing/finishing pigs along 12 years (2005-2016) in Southern Brazil. We evaluated 1906 anatomopathological exams of pigs at growing/finishing phases, of which the infectious diseases corresponded to 75.6% of the cases (1,441/1,906). Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections were the most frequent, accounting for 51.3% of the cases (739/1,441) with a higher frequency from 2005 to 2007, characterizing an epidemic distribution, with a gradual decline after 2008. Infectious diseases affecting the respiratory system were the second major cause with 30.1% of the cases. Among these, necrotizing bronchiolitis caused by swine Influenza (15.1%, 218/1,441) and bacterial pneumonia (15%, 216/1,441) were the main conditions. Influenza was mostly diagnosed from 2010 to 2013, accounting for 43.1% (167/387) of the cases. After this period, both respiratory infectious diseases were endemic. Digestive system infectious diseases accounted for 10.5% of the diagnoses (151/1,441), with the following main conditions: Salmonella spp. enterocolitis (43.7%, 66/151), Lawsonia spp. proliferative enteropathy (41.7%, 63/151), and Brachyspira spp. colitis (14.6%, 22/151). The latter had a higher incidence from 2012 to 2014 with all cases detected in this period. Polyserositis and bacterial meningitis represented, respectively, 5.8% (84/1,441) and 2.3% (33/1,441) of the cases diagnosed, with a constant endemic character.(AU)

O objetivo deste estudo consistiu em determinar a frequência e a distribuição das doenças infecciosas diagnosticadas através de exame de necropsia e análise histopatológica em suínos nas fases de crescimento/terminação ao longo de 12 anos (2005-2016) no sul do Brasil. Foram avaliados 1906 laudos anatomopatológicos de suínos nas fases de crescimento/terminação, dos quais as doenças infecciosas corresponderam a 75,6% (1441/1906) do total. As infecções por circovírus suíno tipo 2 (PCV2) foram as mais frequentes, contabilizando 51,3% (739/1441) dos casos, com uma alta frequência de 2005 a 2007 caracterizando uma distribuição epidêmica neste período, e um declínio gradual após o ano de 2008. A segunda principal causa incluiu as doenças infecciosas que afetam o sistema respiratório (30,1% dos casos). Dentre essas, destacaram-se a influenza suína (15,1%; 218/1441) e pneumonias bacterianas (15%; 216/1441). O diagnóstico de influenza apresentou uma frequência elevada de 2010 a 2013, totalizando 43,1% (167/387) dos casos. Após este período, ambas doenças infecciosas respiratórias exibiram caráter endêmico. As doenças infecciosas do sistema digestório totalizaram 10,5% (151/1441) dos diagnósticos, com as seguintes principais condições: enterocolite por Salmonella spp. (43,7%; 66/151), enteropatia proliferativa por Lawsonia spp. (41,7%; 63/151) e colite por Brachyspira spp. (14,6%; 22/151). A colite por Brachyspira spp. apresentou uma alta incidência de 2012 a 2014 com todos os casos detectados no período. As polisserosites e meningites bacterianas representaram 5,8% (84/1441) e 2,3% (33/1441) dos casos diagnosticados, respectivamente, com um caráter endêmico constante.(AU)

Structure analysis of capsid protein of Porcine circovirus type 2 from pigs with systemic disease

Abstract Economic losses with high mortality rate associated with Porcine circovirus type 2 (PCV2) is reported worldwide. PCV2 commercial vaccine was introduced in 2006 in U.S. and in 2008 in Brazil. Although PCV2 vaccines have been widely used, cases of PCV2 systemic disease have been reported in the last years. Eleven nursery or fattening pigs suffering from PCV2 systemic disease were selected from eight PCV2-vaccinated farms with historical records of PCV2 systemic disease in Southern Brazil. PCV2 genomes were amplified and sequenced from lymph node samples of selected pigs. The comparison among the ORF2 amino acid sequences of PCV2 isolates revealed three amino acid substitutions in the positions F57I, N178S and A190T, respectively. Using molecular modeling, a structural model for the capsid protein of PCV2 was built. Afterwards, the mutated residues positions were identified in the model. The structural analysis of the mutated residues showed that the external residue 190 is close to an important predicted region for antibodies recognition. Therefore, changes in the viral protein conformation might lead to an inefficient antibody binding and this could be a relevant mechanism underlying the recent vaccine failures observed in swine farms in Brazil.

Identification of circo-like virus-Brazil genomic sequences in raw sewage from the metropolitan area of São Paulo: evidence of circulation two and three years after the first detection

BACKGROUND Two novel viruses named circo-like virus-Brazil (CLV-BR) hs1 and hs2 were previously discovered in a Brazilian human fecal sample through metagenomics. CLV-BR hs1 and hs2 possess a small circular DNA genome encoding a replication initiator protein (Rep), and the two genomes exhibit 92% nucleotide identity with each other. Phylogenetic analysis based on the Rep protein showed that CLV-BRs do not cluster with circoviruses, nanoviruses, geminiviruses or cycloviruses. OBJECTIVE The aim of this study was to search for CLV-BR genomes in sewage and reclaimed water samples from the metropolitan area of São Paulo, Brazil, to verify whether the first detection of these viruses was an isolated finding. METHODS Sewage and reclaimed water samples collected concomitantly during the years 2005-2006 were purified and concentrated using methodologies designed for the study of viruses. A total of 177 treated reclaimed water samples were grouped into five pools, as were 177 treated raw sewage samples. Nucleic acid extraction, polymerase chain reaction (PCR) amplification and Sanger sequencing were then performed.e FINDINGS CLV-BR genomes were detected in two pools of sewage samples, p6 and p9. Approximately 28% and 51% of the CLV-BR genome was amplified from p6 and p9, respectively, including 76% of the Rep gene. The detected genomes are most likely related to CLV-BR hs1. Comparative analysis showed several synonymous substitutions within Rep-encoding sequences, suggesting purifying selection for this gene, as has been observed for other eukaryotic circular Rep-encoding single-stranded DNA (CRESS-DNA) viruses. MAIN CONCLUSION The results therefore indicated that CLV-BR has continued to circulate in Brazil two and three years after first being detected.

Circovírus suíno 2b: isolamento e taxa de mutação em linhagem de célula de macrófagos (J744) / Porcine circovirus 2b: isolations and mutation rate in J744 lineage macrophage cell

Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.

Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.

Influence of the inclusion of spray-dried animal plasma in weanling pigs' diet on porcine circovirus type 2 (PCV2) loads / Influência da inclusão do plasma sanguíneo na dieta de leitões desmamados sobre a carga viral de circovírus suíno tipo 2 (PCV2)

Spray-dried animal plasma (SDAP), a natural byproduct of the meatpacking industry, has been shown to have beneficial effects on growth and performance of weaned pigs. Porcine circovirus 2 (PCV2) is an important virus that is disseminated in the pork industry. Regardless of the studies evaluating the possible transmission of PCV2 through SDAP, there is no information about the effects of its inclusion in the PCV2 loads in natural infections. The present investigation evaluated the influence of dietary inclusion levels of SDAP in weanling pigs on PCV2 viremia and humoral immune response. Fifty-six weaned piglets were fed in a 2-period feeding program. Dietary treatments included 0%, 2%, 4% or 6% and 0%, 1%, 2% or 3% of SDAP during period 1 (14 to 28 days old) and 2 (29 to 42-days old), respectively. In period 3 (42 to 56 days old), all piglets received a SDAP-free diet. Serum samples were collected weekly and tested for PCV2 antibodies and DNA load. The results show that the concentration of 6% and 3% of SDAP on feed offered for pigs during period 1 and 2, respectively, may have decreased the PCV2 loads.(AU)

O plasma sanguíneo em pó (PSP), produto natural de indústria frigorífica, tem mostrado efeitos benéficos sobre o crescimento e desempenho de leitões desmamados precocemente. Atualmente, embora o circovírus suíno 2 (PCV2) tenha grande importância para a suinocultura, não há informações sobre o impacto do uso de PSP e a resposta imune ao PCV2 em infecções naturais. Este trabalho avaliou diferentes níveis de inclusão de PSP em dietas de leitões e as cargas virais de PCV2 correspondentes. Quatro níveis de inclusão de PSP foram testados em dois períodos consecutivos: 0, 2, 4 ou 6% durante o período 1 (14 aos 28 dias de idade) e 1, 2 ou 3% de PSP durante o período 2 (29 a 42 dias de idade). No período 3 (42 aos 56 dias de idade), todos os leitões foram alimentados com dieta isenta de PSP. Amostras de soro foram coletadas semanalmente e testadas para anticorpos anti-PCV2 e carga de DNA de PCV2. As concentrações de 6% e 3% de PSP fornecidas nas rações durante o período 1 e 2, respectivamente, influenciaram na carga viral de PCV2 de suínos naturalmente infectados.(AU)

Micoplasma hyopneumoniae associado ao circovírus suíno tipo 2 em plantéis não vacinados para micoplasmose / Mycoplasma hyopneumoniae associated with porcine circovirus type 2 in non-vaccinated herds for mycoplasmosis

A síndrome circovirose suína e doenças associadas (PCVAD) tem sido descrita em diversas regiões do mundo. Seu agente primário, o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), está associado a elevados índices de refugagem nas granjas e a vultuosos prejuízos econômicos. Diversos fatores de risco estão relacionados à manifestação dos quadros clínicos da síndrome, nomeadamente deficiências de manejo, presença de coinfecções e imunização diante do agente. Entre os agentes frequentemente relatados associados ao PCV2 está o Mycoplasma hyopneumoniae. Este estudo objetivou verificar a ocorrência de M. hyopneumoniae em animais diagnosticados estarem acometidos pela PCVAD, em sistemas intensivos de produção de suínos do estado de Goiás. Amostras de secreção nasal de 40 animais foram analisadas para a pesquisa do DNA de M. hyopneumoniae. Do total das amostras de secreção nasal, 6 (15%) foram positivas na reação em cadeia da polimerase (PCR) para o M. hyopneumoniae, apenas em granjas que não praticavam a vacinação contra esse agente. Os resultados relacionados à presença de micoplasma estão de acordo com os achados clínicos dos animais analisados que apresentavam sintomatologia de doenças respiratórias e lesões relacionadas ao trato respiratório. Este é o primeiro relato da associação de PCV2 com M. hyopneumoniae em suínos identificados com PCVAD no estado de Goiás.(AU)

Porcine circovirus associated diseases (PCVAD) have been reported around the world. They are associated with high culling rates and large economic losses. Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the primary causative agent. Several risk factors are related to the manifestation of clinical syndrome, including deficiencies of management, presence of co-infections and immunization against involved agents. Mycoplasma hyopneumoniae is often reported as an agent associated to PCV2 infections. The aim of this study was to verify the occurrence of M. hyopneumoniae in animals diagnosed with PCVAD in intensive pig farming systems in Goiás, Brazil. Forty nasal secretion samples were collected for M. hyopneumoniae DNA detection by polymerase chain reaction (PCR). Out of this, 6 (15%) were positive for M. hyopneumoniae DNA. All positive samples were collected from animals in non-vaccinated herds. Mycoplasma has been detected in animals showing clinical signs and lesions of respiratory diseases. To our knowledge, this is the first report of PCV2 association with M. hyopneumoniae in pigs with PCVAD identified in the state of Goiás, Brazil.(AU)

Circovírus suíno 2b: isolamento e taxa de mutação em linhagem de célula de macrófagos (J744) / Porcine circovirus 2b: isolations and mutation rate in J744 lineage macrophage cell

Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.(AU)

Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.(AU)

Porcine circovirus 2 (PCV2) increases the expression of endothelial adhesion/junction molecules

Abstract Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the primary causative agent of porcine circovirus disease, a complex multisystem syndrome in domestic pigs. Despite the significant economic losses caused by porcine circovirus disease, the mechanisms of pathogenesis underlying the clinical findings remain largely unclear. As various reports have highlighted the potential key role of vascular lesions in the pathogenesis of porcine circovirus disease, the aim of this work was to investigate effects of PCV2 infection on vascular endothelial cells, focusing on cell viability and expression of adhesion/junction molecules. PCV2 infection reduced endothelial cell viability, while viral infection did not affected the viability of several other classical cell lines. Also, PCV2 infection in endothelial cells displayed a dual/biphasic effect: initially, infection increased ICAM-1 expression, which can favor leukocyte recruitment and emigration to tissues and possibly inducing characteristic porcine circovirus disease inflammatory lesions; then, secondarily, infection caused an increase in zonula occludens 1 tight junction protein (ZO-1) expression, which in turn can result in difficulties for cell traffic across the endothelium and a potential impairment the immune response in peripheral tissues. These virus-induced endothelial changes could directly impact the inflammatory process of porcine circovirus disease and associated vascular/immune system disturbances. Data suggest that, among the wide range of effects induced by PCV2 on the host, endothelial modulation can be a pivotal process which can help to explain PCV2 pathogenesis in some porcine circovirus disease presentations.

A double-antibody sandwich ELISA based on the porcine circovirus type 2 (PCV2) propagated in cell culture for antibody detection / Sandwich ELISA com duplo anticorpo baseado no circovirus suíno tipo 2 (PCV2) produzido em cultivo celular para detecção de anticorpos

Few studies have described enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of antibodies against porcine circovirus type 2 (PCV2) based on antigens produced in cell culture. Furthermore, few articles have described viral purification techniques for members of the family Circoviridae. This occurs because circoviruses are difficult to isolate, noncytopathogenic, and produce low viral titres in cell culture. Thus, for overcoming these difficulties in the cultivation of PCV2, this study aimed to develop a double-antibody sandwich ELISA based on the cell culture antigen PCV2b for the quantification of anti-PCV2 antibodies. A 20% and 50% discontinuous sucrose cushion was used for viral purification, which enabled the separation of cell culture proteins in the 20% sucrose cushion and a greater viral concentration in the 50% sucrose cushion. Following isopycnic centrifugation, PCV2 was concentrated in the band with density values from 1.330 to 1.395g/cm3. Viral purification was assessed using SDS-PAGE, indirect ELISA and electron microscopy. The standardised ELISA revealed a strong linear correlation (r= 0.826, p<0.001) when compared with a commercial ELISA kit. The assay exhibited low variability (inter-assay coefficient of variation of 4.24% and intra-assay of 1.80%) and excellent analytical specificity conferred by the capture antibody produced in rabbit. Thus, this ELISA is a rapid, specific and convenient method for the detection of antibodies against PCV2 in studies of experimental and natural infection, and in monitoring the response to vaccination on commercial farms.(AU)

Há poucos relatos na literatura de métodos de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), para a detecção de anticorpos contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), baseados em antígenos produzidos em cultivo celular, bem como uma escassez de trabalhos descrevendo técnicas de purificação viral para os membros da família Circoviridae. Isso ocorre, pois os circovírus são de difícil isolamento, não causam efeito citopático e produzem um baixo título viral em cultivo celular. Assim, para superar essas dificuldades encontradas no cultivo do PCV2, este estudo objetivou desenvolver um sandwich ELISA com duplo anticorpo, baseado no antígeno de PCV2 produzido em cultivo celular, para a quantificação de anticorpos anti-PCV2. Um colchão de sacarose descontínuo a 20% e 50% foi utilizado para a purificação viral, o qual possibilitou a separação das proteínas oriundas do cultivo celular no colchão de sacarose a 20% e uma maior concentração viral no colchão de sacarose a 50%. Com a ultracentrifugação isopícnica, o PCV2 ficou mais concentrado na banda com valores de densidade de 1,330 a 1,395g/cm3. A purificação viral foi avaliada pelas técnicas de SDS-PAGE, ELISA indireto e microscopia eletrônica. Assim, o método de ELISA padronizado revelou uma forte correlação linear (r = 0,826, p <0,001) quando comparado com um kit de ELISA comercial. O ensaio demonstrou baixa variabilidade (coeficientes de variação inter-teste de 4,24% e intra-teste de 1,80%) e uma excelente especificidade analítica conferida pelo anticorpo de captura produzido em coelho. Portanto, o método de ELISA demonstrou ser rápido, específico e conveniente para a detecção de anticorpos contra o PCV2 em estudos de infecção natural e experimental, além da monitoria da resposta à vacinação contra o PCV2 em granjas comerciais.(AU)

Antibody response between pigs of Piau and a commercial breed naturally infected with Porcine circovirus 2 / Resposta sorológica entre suínos da raça Piau e linhagem comercial em rebanho naturalmente infectado pelo Porcine circovirus 2

Brazilian pig population is made up of several naturalized breeds; among them the Piau breed is known for its rusticity and large fat stores. The naturalized breeds, in comparison with commercial ones, may have an increased resistance to diseases circulating in their territory. Thus, this study aimed to verify if there are differences between the serologic profile against Porcine circovirus 2 (PCV2) of Piau pigs and that of a commercial breed from a farm naturally infected by PCV2. The serum viral load was measured by qPCR, and levels of anti-PCV2 antibodies were measured by ELISA. The results showed that the serum viral load was similar across all animals. However, Piau piglets showed higher levels of antibodies compared to commercial piglets (P= 0.05), while sows of the commercial breed showed higher levels than the Piau breed (P< 0.01). There was not a statistical difference between pigs of different production stages in the seroprevalence of PCV2 or the blood viral load. This work demonstrates that, with regard to a natural PCV2 infection, the Piau breed has a different humoral immune response compared to the response developed by the commercial pigs. The results support the importance of conservation of native breeds.(AU)

O rebanho de suínos brasileiro é constituído por diversas raças naturalizadas, entre elas a raça Piau, que é conhecida por sua rusticidade e pela grande deposição de toucinho. As raças naturalizadas, em comparação com as linhagens comerciais, podem ter uma maior resistência a doenças que circulam em seu território. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo verificar se existem diferenças no perfil sorológico contra o Porcine circovirus 2 (PVC2) entre suínos da raça Piau e de uma linhagem comercial de uma granja naturalmente infectada pelo PCV2. Foram realizadas mensurações da carga viral sérica por qPCR e dos níveis de anticorpos anti-PCV2 por meio da técnica de ELISA. Os resultados mostraram que a carga viral sérica se manteve homogênea em todos os animais e que os leitões da raça Piau apresentaram níveis de anticorpos superiores em comparação com os leitões da linhagem comercial (P=0,05), enquanto as porcas de linhagem comercial apresentaram níveis superiores aos da raça Piau (P<0,01). Este trabalho fornece indícios de que a raça Piau apresenta uma resposta imune humoral distinta diante de uma infecção natural pelo PCV2, quando comparada com a resposta desenvolvida pela linhagem comercial. Os resultados obtidos reforçam a importância da conservação das raças nativas.(AU)

The effects of sow viremia and maternal antibodies in porcine circovirus 2 on viral infection and weight of piglets / Efeito da viremia da porca e de anticorpos maternos para circovírus suíno 2 na infecção e no peso da leitegada

The aim of this study was to characterize the porcine circovirus 2 (PCV2) infections in farrowing sows and to evaluate an association with piglet viremia and weight. Twenty sows and 100 newborn piglets were studied. Colostrum and serum of the sows were obtained on the day of parturition. Milk samples were collected on day 20 postpartum. Blood samples were taken and the piglets were weighed on days 1, 20, 42, 63 and 84 postpartum. Colostrum, milk and serum were evaluated for PCV2 DNA load. Serum was evaluated for neutralizing antibodies. PCV2 DNA was found in 17/20 serum samples, 14/20 colostrum samples and 11/20 milk samples. On day 1 postpartum 29% of piglets were viremic. PCV2 viral load ranged from 3.02 to 6.75 log10 copies/mL considering all sampled days. There was no correlation between sow viremia, antibody levels or PCV2 load in colostrum and piglet viremia on day 1 postpartum. The PCV2 load in colostrum and milk was associated with viremia in piglets from weaning to 84 days postpartum. Piglets' PCV2 viremia and viral load could not be associated with weight throughout this study...

O objetivo deste estudo foi caracterizar o efeito do infecção pelo circovírus suíno 2 (PCV2) em porcas gestantes na viremia e no peso da leitegada. Vinte porcas e 100 leitões recém-nascidos foram acompanhados. Amostras de colostro e soro das porcas foram obtidas no dia do parto. Amostras de leite foram coletadas no dia pós-parto 20. Os leitões foram pesados e tiveram amostras de soro coletadas nos dias um, 20, 42, 63 e 84 pós-parto. Soro, colostro e leite foram testados para carga viral do PCV2. Soro foi avaliado para presença de anticorpos neutralizantes. O DNA do PCV2 foi encontrado em 14 de 20 amostras de colostro e em 11 de 20 amostras de leite. No dia pós-parto 1, 29% dos leitões foram virêmicos. A carga viral do PCV2 variou 3,02-6,75 log10 cópias / mL, considerando todos os dias amostrados. Não houve correlação entre viremia das porcas e os níveis de anticorpos no soro ou na carga de PCV2 no colostro e na viremia dos leitões com um dia de vida. A carga de PCV2 no colostro e no leite foi associada à viremia em leitões do desmame até 84 dias pós-parto. A carga viral do PCV2 em leitões não foi associada com o peso ao longo deste estudo...

Detection of genetic characterization of Porcine circovirus 2 (PCV2) in Brazilian wildlife boars

A semi-intensive wildlife boars farm presented a clinical history of high mortality in 70 - 90 days-old pigs (> 50 %). Two 90 days-old animals with weight loss and wasting were necropsied and the samples tested for PCV2 by polymerase chain reaction (PCR). The genetic material of PCV2 was sequenced and classified into the PCV2a genotype together with PCV2 sequences obtained from samples of Poland, Brazil, Slovenia and Greece wild boars.

Interstitial nephritis of slaughtered pigs in the State of Mato Grosso, Brazil / Nefrite intersticial em suínos abatidos no Estado de Mato Grosso

This study evaluated histological lesions in kidney samples from pigs with nephritis in two slaughterhouses in the State of Mato Grosso, Brazil. Four hundred samples were subjected to histology, anti-porcine circovirus type 2 (PCV2) immunohistochemistry (IHC), anti-Leptospira sp. immunofluorescence (IF), and polymerase chain reaction (PCR) for PCV2, porcine parvovirus (PPV), and Torque teno virus type 1 and 2 (TTV1, TTV2) detection. Histological lesions were found in 81% of the samples, and mononuclear interstitial nephritis was the most frequent lesion (77.50%). A follicular pattern was observed in 40.97% of the interstitial nephritis lesions. PCV2, PPV, TTV1, and TTV2 were identified in the kidneys by PCR in 27.25%, 28.50%, 94%, and 87.5% of the samples, respectively. Leptospira sp. was not detected through IF. Infection by PCV2 (PCR) and the presence of histological lesions (P=0.008) and giant cells (P=0.0016) were significantly associated. An association was observed between the TTV2-TTV1 co-infection (P<0.0001) and the risk for pathogenesis. These findings indicated that PCV2, PPV, TTV1, and TTV2 were widely distributed among pigs in the local farms and that the presence of these agents should be considered in the differential diagnosis of kidneys with interstitial nephritis in pigs.

O propósito desse estudo foi avaliar as lesões histológicas observadas em rins condenados por nefrite pelo Serviço de Inspeção Federal, em dois frigoríficos de Mato Grosso, Brasil. Foram coletados 400 rins condenados por nefrite e submetidos aos exames de histologia, imuno-histoquímica (IHC) para Circovirus suíno Tipo 2 (PCV2), imunofluorescência direta (IF) para Leptospira sp. e reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção de PCV2, Parvovirus suíno (PPV) e Torque teno vírus Tipo 1 e 2 (TTV1 e TTV2). Foram observadas lesões histológicas em 81% das amostras, sendo nefrite intersticial mononuclear a mais freqüente (77,50%). Das lesões de nefrite intersticial encontradas, 40,97% apresentaram padrão folicular. Através da PCR foi observada ampla distribuição dos agentes (PCV2, PPV, TTV1 e TTV2) nas propriedades e municípios, com ocorrência de 27,25%, 28,50%, 94% e 87,50%, respectivamente. Leptospira sp. não foi detectada através da IF. Houve associação significativa da infecção do PCV2 com presença de lesão histológica (P=0,008) e de células gigantes (P=0,0016). Também houve associação entre a co-infecção TTV2 e TTV1 (P<0,0001). Esses achados indicam que os vírus PCV2, PPV, TTV1 e TTV2 devem ser considerados no diagnóstico diferencial de rins com nefrite intersticial em suínos.

Retrospective study on Porcine circovirus-2 by nested pcr and real time pcr in archived tissues from 1978 in Brazil

Porcine circovirus-2 (PCV-2) infection is currently considered an important disease of swine. The pathogenic agent was first described in Brazil in 2000. This study detected the PCV-2 DNA in four Brazilian pig tissues collected between 1978 and 1979. This observation is the oldest description of this virus in Brazil.

Ultrastructural Identification of Circovirus in the Liver of Saffron Finch (Sicalis flaveola spp. ) / Identificación Ultrastructural de circovirus en el Hígado de Canarios Venezolanos (Sicalis flaveola spp. )

Circovirus are viral agents that cause disease in avian species. The main clinical symptoms of the disease are immunosuppression and, in young birds feather disorders. In neonates, the disease is known as "black spot" and characterized by abdominal enlargement, hepatobiliar congestion and failure to thrive. Also, it wasobserved in adult infected birds with other symptoms and clinical signs, such as enteritis, sinusitis, rhinitis, tracheitis, bronchopneumonia, myocarditis, nephritis, splenitis, dyspnea, anorexia, depression leading to high mortality. In April 2008, 317 saffron finch were apprehended during an illegal commercialization and were forwarded to the Wild Animals Recovery Center of the Tiete Ecological Park. Subsequently, 101 (31.66 percent) died and 20 of these were selected and sent to the Laboratory of Electron Microscopy, Biological Institute of São Paulo, Brazil to investigate possible etiological agents. After necropsy of these animals fragments of lung, liver and small intestine were processed using negative staining and resin embedding techniques. On the transmission electron microscopy, the negative staining technique allowed observation in 20 (100 percent) samples of liver suspension, a great number of particles with morphology similar to the circovirus, spherical, non-enveloped, isometric, characterized as "complete" and "empty ", measuring between 17 and 20 nm in diameter. By the resin embedding technique, oval or rounded viral intracytoplasmatic inclusion bodies, containing viral particles disposed in paracrystalline arrays or loose arrangements were observed in ultrathin sections on the 20 (100 percent) samples of liver suspension. This is the first report on the presence of circovirus in saffron finch (Sicalis flaveola spp.).

Circovirus son agentes virales que causan enfermedad en las aves. Los principales síntomas clínicos de la enfermedad son la inmunosupresión y desórdenes en las plumas de aves jóvenes. En los recién nacidos la enfermedad se conoce como "punto negro" y se caracteriza por distensión abdominal, congestión hepatobiliar y falla en el desarrollo. También se han observado en las aves adultas infectadas, otros síntomas y signos clínicos, tales como la enteritis, sinusitis, rinitis, traqueitis, bronconeumonía, miocarditis, nefritis, esplenitis, disnea, anorexia, depresión llevando también a alta mortalidad. En abril de 2008, durante una comercialización ilegal, fueron confiscados 317 canarios venezolanos, siendo llevados al Centro de Rehabilitación de Animales Silvestres del Parque Ecológico de Tietê. Posteriormente, 101 (31,66 por ciento) aves murieron y entre éstas fueron seleccionadas 20 y enviadas al Laboratorio de Microscopía Electrónica, Instituto Biológico de São Paulo, para identificar el posible agente etiológico. Después de la necropsia, fragmentos de pulmón, hígado e intestino delgado se procesaron mediante las técnicas de tinción negativa y de inclusión en resina. A través de microscopía electrónica de transmisión, la técnica de tinción negativa permitió visualizar en las 20 muestras (100 por ciento) de suspensión del hígado, un gran número de partículas con morfología similar al circovirus, esférico, sin envoltura, isométrico, que se caracteriza como "completa" y "vacío", que miden entre 17 y 20 nm de diámetro. Mediante la técnica de cuerpos de inclusión en resina se observó en el 100 por ciento de las muestras de suspensión de hígado, cuerpos de inclusión virales intracitoplasmáticos, redondeadas u ovales, con partículas de virus dispuestos en matrices paracristalinas o sueltas en los cortes ultrafinos. Este es el primer reporte de la presencia de circovirus en canarios Venezolanos (Sicalis flaveola spp.).

Perfil sorológico, viremia e eliminação do circovírus suíno tipo 2 em animais naturalmente infectados pertencentes a granjas com ou sem a síndrome da refugagem multissistêmica / Serological profile, viremia and PCV2 shedding in naturally infected pigs of herds with or without postweaning multisystemic wasting syndrome

Um estudo virológico e sorológico seccional (E1) e outro longitudinal (E2) foram realizados em granjas com (G2 e G3) e sem (G1) a síndrome de refugagem multissitêmica (SRM) no Brasil. Foram coletadas amostras de sangue, soro, swabs nasal e retal de animais de cada categoria do ciclo produtivo: porcas, leitões maternidade, creche, recria e terminação. Em E1, nas granjas G1a e G2, foram amostrados 40 animais de cada categoria. Em E2, nas granjas G1b e G3, 35 leitões na maternidade foram identificados e amostrados ao longo do ciclo produtivo. O soro foi avaliado para presença de anticorpos contra circovírus suíno tipo 2 (CVS2) e sangue e swabs para presença do ácido nucléico viral. Em E1, a categoria porcas possuía altas taxas de animais virêmicos e soropositivos, com porcentagem de porcas com títulos altos superior a G2. Em G1a a queda de imunidade passiva ocorreu entre o final da fase de creche e início da recria com aumento da eliminação viral em swabs e subsequente soroconversão. Em G2 a queda ocorreu entre a fase final da maternidade e início da creche, com diminuição da eliminação viral. Em E2, a queda da imunidade materna ocorreu entre a 1ª e 2ª coleta em G1b; e em G3, entre a 2ª e 3ª coleta. Em ambas as granjas, a queda de imunidade passiva coincidiu com o aumento da viremia e eliminação viral e a soroconversão ocorreu entre a 3ª e 4a coleta em ambas as granjas com aumento da média de título de anticorpos e declínio da viremia. Viremia e eliminação viral foram detectadas em todas as coletas realizadas; 42% dos animais amostrados em E2 foram virêmicos em todas as coletas e todas as amostras de tecido coletadas no abate foram positivas para o CVS2. Este estudo confirma a persistência da viremia mesmo em presença de altos títulos de anticorpos e que o perfil sorológico em um rebanho com e sem a presença da síndrome pode ser diferente, principalmente em relação à duração da imunidade passiva.

A virological and serological cross-sectional study (E1) and a longitudinal study (E2) were performed on herds with (G2 and G3) and without (G1) post weaning multisystemic syndrome (PMWS) in Brazil. Blood, serum, nasal and rectal swabs samples were collected of sows, farrowing piglets, nursery, growing and finishing pigs. In E1, were sampled 40 animals in each category (G1a and G2). In E2, (G1b and G3), 35 farrowing piglets were identified and sampled along the production cycle. Porcine circovirus type 2 (PCV2) antibodies were assayed. A PCR was used to detected PCV2 genome in blood and swabs. In E1, sows had high rates of viremic and seropositives animals, with percentage of sows with high antibodies titers greater than G2. Passive antibodies decline occurred between nursery and growing area with increased viral shedding in swabs and subsequent seroconversion in G1. In G2, the passive antibodies decay occurred in nursery, with a reduction in viral shedding. In E2, the decline of maternal immunity occurred between the 1st and 2nd collection in G1b, and between 2nd and 3rd collections in G3. In both herds, the decay of passive immunity coincided with increased viremia and viral shedding; and seroconversion occurred between the 3rd and 4th collection in both herds with decline of viremia. Viremia and viral shedding was detected in all samples days, 42% of animals sampled in E2 were viremic and all tissue samples collected at slaughterwere positive for PCV2. This study confirms the persistence of viremia even in the presence of high titers of antibodies and the serological profile in a herd with or without PMWS may be different, especially with regard to the passive immunity duration.

Detection and dynamics of porcine circovirus 2 shedding in semen using conventional and real-time PCR / Deteccão e dinâmica de excreção do circo vírus porcino tipo 2 no semen pelo PCR convencional e PCR em tempo real

The dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) shedding in semen of naturally infected boars was studied. Semen was collected serially each 15 or 20 days during 62 days from 5 boars from a herd and from 11 boars from an artificial insemination center. All boars were positive for PCV2 DNA by nested polymerase chain reaction of raw semen in at least two sampling dates, and most of them had detectable shedding in all sampling dates. Real-time quantitative PCR was performed in 23 samples. All samples showed low amounts of PCV2 DNA, ranging from 98 to 652 PCV2 copies/mL. No differences between the frequencies of PCV2 DNA shed in semen were found considering herds and age of boars. PCV2 shedding in the semen can occur continuously or intermittently up to 60 days in naturally infected boars at 12 to 42 months old in absence of PCV2 clinical signs. These results demonstrate sporadic and long-term shedding patterns of low amounts of PCV2 DNA in semen from naturally infected boars.

A dinâmica da excreção do circovírus suíno tipo 2 (CVS2) em sêmen de machos naturalmente infectados foi estudada. Amostras de sêmen de cinco machos de um plantel e de 11 machos de um centro de inseminação artificial foram coletadas a cada 15 ou 20 dias durante 62 dias. Todos os machos testados foram positivos para a presença do DNA viral no sêmen em pelo menos duas coletas, sendo que a maioria deles eliminou o CVS2 em todas as coletas. O teste de PCR quantitativa em tempo real foi aplicado em 23 amostras. Todas as amostras tinham baixa quantidade de DNA viral, variando de 98 a 652 cópias de CVS2/ml. Não houve diferença na freqüência de eliminação do DNA viral levando em conta os plantéis e idade dos machos. A excreção do CVS2 no sêmen pode ocorrer de forma contínua ou intermitente por mais de 60 dias em machos de 12 a 42 meses de idade naturalmente infectados na ausência de sinais clínicos de CVS2. Estes resultados demonstram padrões esporádico e de longa duração de excreção viral em pequenas quantidades no sêmen de varrões naturalmente infectados.

The cap gene of porcine circovirus type 2 (PCV2) evolves by positive selection in vitro / O gene cap de circovírus suíno tipo 2 (PCV2) evolui por seleção positiva in vitro

This article reports the genetic divergence of PCV2 after passages in VERO and SK-RST cell lines. Fisher’s exact test indicated a trend for positive selection on the cap gene. These results allow insights on the development of PCV2 vaccines and the evolution of the genus Circovirus.

Este artigo relata a divergência genética de PCV2 após passagens em células das linhagens VERO e SK-RST. O teste exato de Fisher indicou tendência para seleção positiva no gene cap. Estes resultados permitem inferências relativas ao desenvolvimento de vacinas contra PCV2 e sobre a evolução do gênero Circovirus.