L-DOPA extradiol dioxigenase de amanita muscaria: revisão da sequência codificadora, expressão heteróloga, caracterização funcional e contextualização filogenética / Amanita muscaria L-DOPA extradiol dioxygenase: coding sequence review, heterologous expression, functional characterization, and phylogenetic context

Extradiol dioxigenases são enzimas que catalisam a clivagem oxidativa de ligações C-C entre grupos hidroxila fenólicos adjacentes utilizando catecóis como substratos. Esta classe de enzimas é bem caracterizada em bactérias, onde catalisam a degradação de compostos aromáticos. Na maioria das plantas Caryophyllales, como a beterraba, primavera e a maravilha, L-3,4-diidroxifenilalanina (L-DOPA) extradiol dioxigenases (DODAs) catalisam a clivagem oxidativa de L-DOPA na posição 4,5 gerando o ácido betalâmico, aldeído precursor das betalaínas, uma classe de pigmentos naturais que substitui as antocianinas na pigmentação dessas espécies. Alguns fungos basidiomicetos também produzem betalaínas, como o agário-das-moscas (Amanita muscaria). Nesse organismo, DODA é capaz de catalisar uma clivagem adicional na posição 2,3 da L-DOPA, formando muscaflavina, um isômero do ácido betalâmico que dá origem a uma outra classe de pigmentos naturais: as higroaurinas. Desde a caracterização do gene dodA, o qual codifica para a DODA de A. muscaria (AMAMU), não existem relatos na literatura que explorem a promiscuidade catalítica desta enzima, sua relação com outras linhagens de DODAs e a síntese quimioenzimática de betalaínas a partir desta enzima. Dessa forma, buscamos contextualizar as relações filogenéticas e funcionais entre AMAMU e diferentes linhagens de DODAs, bem como estabelecer um método que viabilize a clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional destaenzima. As análises filogenéticas revelaram que AMAMU possui uma evolução convergente com DODAs de plantas e bactérias e que, apesar de AMAMU ser funcionalmente homóloga à DODA da bactéria Escherichia coli, esta última apresenta homologia com DODAs de plantas. Logo, não há uma relação direta entre a sequência primária de DODAs e sua função. Nós também demonstramos que não há uma relação entre a expressão de transcritos de BvDODA1, e de seu parálogo BvDODA2, e a diferença de pigmentação entre variedades de beterrabas amarelas e vermelhas. A clonagem da sequência codificadora (CDS) publicada para o gene dodA de A. muscaria resultou na retenção do primeiro íntron, o que impedia a sua expressão. Então, uma nova CDS de 558 nucleotídeos foi proposta para este gene, a qual inclui um códon de início da tradução que se mantém na fase de leitura e codifica para uma proteína de 185 resíduos, 43 a menos que AMAMU. A expressão desta CDS resultou na proteína recombinante AmDODA, capaz de catalisar a síntese de ácido betalâmico e muscaflavina a partir de L-DOPA e D-DOPA. AmDODA possui um tamanho aproximado de 22 kDa, com um pH ótimo de atividade de 8,5 e uma constante de Michaelis (KM) de 3,7 ± 0,9 mmol L-1 e de velocidade máxima (Vmax) de 3,3 ± 0,4 µ mol min-1 mg-1. Sua utilização foi demonstrada na síntese quimioenzimática de betalaínas-modelo com potencial aplicação como sondas para microscopia confocal de fluorescência de dois fótons. Neste contexto, esta Tese explora os aspectos moleculares, bioquímicos e biológicos da DODA do fungo A. muscaria e traz importantes contribuições acerca da pigmentação por betalaínas na natureza

Extradiol dioxigenases are enzymes that catalyze the oxidative cleavage of C-C bonds between adjacent phenolic hydroxyl groups using catechols as substrates. This class of enzymes is well characterized in bacteria, where they catalyze the degradation of aromatic compounds. In most plants of the Order Caryophyllales, such as beet, paperflower and four o'clock flower, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) extradiol dioxygenases (DODAs) catalyze the oxidative 4,5-cleavage of L-DOPA generating the betalamic acid, an aldehyde precursor of the betalains, a class of natural pigments that replaces anthocyanins in the pigmentation of these species. Some basidiomycete fungi also produce betalains, such as the fly agaric (Amanita muscaria). In this organism, DODA is able to catalyze an additional 2,3-cleavage of L-DOPA, yielding muscaflavine, an isomer of betalamic acid that gives rise to another class of natural pigments: the hygroaurins. Since the characterization of the dodA gene, which encodes the A. muscaria DODA (AMAMU), there are no reports in the literature that explore the catalytic promiscuity of this enzyme, its relation to other DODAs and the chemoenzymatic synthesis of betalains from this enzyme. Thus, we seek to contextualize the phylogenetic and functional relationships between AMAMU and different DODA lineages, as well as to establish a method that enable the cloning, heterologous expression and functional characterization of this enzyme. Phylogenetic analysis revealed that AMAMU has a convergent evolutionwith plant and bacterial DODAs and that although AMAMU is functionally homologous to the DODA of the Escherichia coli bacteria, this latter is homologous to the plant DODAs. Therefore, there is no direct relationship between the primary sequence of DODAs and their function. We have also shown that there is no relationship between the expression of BvDODA1 transcripts, and its BvDODA2 paralogue, and the pigment difference between yellow and red beet varieties. Cloning of the published coding sequence (CDS) for the dodA gene of A. muscaria resulted in the retention of the first intron, which prevented its expression. Then, a new CDS of 558 nucleotides was proposed for this gene, which includes a translation start codon that remains in the open reading frame and encodes for a protein 185 residues long, 43 less than AMAMU. Expression of this CDS resulted in the recombinant AmDODA protein, able to catalyze the synthesis of betalamic acid and muscaflavine from L-DOPA and D-DOPA. AmDODA has an approximate size of 22 kDa, with an optimum activity pH of 8.5 and a Michaelis constant (KM) of 3.7 ± 0.9 mmol L-1 and a maximum velocity (Vmax) of 3.3 ± 0.4 µmol min-1 mg-1. Its use was demonstrated in the chemoenzymatic synthesis of betalains-model with potential application as probes for confocal microscopy of two-photon fluorescence. In this context, this thesis explores the molecular, biochemical and biological aspects of the DODA of the fungus A. muscaria and brings important contributions about the pigmentation by betalains in nature

Chemistry Inspired by the Colors of Fruits, Flowers and Wine

ABSTRACT An overview is provided of the status of research at the frontiers of investigation of the chemistry and photochemistry of two classes of natural plant pigments, the anthocyanins and the betalains, as well as of the pyranoanthocyanin pigments formed from anthocyanins during the maturation of red wine. Together, anthocyanins and betalains are responsible for almost all of the red, purple and blue colors of fruits and flowers and anthocyanins and pyranoanthocyanins are major contributors to the color of red wines. All three types of pigments are cationic below about pH 3, highly colored, non-toxic, reasonably soluble in water or alcohol and fairly stable to light. They exhibit good antioxidant or antiradical activity and, as part of our diet, confer a number of important health benefits. Systematic studies of model compounds containing the basic chromophoric groups of these three types of pigments are providing a deeper understanding of the often complex chemistry and photochemistry of these pigments and their relationship to the roles in vivo of these pigments in plants. These natural pigments are currently being exploited as starting materials for the preparation of novel semi-synthetic dyes, pigments and fluorescence probes.

Evaluación de la capacidad antioxidante, características fisicoquímicas y perfil sensorial de Opuntia robusta y O. ficus-indica / Evaluation of antioxidant capacity, physicochemical characteristics and sensory profile of Opuntia robusta and O. ficus-indica

Las Opuntia spp. son un recurso fitogenético Mexicano de gran valor nutritivo y alto contenido de betalaínas, compuestos conocidos por sus propiedades antioxidantes. Este estudio evaluó las características fisicoquímicas, el contenido de betalaínas y su capacidad antioxidante (CA), así como el perfil sensorial de frutos de O. robusta y O. ficusindica. Esta última presentó mayor acidez y contenido de sólidos solubles (F= 769,2; P= 0,0001), (F= 360,4; P ≤0,0001), que O. robusta. En humedad y contenido de cenizas no hubo diferencias significativas entre ambas especies. La concentración de betalaínas fue superior en Opuntia robusta (F=529,1; P= ≤0,0001) betacianinas (0,114 mg/mL pulpa) y betaxantinas (0,073 mg/ mL de pulpa), en O. ficus-indica (0,023 mg/ mL de pulpa y 0,0198 mg/ mL de pulpa). Se encontraron diferencias significativas en la CA (F=545,9; P ≤0,0001), en O. ficus-indica hasta 195,38 µmol equivalente Trolox/ mL por el método Ácido2, 2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina)6-sulfónico (ABTS) y 22% de inhibición de radicales libres por el método 2,2 difenil-1-pricrilhidrazilo (DPPH), para O. robusta 165,6 µmol equivalente Trolox/ mL y más del 36% de inhibición de radicales libres. Los resultados mostraron que la CA está directamente relacionada con la concentración de betacianinas y betaxantinas. Ambas variedades de Opuntia exhiben una tendencia a lo dulce y ácido, con aromas, sabores y resabios con notas frutales y vegetales. Estos resultados sugieren que estas especies pueden ser empleadas para la extracción de betalaínas debido a su gran potencial para utilizarse en la industria como fuente de pigmentos naturales con propiedades antioxidantes y agradables características sensoriales(AU)

Opuntia spp. are a Mexican phytogenetic resource with great nutritive value and high betalains (compounds known for their antioxidant properties) content. Our main goal was to evaluate the physicochemical characteristics, betalains concentration and antioxidant capacity (AC), as well as sensory profiles of Opuntia robusta and O. ficus-indica, where the later one showed higher acidity and soluble solids content (F= 769.2; P= 0.0001 and F= 360.4; P ≤0.0001 respectively) than O. robusta. There was no significant difference between the species in terms of humidity and ash content. Betalains concentrations were higher in Opuntia robusta (F=529.1; P= ≤0.0001), while betacyanins (0.114 mg/ mL pulp) and betaxantins (0.073 mg/ mL de pulp) were higher in O. ficus-indica (0.023 mg/ mL pulp and 0.0198 mg/ mL de pulp). Significant differences for AC were found (F=545.9, P ≤0.0001), with O. ficus-indica showing up to 195.38 µmol Trolox equivalent / mL by the method 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 22% of free radicals inhibition by the method 2, 2 diphenyl-1-pricrylhydrazyl (DPPH), while 165.6 µmol Trolox equivalent / mL and more than 36% free radicals inhibition were found for O. robusta. Results showed that the antioxidant capacity is directly related with betacyanins and betaxantines concentration. Both Opuntia varieties exhibit a tendency to sweetness and acidity, with aromas, flavors and scents within fruity and vegetable notes. These results suggest that both species could be used in the extraction of betalains due to their great industrial potential as a source of natural pigments with antioxidant properties and pleasant sensorial characteristics(AU)

Production of pigments in Alternanthera sessilis calli mediated by plant growth regulators and light / Produção de pigmentos em calos de Alternanthera sessilis mediados por reguladores de crescimento e luz

Among the compounds produced by plants, pigments such as betalains have received attention from both food and pharmaceuticals industries. The Alternanthera sessilis species produces these pigments, though in small quantities, and so it is necessary to increase production. Thus, many studies use elicitors that are capable of triggering physiological or morphological responses in plants. The objective was to establish callus production in A. sessilis grown under different combinations of growth regulators and light qualities and to assess whether these factors can increase betalain and flavonoid production. Leaf and internodal explants in MS medium with different growth regulators were used to obtain calli, which were subsequently transferred to a betacyanin induction medium remaining for 40 days under different light qualities (white, blue, red, and dark). The most suitable treatment for callus formation and subsequent betalain and flavonoid induction was to combine a medium containing 6.7 µmol L-1 2,4-D and 9.0 µmol L-1 BAP and blue light. Physical elicitation by light combined with appropriate concentration of growth regulators on calli can increase production of commercially important metabolites.

Dentre os compostos produzidos pelas plantas, os pigmentos, como as betalaínas, vêm recebendo destaque tanto pela indústria alimentícia como farmacêutica. A espécie Alternanthera sessilis produz esses pigmentos, porém em pequenas quantidades, sendo necessário incrementar a produção. Para isso, muitos estudos utilizam elicitores que são capazes de desencadear respostas fisiológicas ou morfológicas nas plantas. O objetivo do trabalho foi estabelecer a produção de calos de A. sessilis crescidos quando submetidos a diferentes combinações de reguladores de crescimento e qualidades de luz, e avaliar se esses fatores são capazes de incrementar a produção de betalaínas e flavonoides. Foram utilizados explantes foliares e internodais em meio MS com diferentes reguladores de crescimento para obtenção dos calos que, posteriormente, foram transferidos para meio de indução de betacianina, onde permaneceram por 30 dias sob diferentes qualidades de luz (branca, azul, vermelha e escuro). O tratamento mais propício para formação de calos e consequente indução de betalaínas e flavonoides foi a combinação do meio contendo 6,7 µmol L-1 2,4-D e 9,0 µmol L-1 BAP e a luz azul. Conclui-se que a elicitação física pela luz em conjunto com a concentração adequada de reguladores de crescimento em calos é capaz de incrementar a produção de metabólitos de interesse comercial.

Mecanismos moleculares da interação entre betalaínas cumarínicas fluorescentes e células de glioma humano / Molecular mechanisms of interaction between fluorescent coumarinic betalains and human glioma cells

Moléculas orgânicas fluorescentes são uma importante ferramenta para biologia celular. Compostos ideais para esta aplicação devem ter alto brilho (produto do coeficiente de atenuação molar e do rendimento quântico de fluorescência), ser fotoestáveis e internalizáveis, não comprometer a viabilidade celular e interagir com biomoléculas com algum grau de especificidade. Nesta Tese de Doutorado é apresentado o estudo do uso de cBeet120, uma betalaína cumarínica artificial, e células de glioma humano da linhagem U87-MG. Betalaínas são pigmentos de plantas que apresentam alta biocompatibilidade que servem como material de partida para o desenvolvimento de derivados funcionais. A sonda se acumula principalmente no núcleo das células U87- MG e marca principalmente nucléolos via interação com proteínas. A presença de DNAse ou RNAase elimina a marcação nuclear, sem afetar a fraca marcação citoplasmática de fundo. Estudos de inibição de transporte sugerem que cBeet120 é internalizada por transportadores de L-glutamato da família de transportadores de amino ácidos excitatórios (EAAT). O uso de artemisinina para inibição Ca2+-ATPases aumenta a velocidade de internalização de cBeet120 em células U87-MG. Quando irradiada com luz de cor ciano, cBeet120 no interior do núcleo de células vivas é fotoativada, resultando em um aumento da intensidade de fluorescência com o tempo (monitorado por 90 min) e o deslocamento hipsocrômico do máximo de emissão. Em células fixadas com paraformaldeído, o padrão de marcação da célula se torna mais difuso e a sonda emite fluorescência sem fotoativação. Medidas de tempo de vida de fluorescência em solução e imageamento por microscopia de tempo de vida de fluorescência permitem inferir a ocorrência da formação de um complexo proteína-cBeet120 ou um produto de transiminação que pode estar sujeito a isomerização cis/trans

Fluorescent organic molecules are an important tool for cell biology. Ideal compounds for this application must have high brightness (product of the molar attenuation coefficient and fluorescence quantum yield), be photostable and internalizable by cells, do not compromise cellular viability and interact with biomolecules with some degree of specificity. In this Doctorate Thesis, we describe the interaction of cBeet120, an artificial coumarinic betalain, and human glioma cells of line U87-MG. Betalains are plant pigments that exhibit high biocompatibility that serve as starting material for the development of functional derivatives. The probe accumulates mainly in the nucleus of the U87-MG cells and mainly marks nucleoli via interaction with proteins. The presence of DNAse or RNAase eliminates nuclear labeling, without affecting the poor background cytoplasmic labeling. Transport inhibition studies suggest that cBeet120 is internalized by L-glutamate transporters from the excitatory amino acid transporter (EAAT) family. The use of artemisinin for inhibition Ca2+-ATPases increases the rate of cBeet120 internalization in U87-MG cells. When irradiated with cyan colored light, cBeet120 within the nucleus of living cells is photoactivated, resulting in an increase in fluorescence intensity over time (monitored for 90 min) and the hypochromic shift of the emission maximum. In cells fixed with paraformaldehyde, the labeling pattern of the cell becomes more diffuse and the probe emits fluorescence without photoactivation. Fluorescence life-time measurements in solution and fluorescence life-time imaging microscopy allows to infer the occurrence of the formation of a protein-cBeet120 complex or the formation of a transimination product that may be subject to cis/trans isomerization