Enfermedad granulomatosa crónica: fisiopatología genética y molecular. Pruebas diagnósticas vigentes / Chronic granulomatous disease: genetic and molecular pathophysiology. Effective diagnostic tests

Introducción: La enfermedad granulomatosa crónica es una inmunodeficiencia primaria congénita del sistema inmune innato, originada por defectos en el complejo enzimático nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa presente en células fagocíticas. Estos defectos funcionales causan incapacidad para producir especies reactivas del oxígeno en los fagocitos, que afectan la eliminación de algunos microorganismos patógenos dentro del fagolisosoma. El diagnóstico de esta enfermedad se realiza actualmente mediante la prueba de 1,2,3-dihidrorodamina asistida por citometría de flujo multiparamétrica, o la tinción de fagocitos con nitroazul de tetrazolio asistida por microscopio óptico. Objetivos: Describir los aspectos fisiopatológicos y moleculares de la enfermedad granulomatosa crónica; y discutir aspectos relacionados con las pruebas de diagnóstico antes mencionadas. Métodos: Se realizó una investigación bibliográfica-documental a partir de artículos científicos publicados desde 1933 hasta 2018, para ello fueron consultadas las bases de datos SciELO, PubMed y Springer. Desarrollo: Se exponen las características fisiopatológicas de la enfermedad granulomatosa crónica, así como la relación entre las mutaciones genéticas más abundantes en la población afectada y la gravedad de las manifestaciones clínicas que presentan los pacientes. Además, se analizan críticamente los beneficios y las deficiencias de dos técnicas que se utilizan actualmente para diagnosticar la enfermedad. Conclusiones: La enfermedad granulomatosa crónica puede generar consecuencias inmunológicas e inflamatorias graves, que se hallan en consonancia con las características genéticas expresadas en el complejo enzimático dañado. El diagnóstico de la enfermedad resulta más confiable, exhaustivo y específico, mediante la citometría de flujo y su prueba de 1,2,3-dihidrorodamina(AU)

Introduction: Chronic granulomatous disease is a congenital primary immunodeficiency of the innate immune system, caused by defects in the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase enzyme complex present in phagocytic cells. These functional defects cause inability to produce reactive oxygen species in phagocytes, affecting the elimination of some pathogenic microorganisms within the phagolysosome. The diagnosis of this disease is currently made by means of the 1,2,3-dihydrorodamine test assisted by multiparametric flow cytometry, or the staining of phagocytes with nitro-blue tetrazolium assisted by light microscopy. Objectives: To characterize molecular and pathophysiologically the chronic granulomatous disease; and to discuss aspects related to the aforementioned diagnostic tests. Methods: In this work, a bibliographic-documentary research was carried out from scientific articles published from 1933 to 2018, for which the SciELO, PubMed and Springer databases were consulted. Development: The pathophysiological characteristics of chronic granulomatous disease are exposed, as well as the relationship between the most abundant genetic mutations in the affected population, and the severity of the clinical manifestations presented by the patients. In addition, the benefits and deficiencies of two techniques currently used to diagnose the disease are critically analyzed. Conclusions: Chronic granulomatous disease can generate severe immunological and inflammatory consequences, which are in line with the genetic characteristics expressed in the damaged enzyme complex. The diagnosis of the disease is more reliable, exhaustive and specific, using flow cytometry and its 1,2,3-dihydrorodamine test(AU)

Comparação entre duas metodologias para a realização do teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) em caprinos / Comparison among two methodologys at realization nitroblue tetrazolium reduction test (NBT) in caprines

O teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) é um dos métodos mais utilizados para a avaliação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Porém, o custo por amostra e o tempo de utilização do corante são desvantagens do método. O objetivo deste trabalho foi comparar duas metodologias para realização do teste do NBT a fim de maximizar a sua utilização e diminuir o custo por amostra processada. Foram utilizadas 10 cabras, adultas clinicamente sadias e colhidas amostras de sangue por meio de venipunção jugular em tubos de 10mL sendo retirada uma alíquota de 500µL em tubo "eppendorff" contendo 2µL de heparina. Através desta alíquota foram realizadas três metodologias para o teste do NBT: A) técnica original Park & Good (1970); B) redução de 50% do volume do corante; C) redução de 50% e armazenamento do corante a -20°C por 180 dias. Foram confeccionados e corados esfregaços sanguíneos (May Grünwald-Giemsa) das amostras com as metodologias propostas e realizada contagem de 100 neutrófilos em microscopia óptica para determinar o percentual de neutrófilos reativos ao NBT. A análise estatística pelo método de Análise de Medidas Repetida (ANOVA) demonstrou diferenças significativas (P<0,05) entre os dois métodos e o original (A=14,4±4,6; B=1,9±1,4; C=1,1±0,9), porém apresentou alta correlação pelo teste de Spearman entre os métodos (rs=0,82 (AxB), rs=0,75 (BxC) e rs=0,93 (AxC)). Conclui-se que o teste de Redução do Tetrazólio Nitroazul (NBT) segundo a metodologia descrita por Park & Good (1970) e a redução do corante em 50% do seu volume e a sua redução associada ao congelamento por 180 dias a -20ºC podem ser realizadas em caprinos, porém os valores devem ser comparados com as respectivas metodologias utilizadas.(AU)

The nitroblue tetrazolium reduction test (NBT) is one of the most used methods to evaluate the oxidative metabolism of neutrophils. However, the cost for each sample and dye's life-time are disadvantages of the method. This paper aim was to compare two NBT test methodologies in order to maximize its use and decrease the cost for each sample. It was made using 10 adult and healthy goats and blood samples were taken through venipuncion in jugular vein, using 10mL tubes, and then a 500µL sample was taken in eppendoff tubes with 2µL of heparin. Using this sample were made three methodologies for the NBT test: A) Park & Good (1970) original technique; B) dye reduction in 50% of the volume; C) 50% reduction and dye storage at -20°C for 180 days. It was made and dyed the blood smear (May Grünwald-Giemsa) from the samples, using the proposed methodologies and then made the counting of 100 neutrophils in optic microscopy, to determinate the percentage of NBT reactive neutrophils. The statistic analysis by the method of Repeated Measuring Analysis (ANOVA) evinced significant differences (P<0,05) between the two methods and the original (A=14.4±4.6; B=1.9±1.4; C=1.1±0.9), however it showed high correlation by the Spearman test between the methods (rs=0,82 (AxB), rs=0,75 (BxC) e rs=0.93 (AxC)). It was concluded that the original Park & Good (1970) method and two methodologies for dye reduction in 50% and it's reduction associated with NBT dye freezing for 180 days can be used in caprines, but the values should be compared with their respective methodologies.(AU)

Leucograma e metabolismo oxidativo de neutrófilos em cabras da raça Saanen nos períodos de gestação, parto e pós-parto / Leukocyte count and neutrophil oxidative burst in Saanen goats in the pregnancy, parturition and postpartum periods

O presente estudo teve como objetivo a avaliação do leucograma e do metabolismo oxidativo de neutrófilos em fêmeas caprinas da raça Saanen, nos períodos de gestação, parto e pós-parto. Amostras de sangue foram colhidas de 20 fêmeas nulíparas da raça Saanen, clinicamente sadias por venipunção jugular aos 49 (M1), 42 (M2), 35 (M3), 28 (M4), 21 (M5), 14 (M6), sete (M7), três (M8) dias antes do parto, no dia do parto (M9), três (M10) e sete (M11) dias após o parto, para a realização do leucograma e dosagens séricas de cortisol, estradiol e progesterona. A partir de 28 dias (M4) antes do parto até sete dias do pós-parto (M11) foram colhidas amostras de sangue para a avaliação do metabolismo oxidativo de neutrófilos por meio do teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT). Os resultados demonstraram que no dia do parto houve aumento nas concentrações séricas de cortisol e estradiol, e diminuição da progesterona, leucocitose por neutrofilia e desvio à esquerda leve, diminuição dos linfócitos, aumento da relação neutrófilo:linfócito, eosinopenia, monocitose e basofilia. No sétimo dia do pós-parto houve leucocitose por neutrofilia e aumento da relação neutrófilo:linfócito. Não houve nos períodos de gestação, parto e pós-parto alterações significativas no metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Conclui-se que o parto determina elevação da concentração sérica de cortisol e estradiol, e diminuição da progesterona determinando quadro de leucocitose por neutrofilia e desvio à esquerda leve, com diminuição dos linfócitos, aumento da relação neutróflo:linfócito, eosinopenia, monocitose e basofilia. Ao sétimo dia do pós-parto há leucocitose por neutrofilia, aumento da relação neutrófilo:linfócito e do fibrinogênio. A gestação, o parto e o período do pós-parto não alteram o metabolismo oxidativo de neutrófilos avaliado por meio do teste de redução do NBT.

The purpose of this study was to evaluate the leukocyte count and the oxidative metabolism of neutrophil in Saanen goats during periods of pregnancy, parturition and postpartum. Were used 20 Saanen goats, clinically healthy and serologically negative for caprine arthritis encephalitis virus (CAEV). Blood samples were collected by jugular venipuncture 49 (M1), 42 (M2), 35 (M3), 28 (M4), 21 (M5), 14 (M6), seven (M7), three (M8) days before the parturition, on the day of birth (M9), three (M10) and seven (M11) days postpartum, for the leukocyte count, and serum for cortisol, estradiol and progesterone determination. From 28 days (M4) before parturition until seven days postpartum (M11) blood samples were collected for evaluation of oxidative metabolism of neutrophils by the nitroblue tetrazolium reduction test (NBT). The results showed that at parturition day there were an increase in cortisol and estradiol levels and a decrease in progesterone serum, neutrophilic leukocytosis and left shift slight, decrease of lymphocytes, increase in the neutrophil: lymphocyte, eosinopenia, monocytosis and basophilia. There was a neutrophilic leukocytosis and an increase in the neutrophil: lymphocyte on the seventh day postpartum. There were not significant alterations in oxidative metabolism of neutrophils during pregnancy, parturition and postpartum. It was concluded that parturition causes an elevation in cortisol and estradiol levels and a decrease in progesterone serum determining a neutrophilic leukocytosis and left shift slight, with a reduction of lymphocytes, increase in the neutrophil:lymphocyte, eosinopenia, monocytosis and basophilia. Neutrophilic leukocytosis, increase in the neutrophil: lymphocyte and fibrinogen are detected on the seventh day postpartum. Pregnancy, parturition and the postpartum do not change the oxidative metabolism of neutrophils evaluated by NBT reduction test.

Leukocytes respiratory burst and lysozyme level in pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) / Atividade respiratória de leucócitos e nível de lisozima em pacu (Piaractus mesopotamicus)

Innate immune responses are useful to determine the health status of fish and to evaluate the effect of immunomodulatory substances in fish farming. Leukocytes respiratory burst was measured in pacu (Piaractus mesopotamicus) using chemiluminescence assay and nitroblue tetrazolium (NBT) reduction assay. The nitroblue tetrazolium reduction seemed more adequate than chemiluminescence assay for leukocytes oxidative burst determination, since it was difficult to isolate the blood leucocytes for chemiluminescence assay. Plasma and serum lysozyme were measured using a turbidimetric assay. The heating of serum and plasma samples (56 ºC for 30 minutes) for complement system inactivation darkened the plasma samples and interfered in the results. The lysozyme activity in serum was higher than in plasma, suggesting that serum samples are more appropriate for the analysis. This study established protocols that can be useful tools in the study of immune mechanisms of the tropical fish pacu.

Respostas imunológicas inatas são úteis para determinar o estado de saúde de peixes e avaliar o efeito de substâncias imunomoduladoras no cultivo destes animais. A atividade respiratória de leucócitos foi medida em pacu (Piaractus mesopotamicus) através de ensaio de quimioluminescência e ensaio de redução do nitroblue tetrazolium (NBT). O ensaio de redução do nitroblue tetrazolium pareceu mais adequado que o ensaio de quimioluminescência para determinação da atividade respiratória de leucócitos, uma vez que foi difícil isolar com êxito os leucócitos do sangue para o ensaio de quimioluminescência. Lisozima sérica e plasmática foram medidas por meio de ensaio turbidimétrico. Com o objetivo de inativar as proteínas do sistema complemento, as amostras de soro e plasma foram aquecidas (56 ºC por 30 minutos). Porém, este procedimento provocou a turvação das amostras de plasma e interferiu nos resultados. A atividade de lisozima no soro foi maior que no plasma, sugerindo que amostras de soro são mais apropriadas para esta análise. Este estudo estabeleceu protocolos que podem ser utilizados como ferramentas no estudo de mecanismos imunológicos do peixe tropical pacu.

Metabolismo oxidativo dos neutrófilos de bezerros das raças Nelore e Limousin nos primeiros quatro meses de vida / Neutrophil oxidative burst in Nelore and Limousin calves in the first four months of life

To study some defence mechanisms of beef calves kept on range conditions, 90 healthy calves, 45 Nelore and 45 Limousin, were bled at 24 to 36 hours of life, 15, 30, 60, 90 and, 120 days. Leukogram and neutrophil oxidative burst through the non-stimulated and the stimulated NBT tests were determined. The parasitemia with Anaplasma marginale, Babesia bigemina and B. bovis was investigated. Repeated measure ANOVA was used to analyse the age effect on leukocyte counts. Variation of positive neutrophil throughout the age was analysed through Krushkal-Wallis test. Comparisons among breeds were done using the Mann-Whithney test. The white blood cell count increased with age in both breeds, with a decrease in neutrophil and an increase in lymphocyte counts. The neutrophil lymphocyte ratio had been inverted before 15 days of life. The neutrophil oxidative burst was less effective in the newborn calves increasing with age. Limousin calves' neutrophils had higher capacity to reduce NBT in advanced ages. The observed differences between taurine and Zebu calves had no effects on calves' health and could be atributed to Anaplasma marginale natural and asynptomatic infection.

Com o objetivo de investigar alguns mecanismos de defesa em bezerros de raças de corte criadas a campo, foram utilizados 90 animais recém-nascidos aparentemente sadios, 45 da raça Nelore e 45 da raça Limousin. Amostras de sangue foram colhidas de cada bezerro entre 24 e 36 horas de vida e aos 15, 30, 60, 90 e 120 dias. Determinaram-se o leucograma e o metabolismo oxidativo dos neutrófilos por meio do teste da redução do tetrazólio de nitroazul (NBT), provas não estimulada (NBT-NE) e estimulada (NBT-E). Investigou-se a taxa de parasitemia determinada por Anaplasma marginale, Babesia bigemina e B. bovis. Utilizou-se a análise de variância de medidas repetidas para estudar o comportamento das variáveis hematológicas com o avançar da idade. O teste de Krushkal-Wallis foi empregado para caracterizar a variação da porcentagem de neutrófilos reativos relacionada à idade. Comparações entre as raças foram realizadas em cada idade por meio do teste de Mann-Whithney. A contagem total de leucócitos aumentou com a idade nas duas raças estudadas. Observou-se diminuição do número de neutrófilos e aumento do de linfócitos, ocorrendo sua inversão antes dos 15 dias de idade. A capacidade oxidativa dos neutrófilos foi menor nos bezerros recém-nascidos e aumentou com o avançar da idade. Os neutrófilos dos bezerros Limousin apresentaram maior capacidade de redução do NBT do que os dos bezerros Nelore, notadamente após o segundo mês de vida. Essa diferença não provocou reflexos sobre a saúde dos animais e pode ser resultado da infecção natural e assintomática com o Anaplasma marginale.

Antioxidant activity of extract from Polygonum aviculare L

Free radicals induce numerous diseases by lipid peroxidation, protein peroxidation, and DNA damage. It has been reported that numerous plant extracts have antioxidant activities to scavenge free radicals. Whether Polygonum aviculare L. (Polygonaceae) has antioxidant activity is unknown. In this study, dried Polygonum aviculare L. was extracted by ethanol, and the extract was lyophilized. The antioxidant activities of extract powder were examined by free radical scavenging assays, superoxide radical scavenging assays, lipid peroxidation assays and hydroxyl radical-induced DNA strand scission assays. The results show that the IC50 value of Polygonum aviculare L. extract is 50 µg/ml in free radical scavenging assays, 0.8 µg/ml in superoxide radical scavenging assays, and 15 µg/ml in lipid peroxidation assays, respectively. Furthermore, Polygonum aviculare L. extract has DNA protective effect in hydroxyl radical-induced DNA strand scission assays. The total phenolics and flavonoid content of extract is 677.4 ± 62.7 µg/g and 112.7 ± 13 µg/g. The results indicate that Polygonum aviculare L. extract clearly has antioxidant effects.

Spontaneous neutrophil activation in HTLV-1 infected patients

Human T cell lymphotropic Virus type-1 (HTLV-1) induces lymphocyte activation and proliferation, but little is known about the innate immune response due to HTLV-1 infection. We evaluated the percentage of neutrophils that metabolize Nitroblue tetrazolium (NBT) to formazan in HTLV-1 infected subjects and the association between neutrophil activation and IFN-gamma and TNF-alpha levels. Blood was collected from 35 HTLV-1 carriers, from 8 patients with HAM/TSP (HTLV-1- associated myelopathy); 22 healthy individuals were evaluated for spontaneous and lipopolysaccharide (LPS)-stimulated neutrophil activity (reduction of NBT to formazan). The production of IFN-gamma and TNF-alpha by unstimulated mononuclear cells was determined by ELISA. Spontaneous NBT levels, as well as spontaneous IFN-gamma and TNF-alpha production, were significantly higher (p<0.001) in HTLV-1 infected subjects than in healthy individuals. A trend towards a positive correlation was noted, with increasing percentage of NBT positive neutrophils and levels of IFN-gamma. The high IFN-gamma producing HTLV-1 patient group had significantly greater NBT than healthy controls, 43±24 percent and 17±4.8 percent respectively (p< 0.001), while no significant difference was observed between healthy controls and the low IFN-gamma-producing HTLV-1 patient group (30±20 percent). Spontaneous neutrophil activation is another marker of immune perturbation resulting from HTLV-1 infection. In vivo activation of neutrophils observed in HTLV-1 infected subjects is likely to be the same process that causes spontaneous IFN-gamma production, or it may partially result from direct IFN-gamma stimulation.

Presence of free radicals in spinal cord injury: experimental evidence in rats / Presença de radicais livres em lesão medular: evidência experimental em ratos

Um total de 24 ratos da raça Wistar pesando 230 a 350g foram submetidos a uma compressão medular experimental e a liberação de radicais livres resultante foi detectada por um reagente óptico (nitro azul de tetrazolio). Os animais foram separados em 3 grupos de oito. No primeiro grupo foi realizada uma laminectomia e a medula examinada. Nos grupos II e III um clipe de aneurisma foi introduzido para comprimir a medula por 1 minuto e depois foi administrado o reagente óptico no espaço subpial. O material foi investigado pelo microscópio de luz e de transmissão. O grupo III revelou a ação dos radicais livres sobre a biomembrana em virtude da presença de restos membranosos eletrontranslucentes e cristas mitocondriais rompidas dentre outros achados.O íon superóxido foi considerado o radical livre mais freqüente na compressão medular murina pela maioria dos autores na revisão da literatura. O nitro azul de tetrazolio não é específico para este radical livre mas a maioria dos que chegaram a essa conclusão usaram-no. O conceito de síndrome de reperfusão é impreciso e segundo os diversos autores deve ser substituído por síndrome de anóxia-reoxigenação

Arachidonic acid triggers an oxidative burst in leukocytes

The change in cellular reducing potential, most likely reflecting an oxidative burst, was investigated in arachidonic acid- (AA) stimulated leukocytes. The cells studied included the human leukemia cell lines HL-60 (undifferentiated and differentiated into macrophage-like and polymorphonuclear-like cells), Jurkat and Raji, and thymocytes and macrophages from rat primary cultures. The oxidative burst was assessed by nitroblue tetrazolium reduction. AA increased the oxidative burst until an optimum AA concentration was reached and the burst decreased thereafter. In the leukemia cell lines, optimum concentration ranged from 200 to 400 æM (up to 16-fold), whereas in rat cells it varied from 10 to 20 æM. Initial rates of superoxide generation were high, decreasing steadily and ceasing about 2 h post-treatment. The continuous presence of AA was not needed to stimulate superoxide generation. It seems that the NADPH oxidase system participates in AA-stimulated superoxide production in these cells since the oxidative burst was stimulated by NADPH and inhibited by N-ethylmaleimide, diphenyleneiodonium and superoxide dismutase. Some of the effects of AA on the oxidative burst may be due to its detergent action. There apparently was no contribution of other superoxide-generating systems such as xanthine-xanthine oxidase, cytochromes P-450 and mitochondrial electron transport chain, as assessed by the use of inhibitors. Eicosanoids and nitric oxide also do not seem to interfere with the AA-stimulated oxidative burst since there was no systematic effect of cyclooxygenase, lipoxygenase or nitric oxide synthase inhibitors, but lipid peroxides may play a role, as indicated by the inhibition of nitroblue tetrazolium reduction promoted by tocopherol.

Atividade funcional neutrofílica em cabras com mastite induzida experimentalmente por Staphylococcus aureus e suplementadas com vitamina E (acetato DL-a-tocoferol) / Neutrophilic function activity in goats with mastitis experimentally induced by Staphylococcus aureus and supplemented with vitamin E (acetate DL-a-tocopherol)

Avaliou-se a função neutrofílica em cabras com mastite por Staphylococcus aureus, induzida experimentalmente, suplementadas com vitamina E (acetato DL-a-tocoferol). Foram utilizadas 14 cabras gestantes da raça Saanen, com idades entre 8 e 12 meses e com cultura bacteriológica do leite negativa. Sete cabras receberam 2000UI de vitamina E, via intramuscular, no dia do parto e no sétimo dia pós-parto. As outras sete não foram medicadas. No 10º dia pós-parto, os dois grupos foram inoculados com 300 unidades formadoras de colônias de Staphylococcus aureus, cepa ATCC 25923, diluídas em 10ml de solução fisiológica, na glândula mamária esquerda. A função de neutrófilos sangüíneos foi medida pelo teste nitroazul tetrazólio (NBT), antes da inoculação, no momento da infecção e 12, 24, 48 e 72 horas pós-infecção, quando foi instituído o tratamento intramamário com antimicrobiano, por três dias consecutivos. A colheita final de sangue foi realizada 48 horas após a última aplicação do medicamento. Amostras de sangue para determinação da vitamina E foram colhidas no dia do parto, no momento da infecção, 48 horas pós-infecção e 48 horas pós-tratamento e analisadas por cromatografia líquida de alta performance. Na prova não estimulada do NBT não foram verificadas diferenças entre grupos e entre momentos. Na prova estimulada do NBT (NBT-E) houve diferença entre tratamentos às 12 e 72 horas pós-infecção, com valores mais elevados de NBT-E nos animais sem suplementação. Conclui-se que a suplementação com vitamina E reduz o percentual de neutrófilos NBT-E positivos.

Evaluación de los mecanismos oxidativos del PMN neutrófilo de saliva de pacientes periodontalmente sanos por reducción de NBT / An evaluation of the oxidative mechanisms of salivary PMN neutrophil in saliva of periodontally healthy patients by NBT reduction

Antecedentes: en general, las enfermedades periodontales se caracterizan por cambios, tanto estructurales como bioquímicos en el ámbito tisular, y en su patogenia, por contraste de infecciones bacterianas, el neutrófilo es considerado como la célula más importante de la inmunidad innata. La importancia de esta célula radica en el hecho de estar presente en cada uno de los cuatro estadios que caracterizan el avance de la lesión, así como en los hallazgos de susceptibilidad a infecciones bacterianas recurrentes, incluyendo enfermedad periodontal, en pacientes con defectos cualitativos y cuantitativos en PMN neutrófilos de sangre periférica. Una de las alteraciones funcionales del neutrófilo asociada a la pérdida de la capacidad de defensa ejercida por esta célula contra bacterias extracelulares, la constituye el hecho de ser incapaz de acivar sus mecanismos oxidativos para producir la muerte intracelular de los microorganismos ingeridos. Objetivo: evaluar la capacidad del PMN neutrófilo de saliva y sangre periférica de pacientes periodontalmente sanos para activarse y utilizar losmecanismos microbicidas dependientes de oxígeno, para reconocer si el PMN neutrófilo, al migrar a través del surco gingival, conserva intacta su funcionalidad. Métodos: el estudio fue descriptivo comparativo, in vitro. Para su desarrollo se formaron muestras de saliva y de sangre periférica de 5 individuos. Los neutrófilos aislados fueron sometidos a activación con phorbol miristato acetato (PMA) y posteriormente a las pruebas de reducción del nitroazul de tetrazolio, el cual se puede cuantificar por observación directa al microscopio de luz. Resultados: los PMN neutrófilos obtenidos de sangre y saliva reducen el NBT en un porcentaje más ato que los PMN neutrófilos de sangre periférica, en ausencia de activación. Se encontró que los PMN neutrófilos de saliva tienen un estado de activación de base debido a su constante exposición a las bacterias de la cavidad bucal, y una vez que se activan, dichas células reducen el NBT en menor cantidad que los PMN neutrófilos de sangre periférica bajo iguales condiciones. Conclusiones: los PMN neutrófilos de saliva son células funcionales capaces de activarse, ya que mantienen intactos los mecanismos oxidativos una vez llegan a la saliva a través del surco gingival

Caracterización clínico molecular de la enfermedad granulomatosa crónica autosómica recesiva causada por déficit de p47-phox / Clinical and molecular characterization af autosomal recessive chronic granulomatous disease caused by p47-phox deficiency

Background: The cytosolic protein p47-phox (phagocyte oxidase) is one of the essential components of the superoxide generating system in phagocytes and its defect causes approximately 30 percent of the chronic granulomatous disease (CGD) cases. Aim: Two patients were studied, belonging to the same family, without a consanguinous background, in which deficiency or absence of superoxide generation was found together with recurrent and severe infections in one case and benign infections in the second. Methods: The presence of gp91-, p67- and p47-phox in patients and controls was determined by Western Blot analysis of granulocytes. Sequencing of PCR amplified DNA was performed by an enzimatic method. Results: Western Blot analysis showed normal expression of gp91 and p67 and absence of p47-phox. The molecular genetic study demonstrated a homocygotic dinucleotide GT (GT) deletion at the beginning of exon 2 of the p47-phox gene. The same mutation has been found in European, American and Japanese patients. Conclusions: The molecular characterization of this pathology done for the first time in Chile is important for diagnostic classification, patient prognosis, and adequate genetic advice and a possible future therapy

Estandarización de la técnica de reducción del NBT mediante lectura en placas de microELISA / Standarization of the reduction technic del NBT by means of reading in boards of microELISA

La enfermedad granulomatosa crónica (EGC), es un padecimiento en el cual las células fagocíticas se ven imposibilitadas de producir sustancias microbicidas por las vías dependientes del oxígeno. Esta anormalidad puede evaluarse en el laboratorio haciendo uso de la prueba de nitroazul de tetrazolio (NBT), el cual es afectado directamente por la cantidad de superóxido producido y liberado en el fagolisosoma. Existen muchos y diversos protocolos a seguir a la hora de llevar a cabo dico análisis. Aquí se describe la estandarización de un método simple, donde el formazán producto de la reducción del NBT es solubilizado con ayuda de KOH y dimetilsulfóxido (DMSO), determinándose la densidad óptica de la disolución resultante en un lector de placas para microELISA. La técnica logra simplificar y agilizar el estudio de pacientes sospechosos de EGC que acudan al Hospital Nacional de Niños, debido a que permite incluir un mayor número de muestras por análisis, además permite cuantificar el NBT reducido por interpolación en una curva de calibración tipo Lambert y Beer

Estudo da presença dos radicais livres de oxigênio na compressäo medular aguda em ratos, por meio de um indicador óptico (nitro azul de tetrazolio) com avaliaçäo pela microscopia óptica eletrônica / Study of the oxigen free presence in the acute spinal cord comptression in rats by means of an optical indicater(nitro blue tetrazolium) with valuation by optical and eletronic microscopy

O autor descreveu este trabalho experimental para a compreensão dos possíveis mecanismos patológicos envolvidos na lesão medular traumática em ratos, e contribuir posteriormente para possíveis estratégias no tratamento desta condição mórbida. Vinte e quatro ratos Wistar foram submetidos à laminectomia do segmento torácico da medula espinhal e após compressão com clipe de aneurisma por l minuto, entre C8-T I, foi administrado O,10 ml do reativo óptico, Nitro Azul de Tetrazolio, no espaço subpial. Depois da observação da redução deste composto hidrossolúvel em presença da espécies reativas de oxigênio, foi feito o estudo pela Microscopia óptica e eletrônica. Comparando os resultados do Nitro Azul de Tetrazolio com os obtidos com a Microscopia óptica e eletrônica foi possível obter conclusões sobre a ação efetiva dos radicais livres de oxigênio sobre a medula experimentalmente traumatizada; como os restos membranosos eletrontranslucentes que sugeriram a ação dos radicais livres sobre a estrutura fosfolipídica da membrana celular

Alteraciones de la fagocitosis en el asma bronquial / Alterations of phagocytosis in bronchial asthma

La fagocitosis es una función primordial en los padecimientos broncopulmonares. Es importante su valoración en asma bronquial porque se han encontrado alteraciones tanto congénitas como adquiridas en esta enfermedad, lo que hace importante su estudio. Utilizamos leucocitos polimorfonucleares para estudiar los cuatro pasos de la fagocitosis: adherencia inmunitaria, receptores celulares, endocitosis y digestión en 52 pacientes con asma bronquial extrínseca sin tratamiento previo que alteraran la fagocitosis. Conclusión: No encontramos diferencias significativas en los pacientes asmáticos en relación con individuos normales

Flow cytometry evaluation of complement mediated bacterial membrane damage

The study of the complement-outer bacterial membrane interactions is gaining enthusiasm for applying a continous development of more specialized techniques. In this paper a novel flow cytometry technique shows that highly fluorescent lucifer yellow-stained Neisseriae gonorrhoeae when exposed to the redox reaction of p-nitro blue chloride tetrazolium (NBT), as formazan precipitation takes place, a shift to lesser fluorescent channels of the histogram population occurs. That effect is labeled NBT-laser beam quenching (NBT-LBQ). A significant difference by Kolmogorov-Smirnov summation curve analysis is found between complement heat-inactivated and its counterpart assessed with normal complement microorganisms. The operation of this NBT-LBQ effect by microbial flow cytometry casts an interesting potential for the evaluation of the outer membrane-complement-interaction of serum sensitive microorganisms

Lymphocyte subpopulations and neutrophil function in chronic human Chagas' disease

Numeros absolutos de leucocitos e linfocitos, de celulas T totais, indutoras/auxiliares, supresorras/citotoxicas e de celulas B estavam diminuidos no sangue periferico de pacientes com doenca de Chagas cronica. Como anticorpos antilinfocitarios estavam presentes em apenas uma minoria de pacientes, eles provavelmente nao sao responsaveis pelas anormalidades das subpopulacoes de linfocitos. Neutrofilos de pacientes estimulados por plasma autologo tratado por endotoxina mostravam atiividade quimiotatica diminuida que deve ser devida a um defeito celular intrinseco e nao a inibicao plasmatica. A migracao aleatoria dos neutrofilos estava normal. A reducao do corante "nitroblue tetrazolium" (NBT) por neutrofilos estimulados por endotoxina tambem estava diminuioda nos pacientes. Estes achados estendem a documentacao da imunossupressao na doenca de Chagas humana. Eles podem ser relevantes para autoimunidade e para defesa contra microorganismos e celulas tumorais, pelo menos em um subgrupo de pacientes com anormalidades mais pronunciadas

Neutrophil function in megaloblastic anemia

Chemotaxis, nitroblue tetrazolium (NBT) reduction and the presence of Fcy receptors on surface membranes were in the peripheral blood neutrophils of 20 patients with megaloblastic anemia (15 with folate deficiency and 5 with pernicious anemia). The percent of NBT - or Fcy - positive neutrophils was the same for patients and normal controls. In contrast, chemotaxis was decreased - 20% (P < 0.05) in megaloblastic anemia and when anemia was correcred in 3 cases, chemotaxis increased to levels within the normal range. In contrast to wath one would expect on the basis of these laboratory findings, there are no reports of increased susceptibility to infections in these patients

Histochemical detection of creatine kinase ion the electrocyte of Electrophorus electricus (L.)

Detection of creatine kinase, which catalyzes the conversion of ADP and phosphocreatine to ATP and creatine, was performed an the electrocyte of Electrophorus electricus (L.) using a histoenzymological method based on the formation of blue colored formazan. The results indicate that the enzyme is mainly located within the cytoplasm of the electrolyte