O papel das nucleases no laboratório de biologia molecular: vilãs ou aliadas? / The role of nucleases in the molecular biology laboratory: villains or allies?

Em laboratório de biologia molecular existem normas para prevenir que nucleases destruam os ácidos nucleicos em análise. Rígida adesão a estas normas é primordial, principalmente em laboratórios de análises clínicas e ao se lidar com amostras com número restrito de cópias do genoma-alvo. Em contraposição, diversas nucleases têm tido importância fundamental, por exemplo, na identificação do ácido nucleico de vírus, investigação de RNA mensageiro, purificação de vírus em abordagem metagenômica, edição de genomas com o sistema CRISPR/Cas e descoberta de enzimas. O conhecimento de como nucleases podem ser tanto vilãs quanto aliadas é essencial na formação de todos que trabalham no campo de biologia molecular.

In a molecular biology laboratory there are standards to prevent nucleases from destroying the nucleic acids under analysis. Strict adherence to these standards is paramount, mainly in clinical analysis laboratories and when dealing with samples with a limited number of copies of the target genome. In contrast, several nucleases have been of fundamental importance, for example, in the identification of the type of viral nucleic acid, investigation of messenger RNA, virus purification in metagenomic approach, genome editing with the CRISPR/Cas system, and enzyme discovery. Knowledge of how nucleases can be both villains and allies is essential in the training of all working in the field of molecular biology.

Aislamiento y caracterizacion parcial de fracciones con actividad ribonucleasa a partir del latex de calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton y pedilanthus tithymaloides (L.) poit / Isolation and partial characterization of fractions with ribonuclease activity from latex of calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton and pedilanthus tithymaloides (L.) poit

Con el objetivo de aislar y caracterizar parcialmente las enzimas ribonucleasas (RNasas) contenidas en el látex de Calotropis procera y Pedilanthus tithymaloides, se colectaron muestras de plantas adultas. Las proteínas solubles fueron extraídas con acetato de sodio y centrifugación a 16.000 x g durante 15 min y fraccionadas por cromatografía de intercambio iónico. Se estimó la masa molecular a través de ecuaciones de regresión lineal. Se realizaron pruebas de glicosilación. En ambas especies, las proteínas con actividad RNasa presentaron una masa molecular entre 28 y 30 kDa. No existe evidencia de proteínas glicosiladas en el látex de C. procera. En P. tithymaloides la RNasa es una proteína glicosilada.

In order to isolate and characterize partially ribonucleases (RNases) enzymes contained in the latex from Calotropis procera and Pedilanthus tithymaloides, samples were collected from mature plants. Soluble proteins were extracted with sodium acetate and centrifugation at 16,000 xg for 15 min and fractionated by ion exchange chromatography. Molecular mass was estimated by linear regression equations. Glycosylation tests were conducted. In both species, proteins with RNase activity showed a molecular mass between 28 and 30 kDa. No evidence of glycosylated proteins in latex from C. procera. In P. tithymaloides, RNase may be a glycosylated protein.

Light-emitting diode effects on combined decellularization of tracheae. A novel approach to obtain biological scaffolds

PURPOSE: To obtain a decellularized tracheal scaffold associating traditional approaches with the novel light-emitting diode (LED) proposal. METHODS: This study was performed with New Zealand adult rabbits weighing 3.0 - 4.0 kg. Different protocols (22) were used combining physical (agitation and LED irradiation), chemical (SDS and Triton X-100 detergents), and enzymatic methods (DNase and RNase). RESULTS: Generally, the cells surrounding soft tissues were successfully removed, but none protocol removed cells from the tracheal cartilage. However, longer protocols were more effective. The cost-benefits relation of the enzymatic processes was not favorable. It was possible to find out that the cartilaginous tissue submitted to the irradiation with LED 630nm and 475 nm showed an increased number of gaps without cells, but several cells were observed to be still present. CONCLUSION: The light-emitting diode is a promising tool for decellularization of soft tissues. .

Factores solubles con actividad inhibitoria contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 / Soluble factors with inhibitory activity against type 1 Human Immunodeficiency Virus

La patogénesis de la infección por el VIH-1 es un proceso complejo que depende de múltiples factores, incluyendo los de origen viral, la respuesta inmune y los factores genéticos del hospedero. Debido a esto, se observa que en los individuos infectados por el VIH-1 existen diferentes patrones de progresión de la enfermedad, mientras que algunos individuos que se exponen repetidamente al virus permanecen sanos y seronegativos. Esta variabilidad luego de la exposición al VIH-1 sugiere que existen mecanismos de resistencia natural contra esta infección. Si bien en algunos individuos expuestos seronegativos y en infectados no progresores a largo término, se ha podido determinar que la resistencia se da por mecanismos genéticos o inmunológicos, existe un porcentaje importante de casos de resistencia para los cuales no ha sido posible establecer el mecanismo protector. Varios factores solubles, como las defensinas, las quimiocinas, los interferones y las ribonucleasas, entre otros, producidos por células del sistema inmune y por células de varios tejidos epiteliales, tienen una reconocida actividad antiviral que podría estar involucrada en la protección del hospedero durante la exposición al VIH-1. Conocer adecuadamente los mecanismos de acción de estos factores y su papel en la resistencia natural a la infección por el VIH-1 puede ser útil al momento de diseñar nuevas estrategias terapéuticas para combatir la morbilidad y mortalidad asociadas con la pandemia por el VIH-1.

The pathogenesis of HIV-1 infection is a complex process that depends on multiple factors, including viral and host immune and genetic characteristics. This leads to a variable pattern of disease progression among those HIV-1-exposed individuals who become infected, while there are a number of individuals who remain healthy and HIV-1 seronegative despite being serially exposed to HIV-1. These variable outcomes of HIV-1 exposure suggest that there are mechanisms of natural resistance to HIV-1 infection. Although several genetic and adaptive immune mechanisms of resistance have been reported in some exposed seronegative and long-term non-progressor individuals, the mechanisms involved in controlling the establishment and progression of HIV-1 infection are not fully understood. Several soluble factors, such as defensins, chemokines, interferons and ribonucleases, among others, produced by cells of the immune system and epithelial tissues, have a broad anti-viral activity that might play a role as protective mechanisms during HIV-1 exposure. A better understanding of the mechanisms and role of these soluble factors during the natural resistance to HIV-1 infection may have important implications for the design of novel therapeutic strategies to combat the morbidity and mortality associated with the HIV-1 pandemic.

Ribunucleasas: su potencial terapeutico en infecciones virales / Ribonucleases: Theurapetical potential on Viral Infections

En la actualidad existe un gran interés por identificar proteínas o péptidos antimicrobianos que puedan ser herramientas terapéuticas que eviten el establecimiento o permitan el control de diferentes infecciones. Las ribonucleasas (RNasas), pertenecientes a la superfamilia Ribonucleasa A, son enzimas que participan en varios procesos fisiológicos, que van desde el procesamiento alternativo del RNA hasta la angiogénesis. Estas enzimas son expresadas por diferentes tejidos y exhiben especificidades variables contra diferentes sustratos de RNA. El potencial terapéutico de las RNasas se ha sugerido en procesos oncogénicos; adicionalmente, se ha descrito que tienen actividad antiviral directa y el potencial de activar células del sistema inmune innato induciendo su maduración y la producción de citoquinas proinflamatorias. Nuestro grupo de investigación ha realizado estudios que señalan la capacidad de cuatro RNasas recombinantes: EDN, 4EDN, RNasa A y angiogenina de inhibir la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en linfocitos T de sangre periférica activados. En este artículo se revisará la clasificación de las ribonucleasas que constituyen la superfamilia RNasa A y se describirá, en forma detallada, lo que se conoce de la función biológica, acción antiviral y mecanismo de acción de las RNasas a las que se les ha reportado actividad antiviral.

Influence of urea on stability of invertase from Saccharomyces cerevisiae

Este trabalho objetivou investigar a dependência entre o equilíbrio de desenovelamento da invertase por uréia, segundo um mecanismo de equilíbrio entre dois estados, com algumas propriedades termodinâmicas do solvente. Os valores das propriedades termodinâmicas do solvente foram calculados com aplicação da teoria de McMillian-Mayer. O equilíbrio de desenovelamento da invertase foi acompanhado por titulação espectrofotométrica em 280nm com uma solução de uréia a 8 mol.L-¹. O bom ajuste a um modelo de primeira ordem apresentado pelos dados de equilíbrio da invertase, bem como da RNase A e da RNase T1, é consistente com a idéia de que o alto conteúdo em carboidratos da invertase não afeta o mecanismo geral de desenovelamento. Entretanto, um aumento na concentração de uréia produziu uma diminuição na energia livre de desenovelamento (DeltaG°U ) para a intertase, e um aumento nos valores de DeltaG°U para Rnase A e Rnase T1. A invertase também exigiu maiores valores de atividade de água (Aw) do que a RNAse A e a RNAse T1 para ser desenovelada. O diferente comportamento da invertase em relação a aquelas enzimas pode ser relevante para fornecer informação adicional sobre os mecanismos detalhados do enovelamento e desenovelamento de proteínas.

Inflammatory mediators in nasal lavage among school-age children from urban and rural areas in São Paulo, Brazil

CONTEXTO: Alguns estudos demonstram que o processo inflamatório nas vias aéreas nasais poderia refletir ou mesmo afetar as vias aéreas inferiores. Decidimos avaliar indiretamente o estado inflamatório das vias aéreas nasais de dois grupos de escolares com diferente sensibilização aos aeroalérgenos mais comuns. OBJETIVO: Comparar a atividade inflamatória nas vias aéreas nasais, através da determinação de mediadores inflamatórios no lavado nasal em duas populações distintas de crianças em idade escolar. TIPO DE ESTUDO: Estudo transversal. LOCAL: O estudo foi realizado em duas escolas públicas de ensino fundamental, uma em zona urbana e outra em zona rural, no Estado de São Paulo. MÉTODOS: Foram constituídos dois grupos de 40 escolares que apresentam diferentes taxas de sensibilização a aeroalérgenos comuns. Amostras do lavado nasal foram colhidas para determinação de proteína catiônica eosinofílica (ECP) e triptase. Testes não-paramétricos foram usados na análise estatística. RESULTADOS: Níveis significativamente maiores de proteína catiônica eosinofílica foram encontrados nos estudantes da área urbana (p < 0,05). Não houve diferença estatística nos níveis de triptase entre os dois grupos. Observou-se ainda que, na área urbana, as crianças sensibilizadas aos aeroalérgenos apresentaram maiores concentrações de proteína catiônica eosinofílica, o que não foi observado nas crianças da zona rural. DISCUSSAO: A ausência de atividade de mastócitos e a degranulação aumentada de eosinófilos revelaram uma inflamação crônica nas vias aéreas das crianças estudadas. A maior atividade de eosinófilos na zona urbana, coincidindo com a maior sensibilização aos aeroalérgenos, sugere que deve haver algum fator a mais na área urbana que modula a resposta das vias aéreas influenciando a ativação das células inflamatórias locais. CONCLUSAO: Nossos achados não mostraram diferenças nos níveis de triptase no lavado nasal entre os dois grupos estudados. Por outro lado, as crianças da area urbana apresentaram maiores concentrações de proteína catiônica eosinofílica do que aquelas da zona rural. Observamos ainda que, na area urbana, as crianças sensibilizadas por aeroalérgenos apresentaram maiores concentrações de proteína catiônica eosinofílica do que aquelas não sensibilizadas, enquanto esta diferença não foi observada nas crianças da area rural.

JAK/STAT-deficient cell lines

Mutant cell lines B3 and B10, which are unresponsive to both interferon (IFN)-alfa and IFN-gama, and line B9, which does not respond to IFN-gama stimulation, are described. The mutants were submitted to fluorescence-activated cell sorting (FACS) from a cellular pool, which was obtained from the parental cell line 2C4 after several rounds of mutagenesis. The unresponsiveness to IFN stimulation was observed both in terms of expression of cell surface markers (CD2, class I and II HLAs) and mRNA expression of IFN-stimulated genes (2'-5' oligoadenylate synthetase (OAS), 9-27, and guanylate binding protein (GBP)). Genetic crossing of B3, B9 and B10 with U3 (STAT1-),gama2 (JAK2-) and U4 (JAK1-) mutants, respectively, did not restore IFN responsiveness to the hybrid cell lines. However, when these cell lines were crossed with the same mutants, but using the pairwise crosses B3 x U4, B9 x U3 and B10 x U3, the cell hybrids recovered full IFN responsiveness. The present genetic experiments permitted us to assign the mutant cell lines B3, B9 and B10 to the U3, gama2 and U4 complementation groups, respectively. These conclusions were supported by the analysis of IFN-stimulated genes in the mutants.

Ribonuclease production by Aspergillus species

Ribonuclease production by Aspergillus flavipes, A. sulphureus And A. fischeri in semisynthetic medium, after 24-144 hours at 30§C under shaking, was studied. After cultivation, the medium was separated from micelia by filtration and the resultant solution was used as enzymatic extract. The highest amount of biomass and RNase was obtained after 96 hours of cultivation. The enzymes produced by three species presented similar characteristics, with optimum temperature at 55§C and two peaks of activity at pH 4.5 and 7.0. A. flavipes RNases were more sensitive to temperatue: 50(per cent) of the initial activity was lost after 1 hour at 70§C. After this heat treatment, RNase of A. sulphureus lost 30(per cent) of this activity and that of A. fischeri only 16(per cent). The nucleotides released by enzimatic hydrolysis of RNA were separated by ion exchange chromatography in a AG-1X8-formiate column and identified by paper chromatography. This procedure indicated that the raw enzymatic extract of Aspergillus flavipes is able to hydrolyze RNA, releasing 3'-nucleotides monophosphate at pH 4.5 and 3'and 5'-nucleotides monophosphate at pH 7.0 and 8.5. This result suggests that this strain produces two different types of RNase, one acidic and other alcaline, with different specificities

Actividad microbicida de la ribonucleasa y desoxirribonucleasa en cepas de bacterias patógenas in vitro / Microbicidal activity of ribonuclease and deoxyribonuclease in pathogenic bacterias strains in vitro

Las nucleasas son enzimas que por muchos años se han relacionado exclusivamente con la actividad digestiva. Sin embargo, diversos estudios han demostrado que en condiciones naturales, tienen una función microbicida importante. El presente trabajo se desarrolló con el objetivo de demostrar in vitro la acción germicida de la ribonuclease (RNasa) y la desoxirribonucleasa (DNasa) cuando se aplican exógenamente en algunas cepas patógenas. Surge como una necesidad de analizar la acción directa de las nucleasas sobre ciertos microorganismos, debido a que al aplicarse terapéuticamente en pacientes afectados de procesos infecciosos producidos por estos microorganismos, se ha obtenido el control del padecimiento. En cultivos de cepas puras de Staphylococcus, Proteus vulgaris, proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniase, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi y Escherichia coli, se aplicaron directamente al medio de cultivo soluciones al 0.1, 1, 10, 25, 50, y 75 por ciento de RNasa (0.00070 mg/mL) y/o DNasa (0.00035 mg/mL). Se valoró la viabilidad y el crecimiento de las colonias bacterianas conservadas en condiciones óptimas de nutrición, temprana, pH y osmolaridad, a las 24, 48, 72 y 192 horas de exposición a estas nucleasas. Se observó que el efecto lítico se manifiesta en la mayor concentración y que las distintas cepas muestran una sensibilidad diferente a las enzimas, ya sea que se apliquen individualmente o en forma simultánea. Se concluye, que las nucleasas tienen actividad antimicrobiana selectiva in vitro, que corrobora el efecto que se ha observado in vivo, en donde además, de demostrar el efecto microbicida selectivo y lisar directamente a los microorganismos, controlan la infección porque destruyen a las células infectadas e inhiben la replicación de los microorganismos que se mantienen en el interior de algunas células.

A model of complete random molecular evolution by recurrent mutation

A model for random molecular evolution based on recurrent mutation is proposed. Recurrent mutation replaces completely any original base in a nucleotidic site. This occurs if more than four times the number of reproductive cycles equal to the reciprocal of the mutation rate happen; no matter the population size, the number of nucleotides a genome has, or the taxa at which it belongs. The main results are: i) the expected distribution of DNA bases in a site is an isotetranomial distribution, where Adenine (A), Guanine (G), Cytosine (C) and Thymine (T) occur with probability equal to 0.25; ii) the distribution of bases in a site is independent from the distribution of bases in other sites. Several expected consequences that can be contrasted with actual data are generated. Species or operational taxonomic units (OTUs) that evolved in big populations should present distances equal to zero and similarities equal to one. OTUs evolving in small populations should present distances equal to 3/4 and similarities equal to 1/4. Thus, random molecular evolution by recurrent mutation cannot yield a tree at all. The only possible tree is that produced by random fluctuations of distances according to their variances (stochastic tree). Some consequences of the model on the expected primary structure of proteins are also analyzed. There are sufficient generations for any DNA segment evolving apart during the last four hundred million years, to reach those expected base distributions

Autoanticuerpos, ¿sondas moleculares vigentes? su utilización en el reconocimiento de subdominios celulares denominados "cuerpos enrollados" (CE) / Autoantibodies, are they molecular probes validity?. Use in the coiled bodies identification

Los autoanticuerpos han sido utilizado como sondas moleculares desde principios de los 60, lo que ha permitido conocer y definir múltiples componentes funcionales celulares relacionados con mecanismos básicos de expresión genómica. Así, los autoanticuerpos anti-Sm, se asocian con pequeños RNAs nucleares (snRNA) que participan en el procesamiento del pre-RNAm, los anticuerpos anti-fibrilarina que identifican a pequeños RNAs nucleolares (snoRNA) y que han mostrado participar en el procesamiento del pre-RNAr. Recientemente, por ensayos de IFI y microscopía electrónica utilizando autoanticuerpos y oligonucléotidos sintéticos complementarios con algunos snRNA y/o snoRNAs, ha sido descrito que el subdominio nuclear celular denominado Cuerpo Enrollado (C.E.), se encuentra constituído por snRNA U1, U2, U4; U5, U6, snoRNA U3, detectándose algunos factores proteicos de splicing. Estos C.E poseen una proteína que los caracteriza y que se denomina p80 coilina. Se han descrito múltiples componentes para estos C.E.; sin embargo, su papel funcional celular no está definido

Utilizaçäo da Técnica do AgNOR em patologia óssea / Utilization of AgNOR Technique in osseous pathology

A técnica da prata coloidal para a identificaçäo das regiöes organizadoras nucleolares (AgNOR) foi aplicada em 20 espécimes parafinizados de lesöes ósseas dos maxilares, sendo 05 osteossarcomas, 05 osteoblastomas, 05 osteomas e 05 fibromas ossificantes centrais. Foram realizadas análises quantitativas, através do método visual e computadorizado das regiöes organizadoras nucleolares (NORs). Os valores obtidos para a contagem do número de NORs por núcleo, através desses métodos foram os seguintes recpectivamente: osteossarcoma 3,11 e 3,25; osteoblastoma 1,64 e 1,79; osteoma 1,33 e 1, 58 e fibroma ossificante central 2,18 e 2,11. Para esses resultados, a análise estatística revelou significância na diferença entre o número médio de NORs por núcleo dos osteossarcomas em relaçäo às demais entidades estudadas. A análise dos valores obtidos para área, perímetro e forma das NORs, através do método computadorizado, demonstrou os seguintes valores médios respectivamente: osteossarcoma 2,37µm², 6,02µm e 0,70; osteoblasma 1,39µm², 4,60µm e 0,71; osteoma 0,56µm², 2,78µm e 0,74 e fibroma ossificante central 1,76µm², 5,69µm e 0,79. Foi estatisticamente significante a diferença entre os tumores estudados foi significante entre osteossarcoma e osteoma, para área; entre osteossarcoma e osteoma e entre osteoma e fibroma ossificante central, para perímetro; entre osteossarcoma e fibroma ossificante central e entre osteoblastoma e fibroma ossificante central, para forma. Nossos resultados mostraram a eficiência da Técnica do AgNOR em patologia óssea, salientando as vantagens do método computadorizado, no que diz respeito a possibilitar uma precisa análise morfodimensional. Com base nesses achados sugerimos a utilizaçäo de tal técnica como coadjuvante no diagnóstico histopatológico de neoplasias ósseas

Nuevas estrategias en la evaluación clínica de pacientes con cáncer de colon con base en estudios moleculares / New trends a clinical evaluation of patients with colon cancer by molecular studies

En los últimos 5 años, las investigaciones en biología molecular han proporcionado información en el conocimiento del cáncer de colon, con sus consecuentes implicaciones clínicas. La base central de este conocimiento es la identificación y secuenciación del gen APC en el brazo largo del cromosoma 5. Alteraciones estructurales de este gen se han identificaco en los pacientes con poliposis adenomatosa familiar (PAF) y, en el síndrome de Gardner, lo cual sugiere que se trata de una misma enfermedad. Alteraciones estructurales y/o funcionales del gen APC, a diferencia de las hereditarias, podrían también ser adquiridas y, por lo tanto la causa principal del cáncer de colon esporádico. La PAF es una de las pocas enfermedades hereditarias, en donde marcadores moleculares son de gran utilidad en el diagnóstico del padecimiento aún en etapas clínicas tempranas o asintomáticas. El análisis de estudios de unión, utilizando fragmentos polimórficos de ADN generados con enzimas de restricción (RFLPs) son de gran utilidad para proporcionar el consejo genético a las familias afectadas. El conocimiento de estos estudios oriente y define la conducta médica a seguir después de realizar un estudio clínico-molecular integral de la familia afectada. Un estudio molecular más directo y sofisticado, aunque más caro, en los pacientes con cáncer de colon es la identificación y secuenciación del gen APC. Con fines de diagnóstico e investigación y, con el objeto de crear un centro de referencia a nivel nacional de cáncer de colon hereditario, estamos realizando este tipo de estudios moleculares en el Departamento de Gastroenterología del INNSZ.

Retrorregulación: un mecanismo postranscripcional que controla la expresión genética / Retroregulation: a postranscriptional mechanism that controls gene expresión

La síntese de la integrasa del bacteriófago lambda se regula de manera diferencial durante las distintas etapas del ciclo infectivo. La expresión del gene int está sujeta a regulación postranscripcional por la región sib, localizada después del gene int en el DNA de lambda. La región sib regula negativamente la expresión del promotor pL. En este proceso, denominado retroinhibición, participan además de la RNasaIII, la polinucleótido fosforilasa y probablemente la RNasaII de E. coli. Por otro lado, la terminación de la transcripción en el sitio tI estimula la síntesis de la integrasa cuando esta se expresa a partir del promotor pI. A este proceso se le ha llamado retroestimulación. la región sib se sobrepone con el sitio terminador de la transcripción tI, sin embargo, la retrorregulación y la terminación de la transcripción son procesos independientes

Efecto de la tioacetamida sobre el hígado de rata en condiciones de diferente aporte de proteína en la diet a / Effect of thioacetamide on rat liver under different protein intakes conditions in the diet

En países subdesarrollados la mayoría de la población está expuesta a la deficiencia proteínica en la alimentación y consecuentemente al síndrome de prekwashiorkor, acompañado de bajas defensas del organismo. En estas condiciones aumenta la sensibilidad del humano a los agentes ambientales, cuyo número crece día a día y plantea un serio problema de salud, fundamentando la búsqueda de la fórmula alimentaria ópitma como medida protectora. El propósito de este trabajo es corroborar si la proteína de la alimentación puede fungir como antídoto de la acción tóxica de la tioacetamida que recae sobre el hígado y, al igual que la inanición proteínica, afecta la estructura y las funciones de los hepatocitos. El estudio se realizó a nivel subcelular (lisosomas) en aspectos enzimático (enzimas marcadoras-fosfatasa ácida, ribonucleasa ácida y catepsina) y morfológico. Se encontró: la tiocetamida en condiciones de aporte normal proteínico (18,5%) en la dieta provoca cambios moderados característicos (necrosis centrolobular, alteración del patrón enzimático y de la permeabilidad de membranas lisosomales). En deficiencia proteínica (4%) la afección es mucho más severa histológica y enzimáticamente (necrosis extensa, infiltración periportal grasa, alteración del patrón enzimático, permeabilidad de membranas lisosomal y celular). En condiciones de alimentación rica en proteína (44.5%) los cambios histológicos son discretos, sin afección enzimática ni estructural. Se concluye: el aporte elevado de proteína en la dieta surte en ratas efecto de antídoto de la acción hepatotóxica de la tioacetamida, hecho que plantea la posible utilidad de la proteína dietética en la protección del organismo contra la contaminación ambiental