Stx1 and Stx2 subtyping and antimicrobial resistance in Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolates from cattle and sheep feces in the Southeastern region of the State of Goiás, Brazil / Subtipagem de Stx1 e Stx2 e resistência antimicrobiana em isolados de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) de fezes de bovinos e ovinos na região sudeste de Goiás, Brasil

The present study was aimed at subtyping of Stx1 and Stx2 genes and characterization of antimicrobial resistance in 106 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains isolated from cattle and sheep feces. PCR was used to determine the subtypes, and the disk-diffusion method was used to evaluate the antimicrobial resistance. Ten antibiotics from five different classes were tested. Among the isolates of bovine origin, two subtypes of Stx1 (Stx1a and Stx1c), and four subtypes of Stx2 (Stx2a, Stx2b, Stx2c, and Stx2d) were identified. In isolates of sheep origin, two subtypes of Stx1 (Stx1a and Stx1c), and four subtypes of Stx2 (Stx2a, Stx2b, Stx2c, and Stx2 g) were identified. The results obtained suggest the presence of high diversity in Stx1 and Stx2 genes. Further, 96.6% (57/59) of bovine fecal strains and 89.4% (42/47) of sheep fecal strains showed resistance to at least one tested antibiotic. In both animal species, most strains were multidrug-resistant (MDR) (67.8% in cattle and 59.6% in sheep), with no significant difference between host animals. Adult animals were eight times more likely to have STEC with greater pathogenic potential. STEC with the highest pathogenic potential were three times more likely to be multidrug-resistant than STEC with the lowest pathogenic potential. The data reported in this study suggests the occurrence of strains with high potential pathogenicity in the region studied. Therefore, the ruminants of this region are carriers of strains that can cause infections in humans.(AU)

O presente estudo teve como objetivo subtipar os genes Stx1 e Stx2 e caracterizar a resistência antimicrobiana em 106 isolados de Escherichia coli produtoras de toxinas Shiga (STEC) isoladas de fezes de bovinos e ovinos. A PCR foi utilizada para determinar os subtipos e o método de difusão em disco foi utilizado para avaliar a resistência antimicrobiana. Dez antibióticos de cinco classes diferentes foram testados. Entre os isolados de origem bovina, foram identificados dois subtipos de Stx1 (Stx1a e Stx1c) e quatro subtipos de Stx2 (Stx2a, Stx2b, Stx2c e Stx2d). Nos isolados de origem ovina, foram identificados dois subtipos de Stx1 (Stx1a e Stx1c) e quatro subtipos de Stx2 (Stx2a, Stx2b, Stx2c e Stx2g). Os resultados obtidos sugerem a presença de alta variabilidade nos genes Stx1 e Stx2. Além disso, 96,6% (57/59) dos isolados fecais de bovinos e 89,4% (42/47) dos isolados de ovinos mostraram resistência a pelo menos um antibiótico testado. Em ambas as espécies animais, a maioria das cepas foi multirresistente (MDR) (67,8% em bovinos e 59,6% em ovinos), sem diferença significativa entre as espécies animais do reservatório. Os animais adultos tiveram oito vezes mais chances de apresentar STEC com maior potencial patogênico. STEC com o maior potencial patogênico teve três vezes mais chances de ser multirresistente do que o STEC com o menor potencial patogênico. Os dados relatados neste estudo sugerem a ocorrência de cepas com alto potencial de patogenicidade na região estudada. Portanto, os ruminantes dessa região são hospedeiros de isolados que podem causar infecções em humanos.(AU)

Síndrome hemolítico urémico asociado a Shigatoxina: ¿Cómo prevenirlo? / Shiga-toxin associated hemolytic uremic syndrome: how to prevent it?

Resumen: El síndrome hemolítico urémico (SHU) asociado a infección intestinal por bacterias productoras de Shigatoxina, que afecta principalmente a población infantil, puede causar morbilidad aguda grave, secuelas crónicas en varios órganos, y la muerte prematura en algunos de ellos. Dado su carácter zoonótico, adecuadas medidas de manejo agropecuario y correcta higiene de lo que consumimos es indispensable a la hora de prevenir la infección. Actualmente, una vez gatillado el SHU el manejo es médico y, principalmente, de soporte. En los últimos años diversas estrategias terapéuticas se han ido desarrollando para evitar que esta enfermedad ocurra, o, al menos, que pueda ser atenuada en sus consecuencias de morbi-mortalidad. El presente artículo describe acciones específicas a diferentes niveles de prevención de esta patología.

Abstract Hemolytic uremic syndrome (HUS) associated with intestinal infection by Shiga toxin-producing bacteria, which mainly affects children, can cause severe acute morbidity, chronic sequelae in seve ral organs, and premature death in some of them. Given its zoonotic nature, adequate measures of agricultural management and proper hygiene of what we consume are essential to prevent infection. Once the HUS is triggered, medical management is currently mainly supportive. In recent years, va rious therapeutic strategies have been developed to prevent this disease from occurring or, at least, to mitigate its morbidity and mortality consequences. This article describes specific actions at different levels of prevention of this pathology.

Prevalence and molecular characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from human and sheep in Al-Madinah Al-Munawarah / Prevalencia y caracterización molecular de cepas de Escherichia coli productoras de toxina Shiga en seres humanos y ovejas de Al-Medina Al-Munawarah

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains have emerged as important foodborne pathogens of global public health concern, causing life-threatening diseases. Sheep and their products have been documented as important reservoirs for STECs, especially E. coli O157. The aim of this study was to investigate STECs from diarrheal human and sheep in Al-Madinah Al-Munawarah, Saudi Arabia. Fecal samples were collected between June and August, 2015 from diarrheal humans (n = 134) and sheep (n = 87). Presumptive E. coli human-and sheep-isolated strains were identified for their serotypes, the associated virulence genes (Shiga toxin [stx1 , stx2 ], haemolysin [ehxA] and intimin [eae]) by polymerase chain reaction and their susceptibility to antibiotics. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to demonstrate the genetic relatedness between Serotype O157:H7 human- and sheep-isolated strains. Forty eight (48/221; 21.7%) STECs were recovered from both human and sheep, their serotypes were as follows: O157:H7, O26:H11, O157:HNM, O26:HNM, O128:H2, O48:HNM, O111:HNM and OUT:HUT. Various virulence profiles and multiple antibiotic resistance were observed among the isolates. Twenty eight O157:H7 serotypes (17 human isolates and 11 sheep isolates) were identified in 13 PFGE pulsotypes, where human and sheep isolates were highly related. PFGE banding profiles together with serotypes and genotypes afford proof that human and sheep can be colonized and infected with similar E. coli O157:H7 strains. Our findings highlight the importance of epidemiological and microbiological surveillance of STECs; as well as the development of control measures to decrease risks associated with zoonotic O157:H7.

Las cepas de Escherichia coli (E. coli) productoras de toxina Shiga (STEC, del inglés Shiga toxin-producing E. coli) han surgido como importantes agentes patógenos de origen alimentario que son motivo de preocupación para la salud pública mundial, ya que provocan enfermedades potencialmente mortales. Se ha confirmado que las ovejas y sus productos son reservorios importantes para la STEC, especialmente E. coli O157. El objetivo de este estudio fue investigar STEC procedentes de deposiciones diarreicas humanas y ovinas en Al-Medina Al-Munawarah (Arabia Saudí). Se recogieron muestras fecales entre junio y agosto de 2015 de deposiciones diarreicas humanas (n = 134) y ovinas (n = 87). Se identificaron las presuntas cepas de E. coli humanas y ovinas por sus serotipos, los genes de virulencia asociados (toxina Shiga [stx1, stx2], hemolisina [ehxA] e intimina [eae]) por reacción en cadena de la polimerasa y la susceptibilidad a los antibióticos. Se utilizó la electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) para demostrar el parentesco genético entre el serotipo O157:H7 de las cepas humanas y el de las ovinas. Se aislaron 48 STEC (48/221; 21,7%) tanto humanas como ovinas y sus serotipos fueron los siguientes: O157:H7, O26:H11, O157:HNM, O26:HNM, O128:H2, O48:HNM, O111:HNM y OUT:HUT. Entre las cepas se observaron varios perfiles de virulencia y resistencia a múltiples antibióticos entre los aislamientos. Se identificaron 28 serotipos O157:H7 (17 cepas humanas y 11 cepas ovinas) en 13 pulsotipos de la EGCP, en los que las cepas humanas y ovinas estaban sumamente vinculadas. Los perfiles de bandeos de la EGCP, junto con los serotipos y genotipos, ofrecen una prueba de que seres humanos y ovejas pueden ser colonizados e infectados por cepas similares de E. coli O157:H7. Nuestros resultados destacan la importancia de la vigilancia epidemiológica y microbiológica de STEC, así como del desarrollo de medidas de control para reducir los riesgos asociados con la O157:H7 zoonótica.

Avaliação da capacidade de formar biofilme de Escherichia coli produtoras de shiga toxina / Biofilm-forming ability of shiga toxin-producing Escherichia coli / Evalución de la capacidad de formar biopelícula de Escherichia coli productoras de toxina shiga

O objetivo deste trabalho foi avaliar a formação de biofilme por cepas de Escherichia coli produtoras de shiga toxina (STEC) previamente isoladas de fezes de bovinos de corte e de leite no sul do Rio Grande de Sul, Brasil. 165 cepas foram cultivadas nas cavidades de placas de microtitulação, lavadas, retirado o sobrenadante e coradas. Após, a absorbância medida em cada cavidade foi comparada com controles negativos e positivos. Nenhuma das cepas de STEC isoladas de fezes de bovinos do sul do Brasil analisadas neste estudo apresentou capacidade de formar biofilme.

This study evaluated the biofilm-forming ability of shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains previously isolated from beef and darry cattle in Rio Grande do Sul, Brazil. 165 strains were grown in wells of microtiter plates, washed, the supernatant removed and stained. After, the absorbance in each well compared with negative and positive controls. None of the STEC strains isolated from feces of cattle in Southern Brazil analyzed in this study showed the ability to form biofilm.

El objetivo de este estudio fue evaluar la formación de biopelícula por cepas de Escherichia coli productoras de toxina Shiga (STEC), previamente aisladas de heces de ganado de carne y de leche, en el sur de Rio Grande do Sul, Brasil. 165 cepas han sido cultivadas en las cavidades de placas de microtitulación, lavadas, retirado el sobrenadante y coloradas. Después, la absorbencia medida en cada cavidad fue comparada con controles positivos y negativos. Ninguna de las cepas STEC aisladas de heces de ganado, en el sur de Brasil, analizadas en este estudio, demostró la capacidad de formar biopelí-cula.

Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2) / Evaluation of interaction of Enterohaemorrhagic (EHEC) 0157: H7 isolated from asymptomatic cattle and human disease with human enterocitic cells

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas ‘attaching/effacing’ (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c...

Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated “attaching/effacing” (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains...

Aislamiento de Escherichia coli O145: NM en casos de síndrome urémico hemolítico / Escherichia coli 0145-. NM isolated from hemolytic uremic syndrome cases

En Argentina se notifican más de 500 nuevos casos de síndrome urémico hemolítico (SUH) anuales. El objetivo del trabajo fue investigar epidemiológicamente casos de SUH y contactos de los que se aislaron cepas de STEC O145:NM que pertenecían a un mismo cluster. Para detectar STEC se realizó PCR-múltiple para amplificar genes de toxinas Shiga 1 y 2, y otros marcadores de virulencia como eae y ehxA. Se subtipificó STEC por separación por electroforesis de campos pulsados (XbaI-PFGE). Entre enero y febrero de 2006, en tres casos de SUH y un contacto familiar conviviente se identificó STEC O145:NM. Genotípicamente se caracterizaron como productores de stx2, eae+ y ehxA+. Todas las cepas presentaron el mismo patrón por XbaI-PFGE (AREXSX0 1.0207) y por B/nI-PFGE (AREXSA26.0018). Estas cepas pertenecieron a un mismo cluster, diseminado en distintos barrios de la ciudad de Mar del Plata. Los datos de la investigación epidemiológica fueron incompletos para establecer un nexo entre los casos. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de ocurrencia de un brote difuso. Se destaca la importancia que tiene el sistema de vigilancia de laboratorio en tiempo real mediante PFGE como mecanismo de alerta que sirve para afianzar los resultados con los datos de epidemiología.

More than 500 new cases of hemolytic uremic syndrome (HUS) are annually reported in Argentina. The aim of this work was to carry out epidemiological studies on cases of HUS and their household contacts that were isolated from STEC O145 strains: NM belonging to the same cluster. In order to detect STEC, Multiplex PCR was performed to amplify Shiga toxin 1 and 2 genes and other virulence markers like eae and ehxA. STEC was subtypified by means of separation by pulsed field electrophoresis (PFGE-XbaI). Between January and February 2006, STEC O145:NM strains were identified in three cases of HUS and one household contact. Genotypically, they were characterized as producing stx2, eae+ and ehxA +. All strains showed the same pattern by PFGE-XbaI (AREXSX01.0207) and BlnI-PFGE (AREXSA26.0018). These strains belonged to the same cluster, scattered in different areas of the city of Mar del Plata. Data from epidemiological research were not enough to establish a link between the cases. However, the possibility of occurrence of a diffuse outbreak. is not ruled out The importance of a laboratory surveillance system in real time by PFGE is stressed, as a warning mechanism that serves to strengthen the results with epidemiologic data.

Síndrome hemolítico urémico asociado a infección por E. coli productor de toxina de shiga / Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome

E.coli productora de Toxina Shiga (STEC), también conocida como E.coli entero- hemorrágica (EHEC), provoca un amplio espectro de manifestaciones clínicas, ya sea en brote o en forma esporádica, que incluyen dolor abdominal, fiebre leve o ausente, con o sin vómitos, diarreas (sanguinolenta o no), y complicaciones extraintestinales como: síndrome hemolítico urémico (SHU) que se observa hasta en un 5-6 por ciento de niños infectados, y púrpura trombocitopénico (7 por ciento de adultos). EI principal factor de virulencia es la producción de una familia de moléculas denominada STX (Shiga toxin), de las cuales STX 1 y 2 son las más frecuentes y característica distintiva de estos E.coli. EI principal serogrupo involucrado en Chile es O157:H7 pero también se han aislado 026, 055, 02, 0117 y 06 (generalmente clasificadas como E. coli serogrupo clásico, no enterohemorrágico). Es fundamental para el clínico conocer la epidemiología, sintomatología y los exámenes que permitan un diagnóstico rápido para manejo terapéutico adecuado, y así evitar las complicaciones enunciadas anteriormente.

Shiga toxin producing E.coli (STEC), also known as enterohemorragic E.coli (EHEC), are responsible for a wide variety of clinical manifestations, both epidemic and sporadic. These include abdominal pain, no fever to mild fever, with or without vomits, diarrhea (bloody or not) and extraintestinal complications, such as haemolytic uremic syndrome in about 5 to 6 percent of children, and trombocitopenic purpura in 1 percent adults. The main virulence factor involved is the production of STX (Shiga toxin). In Chile there is marked prevalence of E.coli serogroup 0157 :H7 in these cases, although it has been associated also to E.coli 026, 055,02,0117 and 06, considered as classic serogroup (not enterohemorragic). It is of outmost importance for clinicians to be aware of symptoms and signs of this disease, as well as diagnostic methods that allow a prompt and adequate treatment, in order to avoid complications.

Escherichia coli produtora de toxina shiga (STEC): principais fatores de virulência e dados epidemiológicos / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC): principal virulence factors and epidemiology

Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) é um importante patógeno veiculado por alimentos, principalmente produtos derivados de carne bovina e está associado a quadros de diarréias leves a severas e sanguinolentas. Em alguns indivíduos, a infecção por STEC pode progredir para a síndrome hemolítico-urêmica (HUS), seqüela caracterizada pela falência renal e a púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), com possível envolvimento do sistema nervoso central. O gado bovino, geralmente saudável, é o principal reservatório de STEC, embora estas cepas também tenham sido isoladas de outros animais domésticos: ovelhas, cabras, cães, gatos e suínos. A principal característica de virulência, a produção de toxinas Shiga, não é suficiente para causar doenças e outros fatores são considerados relevantes, como a produção de nterohemolisina e de adesinas fimbriais e afimbriais. Embora as doenças humanas associadas a STEC sejam pouco descritas no Brasil, podemos observar uma significativa ocorrência destas cepas nos rebanhos bovinos, bem como a correlação entre sorotipos encontrados nestes animais e em pacientes humanos.

Shiga toxin producing Escherichia coli is an important food borne pathogen, mainly beef products, andis associated to mild and severe bloody diarrhea. In some individuals, STEC infection can progress tohemolytic-uremic syndrome (HUS), a sequela characterized by renal failure, and thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), with possible central nervous system involvement. Cattle, usually healthy, is the principal reservoir of STEC, although these strains have also been isolated from other domestic animals: sheep, goats, dogs, cats and pigs. The principal virulence feature, the production of Shiga toxins, is not enough to cause diseases, and other factors are considered important, as enterohemolysin and fimbrial and afimbrial adhesions production. Although human diseases associated to STEC have not been frequently reported in Brazil, their presence is frequent in cattle, as well as the correlation between serotypes found in these animals and human patients.

Papel de la Toxina Shiga en el sindrome urémico hemolítico / Role of the Shiga toxin in the hemolytic uremic syndrome

In the last years, infection associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and subsequent Hemolitic-Uremic Syndrome (HUS) became relevant as a public health since it was considered as one of the most important emergent patogen present in the food contaminated by cattle feces. STEC infection may be asymptomatic or begins with a watery diarrhea that may or may not progress to bloody diarrhea (hemorrhagic colitis) and HUS. In Argentina, HUS is the most common pediatric cause of acute renal insufficiency and the second cause of chronic renal failure. Up to now, STEC infection lacks of known effective treatment strategies that diminish risk of progression to HUS. The mechanisms by which Shiga toxin (Stx) induce HUS may help to find strategies to prevent or ameliorate HUS. In this article, recent progress that has contributed to understanding the disease pathogenesis of STEC is reviewed. New strategies to prevent further uptake of Shiga from the gut, either during the diarrheal phase or once HUS has developed are discussed.

Epidemiologia del síndrome urémco hemolítico en Argentina: diagnóstico del agente etiológico, reservorios y vías de transmissión / The epidemiology of hemolytic uremic syndrome in Argentina. Diagnosis of the etiologic agent, reservoirs and routes of transmission

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) cause sporadic cases and outbreaks of nonbloody and bloody diarrhea, and hemolytic uremic syndrome (HUS). E. coil O157:H7 is the most prevalent STEC serotype. However, other serotypes (O26:H11; O103:H2; O111:NM; O121:H19; O145:NM, among others) can cause a similar disease spectrum. Shiga toxins (Stx1, Stx2, and their variants), intimin, and enterohemolysin are the main virulence factors. Three different diagnostic criteria are used to determine the frequency of STEC infection: 1) isolation and characterization of STEC strains; 2) detection of specifically neutralizable free fecal Stx; and 3) Serological tests to detect Stx-antibodies. The surveillance of the STEC strains is performed using subtyping techniques: a) genotyping of Stx and eae by PCR-RFLP; b) phage typing of E. coil O157 strains; and c) pulsed-field gel electrophoresis. STEC O157 and non-O157 strains are recovered from clinic, animal, food and environmental samples, and E. coli O157:H7, a Stx2 and Stx2c producer, harboring eae and ehxA genes, is the most common serotype. During a prospective case-control study conducted to evaluate risk factors for sporadic STEC infection in Mendoza Province and Buenos Aires City and its surroundings during 2001-2002, exposures associated with risk included eating undercooked beef, contact with a child < 5 years with diarrhea and living in or visiting a place with farm animals. Both washing hands after handling raw beef, and eating fruits and vegetables were frequently protective. Strategies of prevention and control are necessary to decrease the incidence of STEC infections in Argentina.

Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC): marcadores de virulência e análise clonal / Shiga toxin-producing Escherichia coli(STEC): virulence markers and clonal analysis

Foi estudada uma coleção de 48 cepas de Escheríchía cali produtoras de toxina Shiga (STEC), a maioria de origem humana, e 30 cepas de E. cali não STEC de origem humana, portadoras da seqüência eae e pertencentes aos mesmos sorogrupos de STEC, isoladas no período entre 1976-03. Foram analisadas as características fenotípicas, os fatores de virulência e a diversidade genética. A maioria das cepas STEC originou de estudos realizados em dois períodos distintos: um estudo retrospectivo incluindo o período 1976-99 e um estudo prospectivo desenvolvido no período 2000-03. Excetuando duas cepas isoladas do mesmo paciente durante o estudo prospectivo, todas as cepas de origem humana eram de infecções esporádicas e não relacionadas. Entre os diferentes sorotipos de STEC identificados, a maioria pertencia aos sorotipos 0111:H-, 0111:H8, 026:H11 e 0157:H7. Observou-se, no entanto, uma variação em relação a ocorrência dos sorotipos STEC não-0157 no período estudado. Enquanto os sorotipos 0111 :H8 (H-) e 026:H11 predominaram entre aquelas isoladas no período 1976-99, no período 2000-03 foi identificada apenas uma cepa STEC 0111:H-. A ausência de fermentação da ramnose e dulcitol estava mais associada às cepas STEC e não STEC pertencentes ao sorogrupo 026, enquanto que as cepas STEC do sorogrupo 0111 se distinguiram por não descarboxilar a lisina. A maioria das cepas STEC foi sensível a todos os antimicrobianos testados; porém múltiplas marcas de resistência foram observadas, principalmente, em algumas cepas do sorogrupo 0111. Todas as cepas STEC 0157:H7 eram portadoras do gene stx2. Cepas pertencentes aos sorotipos 093:H19 e 077:H18, pertenciam ao genótipo stx1 stx2, enquanto que os demais sorotipos STEC carreavam apenas a seqüência stx 1. A seqüência eae foi identificada em todas as cepas STEC, exceto entre aquelas pertencentes aos sorotipos 093:H19, 077:H18 e 055:H19 e observou-se uma estreita relação entre os tipos de intimina, sorotipos e categoria diarreogênica. A presença da seqüência ehxA foi variável segundo os sorotipos. Com exceção do sorogrupo 026, as cepas STEC e não STEC do mesmo sorogrupo pertenciam a distintos grupos clonais determinado pela técnica de eletroforese em campo pulsado. Observou-se que cepas STEC com distintas características fenotípicas e genotípicas, estavam presentes em nosso meio desde a década de 70 e as características moleculares apontaram para uma provável ocorrência de um surto de infecção O157:H7.

Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga / Validation of a multiplex PCR for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli

La infección por Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es causa de diarrea con o sin sangre, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH) en humanos. El objetivo de este trabajo fue validar una técnica de PCR múltiple para el diagnóstico de STEC basado en la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157. La validación de la técnica se realizó en dos laboratorios independientes, en forma paralela. Se determinó rango de trabajo, selectividad y robustez. Se evaluó el desempeño de la técnica al combinar distintas concentraciones de dos cepas con diferentes factores de virulencia. El rango de trabajo dependió de la cepa analizada, los valores máximos y mínimos fueron 6,6 x 107 y 1,0 x 104 UFC/50 µl. El límite de detección fue de 1,0 x 104 UFC/50 µl y el límite de corte de 1,0 x 105 UFC/50 µl. La robustez fue óptima al modificar diferentes variables. Se obtuvo 100% de inclusividad, exclusividad, precisión analítica, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. No se observó interferencia al combinar distintas concentraciones de los factores de virulencia blanco de la reacción. La técnica validada es una alternativa apropiada para la detección y confirmación de STEC O157 y no-O157 a partir de cultivos bacterianos.

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) cause non-bloody or bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans. The aim of the present study was to validate a multiplex PCR for the STEC diagnosis based on the detection of stx1, stx2 and rfbO157 genes. The multiplex PCR validation was carried out in two independent laboratories in a parallel way. Work range, selectivity and robustness were established. The PCR performance was evaluated using different concentrations of two STEC strains harboring different target genes. The work range depended on the strain analyzed, the maximum and the minimum values were 6.6 x 107 and 1.0 x 104 CFU/50 µl. The detection limit was 1.0 x 104 CFU/50 µl and the cut limit 1.0 x 105 CFU/50 ml. A good robustness was observed when different variables were introduced. Inclusivity, exclusivity, positive predictivity, negative predictivity and analytical accuracy were of 100%. Interference was not shown when different concentrations of STEC strains, carrying different genes, were used. The validated technique is an appropriate alternative for detection and confirmation of STEC O157 and non-O157 strains from bacterial cultures.

Perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos en cepas de E coli productoras de Shiga toxina (STEC) aisladas de infecciones humanas y de alimentos / Antimicrobial susceptibility of shiga toxin producing E coli (STEC) strains isolated from human infections and food

BACKGROUND: Shiga toxin-producing E coli (STEC) are zoonotic pathogens associated to sporadic episodes of bloody diarrhea, foodborne outbreaks, and Hemolytic Uremic Syndrome (HUS), with worldwide public health impact. Antibiotic use in STEC infections is controversial because of the potential to increase production and secretion of Shiga toxins. AIM: To study the in vitro antimicrobial susceptibility profile of STEC. MATERIAL AND METHODS: The in vitro susceptibility profile against 10 antimicrobials of STEC strains isolated from 29 meat products, 20 patients with diarrhea and 9 HUS patients was studied. Minimal Inhibitory Concentrations (microg/ml) by agar dilution method for ampicillin, cloramphenicol, ciprofloxacin, amikacin, gentamycin, cotrimoxazol, ceftriaxone, tetracycline, fonsfomycin and azihromycin were measured according to NCCLS recommendations. RESULTS: Strains from patients with diarrhea or HUS were all susceptible to the 10 antimicrobials and only 13.7% had intermediate resistance to cloramphenicol. Strains from meat products had a similar susceptibility profile, with only 3.5% resistance to tetracycline, 3.5% intermediate resistance to cloramphenicol and 7% to fosfomycin. All 58 strains were considered resistant to azithromycin (MIC >32 microg/ml). CONCLUSIONS: Similarity of susceptibility profiles between STEC strains from human and food origin suggests a role of food chain in transmission to humans.

Evaluation of a QIAamp DNA stool purification kit for Shiga-toxigenic Escherichia coli detection in bovine fecal swabs by PCR / Evaluación del kit QIAamp DNA stool purification para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga en hisopados de materia fecal bovina por PCR[

A commercial kit intended for Taq polymerase inhibitor removal was tested to detect Shiga-toxigenic Escherichia coli (STEC) by polymersase chain reaction (PCR) directly from cattle fecal samples. Forty-five samples were analysed for the presence of stx genes. Results were compared to those obtained by two other methods: amplification of DNA purified by a non-commercial procedure (heat lysis protocol), and amplification of DNA from samples cultured in solid media, commonly used in our lab. Identical numbers of positive samples (33/45, 73 %) were obtained with the QIAamp DNA stool purification kit and the culturing procedure, suggesting an adequate removal of inhibitors that interfere in PCR amplification from the feces. Besides, the number of positive samples detected using DNA purified by the non-commercial protocol was lower, 25/39 (64%) than that achieved by using the kit. In conclusion, the use of the QIAamp DNA stool purification kit provided a rapid stx gene detection by PCR in bovine fecal samples.

Un kit comercial diseñado para la eliminación de inhibidores de la polimerasa Taq fue ensayado para la detección de STEC por PCR en muestras fecales de bovinos. Cuarenta y cinco muestras fueron evaluadas por la presencia de genes stx. Los resultados fueron comparados con aquéllos obtenidos por otros dos métodos: amplificación de ADN purificado por un procedimiento no comercial (protocolo de lisis por calor), y amplificación de ADN de muestras cultivadas en medio sólido, comúnmente usado en nuestro laboratorio. El mismo número de muestras positivas (33/45, 73 %), fueron obtenidas con el QIAamp DNA stool purification kit y el procedimiento de cultivo, sugiriendo una eliminación adecuada de inhibidores que interfieren con la amplificación en materia fecal. Por otro lado, el número de muestras positivas detectadas usando ADN purificado por el protocolo no comercial fue menor, 25/39 (64%). En conclusión, el uso del kit QIAamp DNA stool purification permitió una detección rápida de genes stx por PCR en muestras fecales bovinas.

Detecção de Escherichia coli Shiga Toxigênica (STEC) através da amplificação dos genes Stx / Detection of Shiga Toxigenic Escherichia coli (STEC) by amplification of Stx genes

As Escherichia coli Shiga Toxigênicas (STEC) são patógenos emergentes, causadores de diarréia e doenças graves como colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica. As STEC diferenciam-se das demais estirpes de E. Coli pela produção de um ou mais tipos de toxina denominadas toxina Shiga 1 e 2, codificadas pelos genes Stx1 e Stx2, respectivamente. O diagnóstico microbiológico das infecções causadas por STEC é dificultado pelo rápido decréscimo no número de organismos excretados nas fezes após o início dos sintomas e pela diversidade bioquímica e sorológica das estirpes de STEC. O objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo de PCR para a detecção de STEC que seja adequado para a rotina dos laboratórios clínicos. As culturas de estirpes de STEC e outros organismos usados como controles e das amostras de fezes diarréicas foram realizadas em ágar MacConkey e incubadas a 36ºC por 18-24 horas. A extração de DNA foi realizada pelo métoda da fervura. Na PCR foi utilizado um único par de iniciadores, ATACAGAGGGA/GGA/GATTTCGT e CC/ATGATGATGG/ACAATTCAG, capaz de detectar os genes Stx, Stx2 e seus variantes numa mesma reação através da ampliação de um fragmento de DNA de aproximadamente 220 pares de base (pb). A PCR foi realizada em volume de 50ml, contendo 10 ml de DNA, tampão Taq 1X; MgCl2, 1,5mM, dNTP 200mM, iniciadores 1mM cada, Taq DNA polimerase 2U. Empregou-se 1 ciclo de 94ºC por 5 minutos e 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 47ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos, seguidos de 1 ciclo de 72ºC por 10 minutos. Os produtos de amplificação foram detectados através de eletroforese em gel de agarose a 2%. DNA extraído das estirpes de STEC O157:H7 (Stx1, Stx2) e O111 (Stx1) permitiu a amplificação de um fragmento de cerca de 220pb, mas nenhum produto de amplificação foi produzido quando o DNA de E. coli ATCC 25922 e de outros organismos controle não produtores de Stx foi utilizado. Foram analisadas 123 cultura de fezes e 3 apresentaram amplificação do fragmento de DNA de cerca de 220 pb, sugerindo a presença de Stx. O protocolo descrito neste trabalho mostrou-se sensível, específico e adequado ao laboratório clínico.