Efficacy of phosphocreatine pre-administration on XIAP and Smac in ischemic penumbra of rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury

Abstract Purpose: To observe the efficacy of phosphocreatine pre-administration (PCr-PA) on X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), the second mitochondia-derived activator of caspase (Smac) and apoptosis in the ischemic penumbra of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury (CIRI). Methods: A total of 60 healthy male Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups (n=20): group A (the sham operation group), group B <intraperitoneally injected with 20 mg/kg (10 mg/ml) of saline before preparing the ischemia-reperfusion (IR) model>, and group C <intraperitoneally injected with 20 mg/kg (10 mg/ml) of PCr immediately before preparing the IR model>. After 24 h for reperfusion, the neurological function was evaluated and the tissue was sampled to detect expression of XIAP, Smac and caspase-3 positive cells in the ischemic penumbra so as to observe the apoptosis. Results: Compared with group B, neurological deficit scores, numbers of apoptotic cells, expression of Smac,caspase-9 and the numbers of Caspase-3 positive cells were decreased while expression of XIAP were increased in the ischemic penumbra of group C. Conclusions: Phosphocreatine pre-administration may elicit neuroprotective effects in the brain by increasing expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein, reducing expression of second mitochondia-derived activator of caspase, and inhibiting the apoptosis in the ischemic penumbra.

High expression of XIAP and Bcl-2 may inhibit programmed cell death in glioblastomas / Alta expressão de XIAP e Bcl-2 pode inibir morte celular programada em glioblastomas

ABSTRACT Glioblastoma (GBM) is the most malignant glioma and represents 29% of all brain tumors. Tumorigenesis is intimately connected with characteristics acquired in the physiologic pathway of cellular death. Objective: In the present study, the expression of anti-apoptotic (XIAP and Bcl-2) and apoptotic (cytochrome C, caspase 9, APAF-1), caspase 3 and the Smac/DIABLO genes related to the apoptosis pathway were evaluated in 30 samples of glioblastoma. Methods: The gene expression was evaluated in 30 glioblastomas (WHO grade IV) and compared to 10 white matter control samples with real-time PCR. Results and Conclusion: There were higher expressions of XIAP (p = 0.0032) and Bcl-2 (p = 0.0351) in the glioblastoma samples compared to the control samples of normal brain. These results raise the question of whether Bcl-2 and XIAP genes can be responsible for the inhibition of programmed cell death in glioblastomas. Moreover, they provide additional information capable of allowing the development of new target therapy strategies.

RESUMO O glioblastoma (GBM) é o glioma mais maligno e representa 29% de todos os tumores cerebrais. A tumorigênese está intimamente ligada à características adquiridas na via fisiológica de morte celular. Objetivo: Avaliar a expressão de genes anti-apoptóticos (XIAP e Bcl-2) e apoptóticos (citocromo C, a caspase 9, APAF-1), caspase 3 e SMAC/DIABLO, relacionados à apoptose, em 30 amostras de tecido de pacientes com glioblastoma. Métodos: A expressão gênica foi avaliada em trinta glioblastomas e comparada a dez amostras controles de substância branca por PCR em tempo real. Resultados e Conclusão: Houve maior nível de expressão de XIAP (p = 0,0032) e Bcl-2 (p = 0,0351) em comparação com as amostras controle, de cérebro normal. Estes resultados levantam a questão de que os genes Bcl-2 e XIAP podem ser responsáveis pela inibição da morte celular programada em glioblastomas, além disso, proporcionam informação adicional capaz de permitir o desenvolvimento de novas estratégias de terapia alvo.

Efecto mutagénico y genotóxico, y expresión de los genes Rad51C , Xiap , P53 y Nrf2 inducidos por extractos antipalúdicos de plantas recolectadas en el Vaupés medio, Colombia / Mutagenicity, genotoxicity and gene expression of Rad51C, Xiap, P53 and Nrf2 induced by antimalarial extracts of plants collected from the middle Vaupés region, Colombia

Resumen Introducción. Dada la resistencia de Plasmodium a los medicamentos antipalúdicos, es necesario encontrar nuevas alternativas terapéuticas para su tratamiento y control. Con base en el saber indígena colombiano, se recopilaron extractos de plantas del Vaupés medio con potencial efecto antipalúdico. Objetivo. Evaluar el efecto mutagénico y genotóxico, y la expresión de los genes Rad51C, Xiap, P53 yNrf2, inducidos por cuatro extractos etanólicos con actividad anti-Plasmodium(R001, T002, T015 y T028). Materiales y métodos. Se evaluó el potencial mutagénico de cuatro extractos etanólicos con efecto antiplasmódico utilizando el test de Ames y el efecto genotóxico, con un ensayo del cometa; asimismo, se analizó la expresión de los genes Rad51C, Xiap, P53 y Nrf2 en células HepG2. Resultados. Los extractos no fueron mutágenos en la cepa TA98 de Salmonella typhimurium en presencia y ausencia de actividad metabólica de la fracción S9. En la cepa TA100, los extractos R001, T015 y T028 se comportaron como mutágenos débiles en presencia de S9, con índices mutagénicos de 1,58; 1,38; 1,53 y 1,61, respectivamente; T015 tuvo el mismo comportamiento en ausencia de S9, con un índice mutagénico de 1,36. En el ensayo del cometa, todos los extractos provocaron daño de categorías 1 o 2, con colas de cometas entre 36,7 y 51,48 µm de longitud; sin embargo, el índice dedaño genético sugirió que los tratamientos afectaron la mayoría de las células. En los genes en estudio, los extractos R001 y T028 indujeron una sobreexpresiónde 1,84 a 3,99 frente a las células sin tratar de los genes Xiap y P53. Conclusiones. Los resultados evidenciaron que el extracto T002 fue el más seguro, ya que presentó actividad anti-Plasmodium, no fue citotóxico en las células HepG2, no fue mutágeno, causó daño de categoría 1 en el ADN y no modificó la expresión de los genes evaluados.

Abstracts Introduction: Due to Plasmodium resistance to antimalarial drugs, it is important to find new therapeutic alternatives for malaria treatment and control. Based on the knowledge of Colombian indigenous communities, we collected extracts of plants with potential antimalarial effects from the middle Vaupés region. Objective: To evaluate the mutagenic and genotoxic effects, as well as the gene expression of Rad51C, Xiap, P53 and Nrf2 induced by four ethanolic extracts with antimalarial activity (R001, T002, T015 and T028). Materials and methods: We evaluated four ethanolic extracts with antimalarial activity using the Ames test to assess mutagenicity, and the comet assay on HepG2 cells to determine the genotoxicicity. We also evaluated the expression of Rad51C, Xiap, P53 and Nrf2 from HepG2 cells stimulated with the four extracts. Results: None of the four extracts was mutagenic in Salmonella typhimurium TA98 strain in the presence and absence of S9 metabolic activity. Extracts R001, T015 and T028 were weakly mutagenic on the TA100 strain in the presence of S9, with mutagenic indexes (MI) of 1.58, 1.53 and 1.61, respectively. The T015 strain showed the same behavior without S9 with an MI of 1.36. The results of the comet assay showed that the four extracts produced category 1 or 2 damage, with comets between 36.7 and 51.48 µm in length. However, the genetic damage index suggested that most of the cells were affected by the treatments. Regarding gene expression, extracts R001 and T028 induced an overexpression of genes Xiap and P53 with an 1.84 to 3.99 fold-change compared with untreated cells. Conclusions: These results revealed that the T002 extract was the safest as it had antimalarial activity and was not cytotoxic on HepG2 cells. Moreover, it was not mutagenic and it only produced category 1 damage on the DNA. Also, the extract did not induce a change in the expression of the tested genes.

Localização subcelular de XIAP: implicações na proliferação celular, resistência às drogas e prognóstico no câncer de mama / [Subcellular localization of XIAP: implications for cell proliferation, drug resistance and prognosis in breast cancer]

O câncer de mama é o tipo tumoral que mais acomete as mulheres no Brasil e no mundo, além de causar elevadas taxas de morbidade e mortalidade. Essa neoplasia tem como importante característica o desbalanço entre proliferação e morte celular. Nesse contexto, se insere a XIAP, uma proteína inibidora da apoptose (IAP), que exerce sua função antiapoptótica através da ligação e inibição de caspases, bem como ubiquitinação de proteínas-alvo. A XIAP é encontrada principalmente na porção citoplasmática tanto em células tumorais quanto em não neoplásicas, porém estudos mostram que também é possível detectar a sua expressão no núcleo. Dados prévios do nosso grupo mostram que a XIAP pode estar localizada tanto no citoplasma quanto no núcleo em pacientes com câncer de mama, porém não há muitos relatos acerca dos papéis exercidos pela XIAP em diferentes compartimentos celulares. O objetivo do presente estudo é elucidar o impacto da XIAP e sua localização subcelular na proliferação celular, resistência às drogas e no prognóstico no câncer de mama. Nossos dados mostram que todas as linhagens celulares investigadas apresentaram XIAP citoplasmática, exceto as células MCF-7 DoxR , resistentes à doxorrubicina (dox), que também apresentaram XIAP na fração nuclear, como avaliado por fracionamento subcelular e Western blotting. Pelos ensaios de MTT e clonogênico, observamos que o tratamento com a dox diminuiu a viabilidade celular e a capacidade de formação de colônias nas células MDA-MB-231 e MCF-7, porém o mesmo resultado não foi observado nas células MCF-7 DoxR , sugerindo que a localização nuclear de XIAP esteja associada ao fenótipo de resistência à dox. Corroborando esses achados, as células MCF-7 TaxR , resistentes ao paclitaxel, apresentaram expressão nuclear de XIAP, confirmando uma possível correlação da presença de XIAP nuclear com o perfil de resistência aos quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer de mama, independentemente do mecanismo de ação. Além disso, o tratamento com as drogas não alterou a localização subcelular de XIAP em nenhuma das células testadas. Adicionalmente, a indução da superexpressão dos mutantes XIAP∆RING e XIAPNLS C-term por transfecção transiente, onde é possível detectar expressão de XIAP nuclear, resultou no aumento da capacidade proliferativa das células MCF-7, como examinado pela contagem de células, ensaio clonogênico e de viabilidade celular. De maneira consistente, a indução de XIAP no núcleo promoveu a resistência ao tratamento com dox, confirmando os nossos achados prévios referentes à presença da XIAP no núcleo de células quimiorresistentes. Por fim, a análise de curvas de Kaplan-Meyer revelou que a localização nuclear da XIAP conferiu um prognóstico adverso nas pacientes negativas para receptores hormonais, enquanto que a presença de XIAP citoplasmática conferiu uma tendência ao melhor prognóstico nas pacientes desse subgrupo. De acordo, a expressão de XIAP citoplasmática foi associada à idade igual ou superior a 50 anos e ao tamanho de tumor T1, fatores de prognóstico favorável no câncer de mama. Em conjunto, nossos dados mostram que a expressão de XIAP pode ser encontrada em diferentes compartimentos subcelulares em linhagens celulares e amostras de pacientes com câncer de mama, estando a presença de XIAP no núcleo associada a um fenótipo de maior proliferação e resistência às drogas in vitro, além de um prognóstico desfavorável em pacientes com câncer de mama negativas para receptores hormonais.

Morphological and immunohistochemical analysis of apoptosis in the cerebellum of rats subjected to focal cerebral ischemia with or without alcoholism model

ABSTRACT PURPOSE: To evaluated histopathological changes, morphometric and expression of proteins CASPASE-3, BCL-2 and XIAP related to apoptosis in the cerebellum after induction of temporary focal cerebral ischemia followed by reperfusion, with or without a model of chronic alcoholism. METHODS: Fifty Wistar rats were used and divided into: control group (C), sham group (S), ischemic group (I), alcoholic group (A), and ischemic and alcoholic group (IA). The cerebellum samples collected were stained for histopathological and morphometric analysis and immunohistochemistry study. RESULTS: Histopathological changes were observed a greater degree in animals in groups A and IA. The morphometric study showed no difference in the amount of cells in the granular layer of the cerebellum between the groups. The expression of CASPASE-3 was higher than BCL-2 and XIAP in the groups A and IA. CONCLUSION: We observed correlation between histopathological changes and the occurrence of apoptosis in cerebellar cortex.

Avaliação de survivina e XIAP e dos fatores de transcrição foxo3a e foxM1 como potenciais biomarcadores de quimiorresistência no câncer de mama / [Evaluation of survivin and XIAP and transcription factors foxo3a and foxM1 as potential chemoresistance biomarkers in breast cancer]

O câncer de mama é a neoplasia que apresenta maior mortalidade entre as mulheres ao redor do mundo, apesar dos avanços na descoberta de novas modalidades terapêuticas e marcadores prognósticos. A resistência ao tratamento quimioterápico é uma das principais causas de falha terapêutica, apontando para a necessidade da identificação de biomarcadores preditivos de resposta. Evidências científicas mostram que a superexpressão de FoxM1 e das proteínas antiapoptóticas Survivina e XIAP, bem como a inativação do fator de transcrição Foxo3a, estão associados a quimioresistência e a um prognóstico desfavorável no câncer de mama. Dessa forma, o objetivo desse estudo é avaliar o papel das proteínas Survivina, XIAP, Foxo3a e FoxM1 como potenciais fatores de resistência à doxorrubicina (doxo), quimioterápico amplamente empregado no tratamento no câncer de mama. Nossos dados mostram que a doxo foi capaz de inibir a viabilidade celular nas linhagens celulares derivadas de carcinoma de mama MCF7 (não-invasiva, positiva para receptores de estrogênio e Her2) e MDA-MB-231 (invasiva, triplo-negativa), como avaliado pelo ensaio de MTT. A droga induziu a perda da adesão celular e fragmentação do DNA, como observado pela análise morfológica com quantificação das células não-aderidas e avaliação do conteúdo de DNA por citometria de fluxo. A análise da ativação das caspases-3, -7 e -9 por Western blotting revelou que a doxo induziu apoptose em células com diferentes status de p53. Em paralelo, o tratamento com a doxo resultou na redução dos níveis proteicos e de RNAm de XIAP e Survivina, como avaliado por Western blotting e PCR em tempo real, respectivamente. Entretanto, a indução da superexpressão da Survivina, por transfecção plasmidial, não foi capaz de conferir resistência ao quimioterápico. Corroborando esses resultados, observamos que o silenciamento gênico por siRNA de XIAP e Survivina, isoladamente ou em combinação, não sensibilizou as células à morte celular induzida pela doxo, indicando que tais proteínas não desempenham papel na resistência à droga. Contrariando dados da literatura, a doxo foi capaz de induzir a fosforilação de Foxo3a e Akt e reduzir a expressão de seu alvo transcricional Bim e dos níveis de RNAm de FOXO3A. De maneira consistente, a droga promoveu a translocação de Foxo3a do núcleo para o citoplasma, como examinado por fracionamento subcelular, apontando para a inativação da sua função. Além disso, a expressão do fator de transcrição FoxM1 foi reduzida, mediante o estímulo apoptótico induzido pela doxo. A indução da superexpressão de FoxM1 foi capaz de reverter a sensibilidade das células MDA-MB-231 à doxo, processo que envolveu a indução dos níveis de Survivina e XIAP. O mesmo efeito não foi observado nas células MCF7 superexpressando FoxM1, uma vez que se mantiveram sensíveis ao quimioterápico e apresentaram inalterados níveis de Survivina e XIAP. O conjunto dos nossos dados indica que a via de sinalização oncogênica mediada pelo fator de transcrição FoxM1 é capaz de promover a resistência à doxo e sugere que a combinação clínica de inibidores de FoxM1 com a doxo tem o potencial de sobrepujar a quimiorresistência no câncer de mama, principalmente em tumores triplo-negativos.

Breast cancer is the leading cause of deaths in women around the world, despite recent advances regarding novel therapeutic options and identification of prognostic factors. Resistance to therapy is the main cause of treatment failure and still there is no predictive biomarker for response to systemic therapy available. Increasing evidence shows that Survivin and XIAP antiapoptotic proteins and FoxM1 overexpression, as well as the inactivation of Foxo3a transcription factor, are closely associated with chemoresistance and poor prognosis in breast cancer. Thus, this study aimed to investigate Survivin, XIAP, Foxo3a and FoxM1 potential role on resistance to doxorubicin (dox), a chemotherapeutic agent widely used to treat breast cancer. Our data demonstrates that dox inhibited cell viability in the breast cancer derived cell lines MCF7 (non-invasive, Her2 and estrogen receptor positive) and MDA-MB- 231 (invasive, triple-negative), as evaluated through the MTT assay. The drug induced loss of cell adhesion and DNA fragmentation, as examined by morphological analysis followed by quantification of non-adherent cells and flow cytometry DNA content analysis. Western blotting evaluation of caspases-3, -7 and -9 activation revealed that dox induced apoptosis in cells with different p53 activation status. In parallel, exposure to dox resulted in reduction in Survivin and XIAP protein and mRNA levels, as evaluated by Western blotting and real time PCR, respectively. However, when we transfected cells with a Survivin-encoding plasmid, we did not observe a cell death-resistant phenotype. Accordingly, XIAP and Survivin silencing through siRNA, individually or in combination, had little effect on breast cancer cells sensitivity towards dox, suggesting that the drug can induce apoptosis independently of their expression. Contrasting data in the literature, dox treatment induced Foxo3a and Akt phosphorylation and reduced the expression of its transcriptional target Bim and FOXO3A mRNA levels. In agreement, dox-exposed cells displayed Foxo3a expression in cytoplasm, differently from predominantly nuclear Foxo3a observed in untreated cells, as examined through subcellular localization. These data point to dox-induced Foxo3a inactivation in breast cancer cells. In addition, we observed that FoxM1 transcription factor expression was inhibited upon dox-mediated apoptotic stimuli. Importantly, FoxM1 overexpression could counteract apoptosis in MDA-MB-231 cells, along with induction of Survivin and XIAP expression. This effect was not observed in MCF7 cells, which remained similarly sensitive to dox and displayed Survivin and XIAP levels unaltered. Altogether, our results demonstrate that FoxM1 signaling pathway can promote dox resistance and suggest that combining FoxM1 inhibitors with dox has the potential to circumvent chemoresistance in breast cancer, specially in triple negative tumors.

Effects of Epstein-Barr virus on the development of dendritic cells derived from cord blood monocytes: an essential role for apoptosis

OBJECTIVE: Epstein-Barr virus (EBV) is a ubiquitous human γ-herpes virus, which can adapt and evade host immune defense. Dendritic cells (DCs) play a pivotal role in the initiation and maintenance of immune responses. This study investigated the effects of EBV on cord blood monocytes derived DCs (CBDC). METHODS: Monocytes were isolated from cord blood and cultured in medium containing recombinant IL-4 and GM-CSF to induce DCs development. B95-8 supernatant was added in monocytes culture medium for EBV infection at day 0. Phenotypic characterization of DCs, apoptotic cells, and mitochondrial membrane potential (MMP) were detected by flow cytometry. The morphology was observed by Hoechst 33258 staining and TUNEL staining, the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) was detected by Western blotting assay and caspase 3, 8 and 9 activity was measured. RESULTS: Phenotypic characterization of DCs was changed in EBV-treated group. Chromatin condensation and DNA fragmentation were observed in EBV induced CBDC apoptosis. In addition, caspase 3, caspase 8, and caspase 9 activation were enhanced in the EBV-treated group. This was accompanied by the loss of MMP. Furthermore, XIAP expression was down-regulated in the EBV-treated group and compared to mock-infected group. CONCLUSION: These results suggested that EBV could inhibit CBDC phenotypic differentiation, and induce CBDC apoptosis in caspase-dependent manner with involvement of the mitochondrial pathway. This might help EBV to evade host immune responses to establish persistent infection.