Modificações pós-traducionais durante o processo de amastigogênese do Trypanosoma cruzi / Post-translational modifications during the amastigogenesis of Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi constituindo-se em um problema de saúde pública em vários países da América Latina. No seu complexo ciclo de vida, o protozoário passa por quatro estágios diferentes: tripomastigota metacíclica, amastigota, tripomastigota sanguíneo e epimastigota, que permitem sua sobrevivência nos diferentes ambientes com os quais o parasita entra em contato. A diferenciação dos tripomastigotas de T. cruzi em amastigotas (amastigogênese) ocorre com grandes mudanças morfológicas, estruturais e metabólicas no parasita e pode ser reproduzido in vitro por exemplo, pela acidificação do meio extracelular. Apesar dos vários trabalhos descritos na literatura, o processo ainda não é totalmente compreendido. A participação de NO na transdução de sinal durante a amastigogênese, sugerida por dados não publicados de nosso grupo, assim como a via de sinalização dependente de AMPc, foram o foco do presente estudo. A indução da amastigogênese foi obtida por incubação de tripomastigotas em meio de cultura acidificado (pH 6,0) e os parâmetros estudados comparados com parasitas controle (meio de cultura, pH 7,4). Estudamos a variação no perfil de nucleotídios cíclicos (AMPc, GMPc), de quinases (PKA, MAPK- ERK1/2), de uma fosfatase (PP2A), assim como o perfil de proteínas fosforiladas, S-nitrosiladas e nitradas até 6 h do início da amastigogênese. O processo foi dividido nas etapas: inicial (até 60 minutos) e tardio (em torno de 3-4 h), caracterizados por um aumento de formas amastigotas na etapa tardia. Houve um aumento de aproximadamente 17 vezes no nível de AMPc nos primeiros 15 minutos da amastigogênese (meio pH 6,0), seguido por aumento discreto no nível de PKA fosforilada, utilizado como indicador de atividade enzimática, este mais evidente na etapa tardia (360 minutos). Quanto à subunidade catalítica fosforilada da MAPK (ativa), há uma aparente diminuição no nível de fosforilação na fase inicial (30 minutos) e aumento na etapa tardia (120 minutos) do processo de amastigogênese. Quanto ao perfil geral de fosforilação de proteínas, há uma diminuição de fosforilação em torno de 30 minutos, seguida de aumento de fosforilação em proteínas de aproximadamente 5 e 100 kDa, mas de maneira geral, não se observaram grandes mudanças nesse perfil com a metodologia utilizada. Quanto às modificações por NO e seus derivados, foram observadas modificações por S-nitrosilação e nitração das proteínas, além do aumento de GMPc em torno de 60 minutos. Embora essas modificações modulem a atividade biológica de uma grande diversidade de proteínas, seu papel biológico não foi explorado.8 Em resumo, nossos resultados apontam para uma variação no perfil de fosforilação, S-nitrosilação e nitração de proteínas, além do aumento de AMPc e GMPc ao longo do processo de amastigogênese in vitro, com a via de sinalização dependente de quinases/ fosfatases e de óxido nítrico ocorrendo ao longo do processo de amastigogênese

Chagas disease is a neglected disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi and is a public health problem in several Latin American countries. In its complex life cycle, the protozoan goes through four different stages: metacyclic trypomastigote, amastigote, blood trypomastigote and epimastigote, which allow its survival in the different environments which the parasite comes into contact. The differentiation of T. cruzi trypomastigotes into amastigotes (amastigogenesis) occurs with large morphological, structural and metabolic changes in the parasite and can be reproduced in vitro by, for example, acidification of the extracellular medium. Despite the many data described in the literature, the process is not yet fully understood. The participation of NO in signal transduction during amastigogenesis, suggested by unpublished data from our group, as well as the cAMP-dependent signaling pathway, were the focus of the present study. The induction of amastigogenesis was obtained by incubating trypomastigotes in acidified culture medium (pH 6.0) and the studied parameters compared with control parasites (culture medium, pH 7.4). We studied the variation in the profile of cyclic nucleotides (cAMP, cGMP), kinases (PKA, MAPK-ERK1 / 2), phosphatase (PP2A), as well as the profile of phosphorylated, S-nitrosylated and nitrated proteins up to 6 h. onset of amastigogenesis. The process was divided into early (up to 60 minutes) and late (around 3-4 hours), characterized by an increase in amastigote forms in the late stage. There was an approximately 17-fold increase in cAMP level in the first 15 minutes of amastigogenesis (pH 6.0 medium), followed by a slight increase in phosphorylated PKA level, most evident in the late stage (360 minutes). As for the phosphorylated catalytic subunit of MAPK (active), there is an apparent decrease in the phosphorylation level in the early phase (30 minutes) and increase in the late stage (120 minutes) of the amastigogenesis process. As for the general protein phosphorylation profile, there is a decrease in phosphorylation around 30 minutes, followed by an increase in phosphorylation of proteins (approximately 5 and 100 kDa), but overall, no major changes were observed in this profile with the methodology used. As for modifications by NO and its derivatives, modifications were observed by S-nitrosylation and protein nitration, besides the increase of cGMP around 60 minutes. Although these modifications modulate the biological activity of a wide range of proteins, their biological role has not been explored. In summary, our results point to a variation in phosphorylation, S-nitrosylation and nitration profile of proteins, as well as an increase in cAMP and cGMP along the amastigogenesis process, implicating kinases / phosphatases and nitric oxide dependent signaling pathways in this differentiation

Avaliação do potencial de superação da quimioresistência do melanoma aos inibidores de BRAFV600E (Vemurafenibe) e de MEK (Trametinibe) utilizando terapia combinatória com 4-nerolidilcatecol (4-NC) / Evaluation of the potential of overcoming the chemoresistance of melanoma to BRAFV600E (Vemurafenib) and MEK (Trametinib) inhibitors using combinatory therapy with 4-nerolidylcatechol (4-NC)

Embora o melanoma represente apenas 4% das neoplasias malignas da pele, é considerado a mais grave por ser altamente etal. Em virtude da via MAPK (Mitogen activated protein kinase) estar intimamente ligada ao descontrole da proliferação celular, especialmente em melanoma, esta via se tornou um alvo para o desenvolvimento de terapias direcionadas a oncogenes, como os potentes quimioterápicos Vemurafenibe (inibidor da mutação V600E em BRAF - BRAFV600E) e Trametinibe (inibidor de MEK). Cada vez mais, melhores taxas de respostas vêm sendo alcançadas com os novos medicamentos, porém a maioria dos pacientes está sujeita a recidivas após 7 meses de tratamento devido ao desenvolvimento de quimioresistência, justificando a constante busca por novos compostos terapêuticos. Dados de nosso laboratório indicam que 4-nerolidilcatecol (4-NC) induz aumento na expressão de p53, produção de ROS e dano ao DNA, culminando em apoptose dependente de caspase-3 em células de melanoma por ser um inibidor proteassomal. Além disto, o 4-nerolidilcatecol (4- NC) demonstrou efeito inibitório na proliferação de células de melanoma em modelo de cultura organotípica de pele. Desta forma, este projeto visa avaliar a possibilidade de superação da quimioresistência aos inibidores de BRAF e de MEK, utilizando terapias combinatórias com 4-NC em células de melanoma humano resistentes a estes inibidores. Primeiramente, linhagens celulares de melanoma resistentes aos inibidores de BRAF (R) e BRAF/MEK (DR) foram geradas a partir de células parentais BRAF mutadas (P) e caracterizadas por MTT, microscopia de fluorescência e western blotting. Estas células foram submetidas ao tratamento com 4-NC que apresentou citotoxicidade na concentração de 30µM, inibição de formação de colônias e diminuição na invasão em modelos in vitro de culturas 2D e 3D em todas as linhagens estudadas (P, R e DR). O 4-NC foi ainda capaz de induzir estresse de retículo endoplasmático com indução de apoptose. Visando a explorar o efeito terapêutico in vivo do 4-NC, outro estudo foi conduzido em animais submetidos a enxerto xenográfico com células parentais de melanoma NRAS mutadas. Após desenvolvimento do tumor, os animais foram tratados 3 vezes por semana durante 3 semanas com 4-NC (10 mg/kg) por via i.p. O 4-NC foi capaz de inibir em até 4 vezes o crescimento dos tumores xenográficos (4/10) quando comparado com os controles, com remissão completa do tumor em um animal. A expressão de p53 e PARP clivada foi aumentada nos tumores dos animais tratados, sugerindo apoptose. A expressão gênica de MMP2 e MMP14 estava diminuída nas mesmas amostras, demonstrando o papel do 4-NC na inibição da invasão do melanoma in vivo. Finalmente, a toxicidade sistêmica do 4-NC foi avaliada nas mesmas doses empregadas no ensaio in vivo de tumorigênese. A baixa toxicidade observada nos ensaios toxicológicos com tratamentos sub-crônicos com 4-NC e a citotoxicidade demonstrada em modelos xenográficos nos leva a considerar este composto como promissor para estudos futuros e sua aplicação no tratamento do melanoma cutâneo humano, incluindo pacientes resistentes aos inibidores de BRAF e MEK

Melanoma accounts for only 4% of malignant neoplasms of the skin, but is considered the most serious because it is highly deadly. Because the MAPK (Mitogen activated protein kinase) pathway is closely linked to the lack of control of cell proliferation, especially in melanoma, this pathway has become a target for the development of oncogene-targeted therapies, such as the potent chemotherapeutic agents Vemurafenib (V600E mutation inhibitor in BRAF - BRAFV600E) and Trametinib (MEK inhibitor). Increasingly, better response rates have been achieved with the new drugs, but most patients are subject to relapses after 7 months of treatment due to several mechanisms, which justify the constant search for new therapeutic compounds. Data from our laboratory indicate that 4-nerolidylcatechol (4-NC) induces increased p53 expression, ROS production and DNA damage, culminating in caspase-3 dependent apoptosis in melanoma cells. The 4-NC compound demonstrated an inhibitory effect on melanoma cell proliferation in an organotypic skin culture model. Thus, this project aims to evaluate the possibility of overcoming the existing chemoresistance to BRAF and MEK inhibitors, using 4-NC combinatory therapies in human melanoma cells resistant to these inhibitors. Firstly, melanoma cell lines resistant to BRAF (R) and BRAF / MEK (DR) inhibitors were generated from naive cells mutated BRAF (N) and characterized by MTT, fluorescence microscopy and western blotting. These cells were submitted to 4-NC treatment that showed cytotoxicity with 30 µM, inhibition of colony formation and decrease in invasion in 2D and 3D in vitro models in all cell line studied (N, R and DR). Furthermore, 4-NC was able to induce endoplasmic reticulum stress with apoptosis induction. In order to explore the in vivo therapeutic effect of 4-NC, an additional study was conducted using xenograft model with NRAS-mutated melanoma cell line. After tumor development, the animals were treated 3 times per week for 3 weeks with 4-NC (10 mg / kg) by i.p. injection. 4-NC was able to inhibit up to 4- fold the growth of xenograft tumors (4/10) when compared to controls, with complete tumor remission in one animal. Cleaved PARP and p53 expression were increased in the tumors of treated animals, suggesting apoptosis. MMP2 and MMP14 gene expression were decreased in the same samples, demonstrating the role of 4-NC in inhibiting melanoma invasion in vivo. Finally, the systemic toxicity of 4-NC was evaluated at the same doses employed in the in vivo tumorigenesis assay. The low toxicity observed in the toxicological assays with sub-chronic 4- NC treatments and the demonstrated cytotoxicity in xenograft models leads us to consider this compound as promising for future studies and its application in the treatment of cutaneous human melanoma, including patients resistants to BRAF and MEK inhibitors

Caracterização do perfil de resistência da linhagem de leucemia mieloide crônica K-IM, resistente ao imatinibe / [Characterization of the resistance profile of the K-IM chronic myeloid leukemia strain, resistant to imatinib]

O advento da terapia alvo-específica com o imatinibe (IM) transformou o panorama da resposta ao tratamento, progressão e sobrevida dos pacientes de leucemia mieloide crônica (LMC). Apesar do sucesso e do desenvolvimento de inibidores de tirosina-quinase (TKIs) mais potentes, persiste a problemática da resistência ao tratamento. A relevância do estudo dos mecanismos de resistência aos TKIs atualmente reside na frequência das falhas terapêuticas não relacionadas à mutação em BCR-ABL, o principal alvo da terapia. Tendo por finalidade estudar os diversos mecanismos que cooperam para a aquisição de resistência, foi desenvolvida em nosso laboratório uma linhagem de LMC resistente ao IM. A linhagem resistente, denominada K-IM, foi selecionada pelo cultivo dalinhagem K562 em concentrações crescentes de IM, alcançando 1,0 μM do fármaco. Sem apresentar mutação no domínio quinase de BCR-ABL, ela se constitui um bom modelo para oestudo dos outros mecanismos de resistência ao IM. A linhagem apresentou aumento nos níveis deRNA mensageiro (RNAm) de BCR-ABL que não se traduziu em aumento da atividade de Bcr-Abl ou no impedimento da sua inibição pelo tratamento com IM. A linhagem K-IM se mostrou significativamente mais resistente do que a parental. Embora o tratamento com 1,0 μM de IM tenha promovido um acúmulo de células nas fases G0/G1 do ciclo celular, não foi acompanhado deindução à morte celular nem impediu o aumento do número de células em cultura. Foram avaliadas as proteínas transportadoras de efluxo por serem determinantes para a resistência à múltiplas drogas, porém a sua atividade não foi observada na linhagem K-IM...

The advent of target-specific therapy with imatinib (IM) has transformed the scenario of response to treatment, progression and survival of patients with chronic myeloid leukemia (CML). Despite the success and development of more potent tyrosine kinase inhibitors (TKIs), the problem of resistance to treatment remains. The relevance of the study of mechanisms of resistance to TKIs currently lies in the frequency of therapeutic failures unrelated to mutation in BCR-ABL, the main target of therapy. Aiming to study the various mechanisms that cooperate for the acquisition of resistance, a CML cell line resistant to IM was developed in our laboratory. The resistant cell line, called K-IM, was selected by culturing the K562 cell line at increasing concentrations of IM, reaching 1.0 μM of the drug. Without presenting mutation in the BCRABL kinase domain, it constitutes a good model for the study of the other mechanisms ofresistance to IM. The cell line showed an increase in BCR-ABL messenger RNA (mRNA) levels which did not result in increased Bcr-Abl activity or in the impairment of its inhibition by IMtreatment. The K-IM cell line was significantly more resistant to IM than the parental cell line. Although treatment with 1.0 μM of IM promoted cell accumulation in the G0/G1 phases of the cell cycle, it was not accompanied by induction of cell death nor prevented the increase in the number of cells in culture. The efflux transporter proteins were evaluated because they aredeterminant for multidrug resistance, but their activity was not observed in the K-IM cell line. Since the antiapoptotic proteins XIAP and survivin are studied as chemoresistance factors, their mRNA and protein levels were evaluated. K-IM showed similar levels to K562 of XIAP mRNA,but showed higher survivin levels in both instances, suggesting that this protein plays a role in its resistance...

Avaliação do padrão de crescimento na síndrome de Noonan em pacientes com mutações identificadas nos genes PTPN11, SOS1, RAF1 e KRAS / Growth pattern of patients with Noonan syndrome with identified mutations in PTPN11, SOS1, RAF1 e KRAS genes

A Síndrome de Noonan (SN) é caracterizada por baixa estatura proporcionada de início pós-natal, dismorfismos faciais, cardiopatia congênita e deformidade torácica. A frequência da SN é estimada entre 1:1000 e 1:2500 nascidos vivos, com distribuição semelhante em ambos os sexos. A herança é autossômica dominante com penetrância completa, porém a maioria dos casos é esporádica. Até o momento, mutações em genes da via RAS-MAPK (PTPN11, KRAS, SOS1, RAF1, MEK1, NRAS e SHOC2) foram identificadas em aproximadamente 70% dos pacientes. Uma das principais características fenotípicas da SN é a baixa estatura pós-natal, embora o mecanismo fisiopatológico do déficit de crescimento nesta síndrome ainda não esteja totalmente esclarecido. Estudos que avaliaram o padrão de crescimento linear em crianças com SN foram realizados anteriormente ao conhecimento do diagnóstico molecular dessa síndrome. No presente estudo, avaliamos a frequência de mutação nos genes PTPN11, SOS1, RAF1 e KRAS em 152 pacientes com SN e o padrão de crescimento linear (altura) e ponderal [índice de massa corpórea (IMC)] dos pacientes com mutação identificada. No total, mutações nos genes relacionados foram encontradas em 99 pacientes (65%) do nosso estudo, com predominância do gene PTPN11 (47%), seguido do SOS1 (9%), RAF1 (7%) e KRAS (3%). Foram construídas curvas específicas para SN de Altura e IMC para idade e sexo utilizando o método LMS. Os pacientes com SN apresentaram crescimento pré-natal preservado, porém o comprometimento do crescimento pós-natal foi observado desde o primeiro ano de vida, atingindo uma altura final de -2,5 e -2,2 desvios-padrão da média para população brasileira em homens e mulheres, respectivamente. O prejuízo da altura foi maior nos pacientes com mutação no gene RAF1 em comparação com os genes PTPN11 e SOS1. O IMC dos pacientes com SN apresentou queda de 1 desvio-padrão em relação à média da população brasileira normal. O comprometimento do IMC foi menor...

Noonan Syndrome (NS) is characterized by distinctive facial features, short stature and congenital heart defects. The estimated prevalence is 1:1000 to 1:2500 live births, affecting equally both sexes. It is an autosomal dominant disorder with complete penetrance, but most cases are sporadic. To date, mutations in the RAS/MAPK pathway genes (PTPN11, KRAS, SOS1, RAF1, MEK1, NRAS and SHOC2) were identified in approximately 70% of patients. One of the cardinal signs of NS is proportional postnatal short stature although the physiopathological mechanism of growth impairment remains unclear. The current knowledge about the natural history of growth associated with NS was described before molecular diagnosis era. In this study, we performed PTPN11, SOS1, RAF1, and KRAS mutation analysis in a cohort of 152 NS patients and studied the natural linear (height) and ponderal growth [body mass index (BMI)] of NS patients with related mutations. Mutations in NS-causative genes were found in 99 patients (65%) of our cohort. The most common mutated gene was PTPN11 (47%), followed by SOS1 (9%), RAF1 (7%) and KRAS (3%). Sex-specific percentile curves for height and BMI were constructed using the LMS method. NS patients had birth weight and length within normal ranges but the postnatal growth impairment was observed during the first year of life, reaching a final height of -2.3 and -2.2 standard deviations from the mean for Brazilian healthy men and women, respectively. Postnatal growth impairment was higher in RAF1 mutation patients than in patients with SOS1 and PTPN11 mutations. BMI values in NS patients were lower in comparison with normal Brazilian population. BMI values were higher in patients with RAF1 mutations than in patients with other genotypes. Patients with mutations in PTPN11 and SOS1 genes were more likely to have pulmonary valve stenosis, whereas hypertrophic cardiomyopathy was more common in patients with mutations in the gene RAF1...