Lipophosphoglycans from dermotropic Leishmania infantum are more pro-inflammatory than those from viscerotropic strains

Although Leishmania infantum is well-known as the aethiological agent of visceral leishmaniasis (VL), in some Central American countries it may cause atypical non-ulcerated cutaneous leishmaniasis (NUCL). However, the mechanisms favoring its establishment in the skin are still unknown. Lipophosphoglycan (LPG) is the major Leishmania multivirulence factor involved in parasite-host interaction. In the case of viscerotropic L. infantum, it causes an immunosuppression during the interaction with macrophages. Here, we investigated the biochemical and functional roles of LPGs from four dermotropic L. infantum strains from Honduras during in vitro interaction with murine macrophages. LPGs were extracted, purified and their repeat units analysed. They did not have side chains consisting of Gal(β1,4)Man(α1)-PO4 common to all LPGs. Peritoneal macrophages from BALB/c and C57BL/6 were exposed to LPG for nitric oxide (NO) and cytokine (TNF-α and, IL-6) production. LPGs from dermotropic strains from Honduras triggered higher NO and cytokine levels compared to those from viscerotropic strains. In conclusion, LPGs from dermotropic strains are devoid of side-chains and exhibit high pro-inflammatory activity.

Enfermedad de Fabry Descripción de un caso y su evolución en terapia de reemplazo enzimático / Fabry disease Description of a case and its evolution with enzyme replacement therapy

La enfermedad de Fabry es un trastorno hereditario de depósito lisosomal progresivo y multisistémico del catabolismo de los glicoesfingolípidos, ligado al cromosoma X, que es causado por un defecto en el gen que cataliza la enzima lisosomal alfa-galactosidasa A (alfa-GAL A), y origina el depósito intracelular, especialmente de globotriaosil-ceramida (Gb-3), en el endotelio vascular y otros tejidos. La deficiencia parcial o total de la actividad de la enzima lisosomal conduce a la incapacidad de catabolizar ciertos glicoesfingolípidos causando el daño principal, es decir, el depósito intralisosomal de sustrato Gb-3 en diferentes tipos de células. En particular, son afectadas progresivamente las células vasculares endoteliales, lo cual puede causar isquemia tisular e infarto. Es una enfermedad progresiva que causa manifestaciones derivadas de la disfunción del órgano afectado por los depósitos, principalmente riñón, corazón, sistema nervioso, tracto gastrointestinal y piel, aunque puede participar cualquier órgano y sistema de la economía. Antes de la disponibilidad de la terapia de reemplazo enzimático, el tratamiento para esta enfermedad consistía principalmente de cuidados sintomáticos y medidas correctivas no específicas. Se describen las características clínicas y la evolución de un hombre de 47 años con enfermedad de Fabry en terapia de reemplazo enzimático. (ActaMed Colomb 2014; 39: 202-206).

Fabry disease is an inherited disorder of progressive and multisystemic lysosomal storage of glycosphingolipids catabolism, X-linked, which is caused by a defect in the gene that catalyzes the lysosomal enzyme alpha-galactosidase A (alpha-GAL A), and causes the intracellular deposition, especially of globotriaosyl ceramide (Gb3) in the vascular endothelium and other tissues. Partial or total deficiency of the lysosomal enzyme activity leads to the inability to catabolize certain glycosphingolipids causing the main damage, namely the intralysosomal deposit of Gb3 substrate in different cell types. In particular, vascular endothelial cells are progressively affected, which may cause tissue ischemia and infarction. It is a progressive disease that causes manifestations derived from the dysfunction of the organ affected by the deposits, mainly kidney, heart, nervous system, gastrointestinal tract and skin, although any organ and system of the economy may be involved. Before the availability of enzyme replacement therapy, treatment for this condition consisted mainly of symptomatic care and no specific remedies. Clinical characteristics and evolution of a 47 year old man with Fabry disease on enzyme replacement therapy are described. (Acta Med Colomb 2014; 39: 202-206).

Phenotypic characterization of Clostridium botulinum strains isolated from infant botulism cases in Argentina / Caracterización fenotípica de cepas de Clostridium botulinum aisladas de casos de botulismo del lactante en Argentina

Infant botulism is the most common form of human botulism; however, its transmission has not been completely explained yet. Some of the most recognized potential sources of Clostridium botulinum spores are the soil, dust, honey and medicinal herbs. In Argentina, 456 cases of infant botulism were reported between 1982 and 2007. C. botulinum type A was identified in 455 of these cases whereas type B was identified in just one case. However, in Argentina, types A, B, E, F, G, and Af have been isolated from environmental sources. It is not clearly known if strains isolated from infant botulism cases have different characteristics from strains isolated from other sources. During this study, 46 C. botulinum strains isolated from infant botulism cases and from environmental sources were typified according to phenotypic characteristics. Biochemical tests, antimicrobial activity, and haemagglutinin-negative botulinum neurotoxin production showed uniformity among all these strains. Despite the variability observed in the botulinum neurotoxin's binding to cellular receptors, no correlation was found between these patterns and the source of the botulinum neurotoxin. However, an apparent geographical clustering was observed, since strains isolated from Argentina had similar characteristics to those isolated from Italy and Japan, but different to those isolated from the United States.

El botulismo del lactante es la forma más común del botulismo humano; sin embargo, su forma de transmisión no ha sido totalmente explicada. El suelo, el polvo ambiental, la miel y algunas hierbas medicinales son potenciales fuentes de esporas de Clostridium botulinum. Entre 1982 y 2007 se informaron en Argentina 456 casos de botulismo del lactante, 455 casos debidos al serotipo A y uno al serotipo B. Sin embargo, los serotipos A, B, E, F, G y Af han sido aislados de suelos y otras fuentes en Argentina. No se conoce si las cepas aisladas de casos de botulismo del lactante poseen características diferentes de las cepas aisladas de otras fuentes. Durante este estudio se caracterizaron 46 cepas de C. botulinum. Las pruebas bioquímicas y de sensibilidad a los antimicrobianos y la producción de neurotoxina botulínica hemaglutinina-negativa mostraron uniformidad entre estas cepas. A pesar de la variabilidad observada respecto de la unión de la neurotoxina a receptores celulares, no se observó una correlación entre estos patrones de unión y la fuente de aislamiento. Sin embargo, se observó una aparente agrupación geográfica, ya que las cepas aisladas en Argentina tuvieron características similares a las observadas en las cepas aisladas en Italia y Japón, pero diferentes de las que se registraron en las cepas aisladas en los Estados Unidos.

Role of Leishmania (Leishmania) amazonensis amastigote glycosphingolipids in macrophage infectivity

The role of glycosphingolipids (GSLs) present in amastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis during infection of macrophages was analyzed, with particular emphasis on GSLs presenting the terminal Galpß1-3Galpa disaccharide. Macrophage invasion by L. (L.) amazonensis amastigotes was reduced by 37 percent when the disaccharide Galpß1-3Galp (1 mM) was added to the culture medium. The putative macrophage receptor/lectin for ß-Gal-globotriaosylceramide (Galpß1-3Galpa1-4Galpß1-4Glc pß1-1Cer) and other structurally related GSLs from L. (L.) amazonensis amastigotes were analyzed by micelles and parasite binding assay to peritoneal macrophage proteins fractionated by SDS-PAGE under nonreducing conditions. Micelles containing purified amastigote GSLs or a suspention of L. (L.) amazonensis amastigotes fixed with 2 percent formaldehyde were incubated with nitrocellulose membrane containing the macrophage proteins transferred by Western blotting. Binding of micelles containing purified GSLs from amastigote forms or fixed L. (L.) amazonensis amastigotes to nitrocellulose membrane was probed using monoclonal antibody ST-3, which recognizes the glycoepitope Galpß1-3Galpa1-R present either in the micelle preparation or on the amastigote surface. Macrophage protein with molecular mass ~30 kDa bound the amastigote GSL and appeared to be a doublet on electrophoresis. The specificity of this interaction was confirmed using fixed L. (L.) chagasi amastigotes, which do not express GSLs such as ß-Galp-globotriaosylceramides, and which do not bind to 30-kDa protein.

Expressão de glicoesfingolipídeos no carcinoma espinocelular do trato aerodigestivo superior / Glycosphingolipid expression in squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract

Os glicoesfingolipídios (GSLs) são importantes componentes da membrana celular, organizados em microdomínios, relacionados a receptores de membrana e comportamento anti-social da célula neoplásica como crescimento descontrolado, invasão e ocorrência de metástases. OBJETIVO: Como a expressão de GSLs no carcinoma espinocelular (CEC) é tema pouquíssimo estudado decidiu-se realizar estudo prospectivo visando avaliar a expressão de GSLs no CEC do trato aerodigestivo superior. MÉTODO: Coletou-se 33 amostras de CEC e mucosa normal e GSLs extraídos e purificados por cromatografia de fase reversa em coluna de C-18 e hidrólise alcalina em metanol. Os GSLs foram quantificados por densitometria das placas de cromatografia de alta resolução em camada delgada coradas com orcinol. RESULTADOS: Observou-se aumento significativo de GSLs no CEC (3,57æg/mg) em comparação à mucosa normal (1,92æg/mg), principalmente do monosialogangliosídeo (GM3), trihexosilceramida (CTH), dihexosilceramida (CDH), globosídeo (Gb4). A expressão de monohexosilceramida (CMH) foi semelhante no CEC e na mucosa normal. O aumento do GM3 no CEC foi demonstrado por métodos imunoquímicos empregando-se MAb DH2 (anti-GM3). Analisando-se os carboidratos do CMH por cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massa constatou-se que a mucosa normal expressa glucosilceramida e o CEC glucosilceramida e galactosilceramida. CONCLUSÃO: O aumento de GSLs no tecido tumoral pode representar alterações dos microdomínios da membrana celular resultantes do processo de transformação maligna, responsáveis por uma maior interação célula-célula e célula-matriz aumentando seu potencial de infiltração e metástase, possibilitando o emprego dos GSLs e de MAbs no diagnóstico e no tratamento do CEC, a exemplo do que ocorre no melanoma.

Glycosphingolipids are integral constituents of cellular membrane, arranged in rafts, and with neoplasic cell anti-social behavior, like uncontrolled cell growth, invasiveness, and metastatic potential. AIM: However, there are few studies about glycosphingolipids (GSL) expression in squamous cell carcinoma (SCC). Since GSL are known to be tumor-associated markers we decided to perform a prospective study on the GSL profiles of SCC. METHOD: Specimens of 33 SCC and normal mucosa were obtained and GSLs were extracted and purified by reverse-phase chromatography on C18 column and alkaline hydrolysis in methanol. GSLs were quantified using densitometry of orcinol-stained HPTLC plates. RESULT: A significant increase of GSLs in SCC (3.57æg/mg) was observed as compared to normal mucosa (1.92æg/mg). In SCC, an increase of 2 to 3 times in the amounts of CDH, CTH, Globoside, and GM3 was observed in comparison to normal mucosa. The identification of GM3 as well as its increased expression in SCC was confirmed unequivocally by HPTLC immunostaining and indirect immunofluorescence using MAb DH2 (anti-GM3). BY analyzing SCC and normal mucosa CMHs by GC/MS, normal mucosa expresses only glucosylceramide whereas SCC cells express both glucosylceramide and galactosylceramide. CONCLUSION: The increase in the amount of GSLs in tumor tissue may represent changes of cell membrane microdomains resulting from the malignant transformation process, which is responsible for greater cell-cell or cell-matrix interaction thereby increasing their potential for infiltration and metastasis.

Accidente cerebro-vascular en la enfermedad de Fabry: algo más que una simple estenosis / Stroke in Fabry disease: more than a simple stenosis

Se analiza la evidencia existente a la fecha sobre los mecanismos fisiopatológicos que puedem generar accidentes cerebrovasculares en la enfermedad de Fabry. Esta entidad es el resultado de la deficiencia de alfa-galactosidasa A, lo que resulta en depósito patológico de glicoesfingilípidos en distintas poblaciones celulares. Asociados a la insuficiencia renal y cardíaca, los accidentes cerebrovasculares pueden derivar en la muerte de los pacientes. Durante mucho tiempo el único mecanismo generador de daño vascular informado fue la oclusión vascular por depósito lipídico a nivel endotelial. En la actualidad se describen otros mecanismos. El advenimento de la terapia de reemplazo enzimático ha generado gran expectativa en cuanto la posibilidad de reversión de estos mecanismos. Si bien la evidencia es escasa y son necesarios más estudios a largo plazo, algunos informes demuestran que luego de meses, el tratamiento ha logrado revertir algunos de los mecanismos implicados

The objective is to analyze the updated evidence on the physiopathological mechanisms that can generate cerebrovascular damage in Fabry disease. Fabry disease is the result of the deficiency of alpha-galactosidasa A, which causes pathological storage of glycosphingolipids, in different cells. Associated to renal and cardiac insufficiency, cerebrovascular complications can derive in the death of the patients. During a long time the only reported mechanism was the vascular occlusion by deposit of lipids at endothelial level. At the present time, other mechanisms are postulated. The arrival of enzyme replacement therapy has generated great expectation on the possibility of reversion of these alterations. Although the evidence is scarce and more long-term studies are necessary, some reports demonstrate that after months, the treatment has managed to revert some of the mechanisms involved

Papel dos (glico)esfingolipídeos e proteofosfoglicanos de Leishmania (Leishmania) amazonensis na infecção de macrófagos: caracterização de novos antígenos e isolamento de microdomínios de membranas resistentes a detergente não-iônico / Role of (glyco)sphingolipids and proteophosphoglycans of Leishmania (Leishmania) amazonensis on macrophage infection: characterization of novel antigens and isolation of non-ionic detergent-resistant membrane microdomains

As leishmanioses constituem um importante problema de saúde pública no Brasil, em razão da incidência da doença associada à alta taxa de morbidade. Devido ao fato da Leishmania ser parasita intracelular no hospedeiro vertebrado, estudos de moléculas do parasita, que atuam na interação do parasita com a célula do hospedeiro vertebrado, são de alta importância para melhor compreensão dos para mecanismos de invasão e sobrevivência do parasita. Seguindo este racional, nesta tese foram identificados, purificadores e caracterizados proteofosfoglicanos secretados por formas promastigotas (pPPG) de L. (L. ) amazonensis, respectivamente de meios de cultura e de macrófagos infectados com esses parasitas. A purificação dos PPGs foi realizada por combinações de cromatografias em DEAE-Sephadex, Octyl-Sepharose e Bio-Gel A-0.5 e ultracentrifugações. Por Western blotting em fase sólida utilizando diferentes anticorpos monoclonais (mAbs), observou-se que opPPG apresenta alto peso molecular, contem cadeias fosfoglicanas e é reconhecido por mAbs anti-glicoesfingolipídeos (GSLs) ST-3 e St-5, e mAb anti-lipofosfoglicano (LPG) VST-1. Em estudos imunohistoquímicos de cortes de lesão de hamsters infectados com L. (L. ) amazonensis, observou-se a presença de material reativo mAbs ST-3, ST-4 e ST-5 superfície do parasita e em torno do vacúolo parasitóforo. Após delipidação de cortes da (processo em que extraídos os glicolipídeos), a reatividade com os mAbs limitou-se a algumas regiões do vacúolo, sugerindo a possível localização dos aPPGs na célula infectada. O aPPG apresentou padrão de migração eletroforética similar ao pPPG, e foi reconhecido pelos mAbs ST-3, ST-4 e ST-5, mas...

Expressão de glicoesfingolipídeos no carcinoma aerodigestivo espinocelular do trato aerogestivo superior / Glycosphingolipid expresion spinocellular carcinoma of the upper aerodigestive tract

O carcinoma espinocelular (CEC) é o tumor maligno mais freqüente do trato aerodigestivo superior e responsável por 90 por cento a 95 por cento dos casos. Porém, até o momento, não existe marcador tumoral específico ou que possibilite predizer o prognóstico deste carcinoma Glicoesfingolipídeos (GSLs) são considerados marcadores tumorais, como por exemplo, o dissialogangliosídeo (GD3) para melanoma. Outros tumores malignos como de cólon, mama e pulmão expressam GSLs como marcadores tumorais, inclusive com pesquisas em fase pré-clinica. Estes resultados levaram a realizar estudo prospectivo visando avaliar: i) a expressão de GSLs no CEC, ii) a relação da expressão dos GSLs com o estadiamento da doença, iii) sítio anatômico e iv) o grau de diferenciação tumoral. Fragmentos de CEC e de mucosa normal do trato aerodigestivo superior foram obtidos de 33 pacientes operados na Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço da UNIFESP-EPM. Os GSLs foram extraídos e purificados por cromatografia de fase reverso em coluna de C- 18 e hidrólise alcalina em metanol. A quantificação dos GSLs foi realizada por densitometria das placas de cromatografia de alta resolução em camada delgada coradas com orcinol. Observou-se aumento significativo de GSLs no CEC (3,57I-1g/mg) em comparação a mucosa normal(1,92I-1g/mg). Também no CEC detectou-se aumento de 2 a 3 vezes das quantidades de monosialogangliosídeo (GM3), trihexosilceramida (CTH), dihexosilceramida (CDH), globosídeo (Gb4) e em comparação a mucosa normal. Por outro lado, a monohexosilceramida (CMH) foi expressa no CEC e na mucosa normal em quantidades semelhantes. A presença e aumento do GM3 no tecido tumoral foi demonstrado pela imunocoloração e imunofluorescência indireta empregando-se o anticorpo monoclonal DH2 (anti-GM3). Ao comparar a quantidade de GSLs com o estadiamento da doença e com o grau de diferenciação tumoral observa-se tendência no aumento da expressão de GSLs com a evolução do CEC para estadios mais avançados. Com relação ao grau de diferenciação tumoral observou-se tendência a haver menor expressão de GSLs quanto mais indiferenciado é o tumor. Os resíduos de açúcar dos CMHs foram analisados por cromatógrafia gasosa acoplado a espectrômetro de massa, constatando-se que a mucosa, normal expressa somente glucosilceramida glucosilceramida e galactosilceramida. e o CEC expressa o aumento na quantidade de GSLs no tecido tumoral e sua relação com estadio da doença e com o grau de diferenciação tumoral pode representar alterações dos microdomínios da membrana celular resultantes do processo de transformação maligna, responsáveis por uma maior interação célula-célula e célula-matriz, aumentando seu potencial de infiltração e de metástase. Analisando os resultados desse estudo, fica claro a alteração no perfil dos GSLs no CEC, em comparação com a mucosa normal, possibilitando o emprego dos GSLs e de mAbs para auxiliar no diagnóstico e no tratamento do CEC, a exemplo do que ocorre no melanoma.

Mapeamento, análises químicas e imunoquímicas do glicoesfingolipídeos em invertebrados / Mapping, chemical and immunochemical analysis of the glycosphingolipids in invertebrates

Este estudo analisou o perfil cromatográfico dos glicoesfingolipídeos neutros e gangliosídeos de 18 invertebrados. Glicoesfingohpídeos (GSLs) totais foram purificados em colunas de DEAE-Sephadex e Florisil. Em todas as amostras de GSLs neutros observou-se monohexosil ceramida (CMH). Os GSLs foram quantificados após fracionamento por cromatografia de alta resolução em camada delgada (HPTLC) e coloração com orcinol por densitometria 525 nm. As concentrações totais de GSLs neutros variaram de 0,1 g de GSLs/g de tecido na renda a 93,50 g de GSLs/g de tecido no tenébrio. Estudos sobre a identificação dos CIXIS foram realizados após purificação por HPTLC preparativa. As bandas de CI IS puras foram submetidas a hidrólise ácida total com ácido trifluoroacético e o açúcar encontrado em quase todos os CXIHs dos invertebrados foi a glucose. Resíduos de manose foram observados nos CNIFIs da bolacha-do-mar, grilo, abelha e besouro, e fucose somente no CXZI-IP1 do pepino-do-mar. Por hidrólise ácida total, para a identificação dos açúcares dos diferentes CDHs, detectou-se a presença de resíduos de glucose, galactose e manose. A partir dos fitos Echinodermata e Xfollusca foram detectados, em concentrações relevantes, GSLs neutros com cadeias mais longas como CDH, CTH e globosídeo, sugerindo que animais filogeneticamente superiores a Platyhelminthes expressam uma maior diversidade de glicosiltransferases. Entre 18 invertebrados estudados, somente quatro animais apresentaram gangliosídeos com concentrações totais que variam de 1,26 g de GSLs/g de tecido no pepino-do-mar a 9,60g de GSLs/g de tecido na bolacha-do-mar. A presença de CMHs contendo ácidos graxos 2-hidroxilados foi analisada por imunocoloração de placas de HPTLC utilizando o mAb MEST-2. CMHs reativos com o mAb MEST-2 foram detectados em: esponja, anêmona-do-mar, pepino-do-mar e marisco. Os CMHs foram também analisados por radioimunoensaio de fase sólida quanto a reatividade com mAb MEST-2. Os diferentes CMHs apresentaram reatividade simililares às obtidas por imunocoloração de placas de HPTLC...

Aspectos genéticos e clínico-terapêuticos da Doença de Tay-Sachs / Genetic and clinical therapeutics aspects of Tay-Sachs disease

A doença de Tay-Sachs apresenta uma freqüência elevada em determinados grupos étnicos, sobretudo nos judeus ashkenazi. É uma desordem neurodegenerativa, presente principalmente em crianças, decorrente de uma atividade deficiente da enzima lisossomal hexosaminidase A, acarretando um acúmulo intracelular de substratos e um progressivo déficit neurológico. O tratamento é discutível, entretanto, resultados promissores têm sido obtidos com a utilização da NB-DNJ e, principalmente, com a terapia genética

Glicoesfingolípidos de membrana y test de viabilidad espermática / Glicosfingolipides ABH and sperm viability test

Los espermatozoides presentan estructuras glicoesfingolipídicas asociadas a la membrana que son propias de los antígenos ABH. Los glúcidos que conforman estas moléculas participan en la adhesión, reconocimiento e inhibición del contacto celular. Por esta razón los antígenos de grupo sanguíneo podrían tener relevancia en los mecanismos moleculares del proceso reproductivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar si exite asociación entre los tests de integridad de la membrana espermática y la alteración en la expresión de los glicoesfingolípidos ABH. Se seleccionaron 50 pacientes infértiles cuyas muestras de semen fueron procesadas según normas OMS. La expresión ABH en los espermatozoides se estudió por técnicas inmunohematológicas y se clasificó según estuviera disminuida o ausente (grupo 1), o normal (grupo 2). La integridad de la membrana se evaluó con Test de Burgos y De Paola y Test Hiposmótico. Se efectuó la comparación de los dos grupos respecto de ambos test de viabilidad espermática. El análisis estadistico demostró que: 1) Existe diferencia significativa en la variable porcentaje de muertos (Burgos De Paola) para los dos grupos (p<0.001). 2) No existe diferencia significativa en la variable porcentaje de hinchados (Test Hiposmótico) para los dos grupos. Sobre la base de los resultados obtenidos podemos concluir que existe asociación entre expresión ABH disminuida e integridad de la menbrana del espermatozoide, principalmente a nivel de la cabeza. Lo que nos lleva a pensar que los glicoesfingolípidos ABH, se localizan preferentemente en esta zona del espermatozoide, involucrada fundamentalmente en la interacción con el ovocito. Nos proponemos ampliar la población en estudio e investigar el gen responsable de la estructura final de los antígenos del ABO tratando de profundizar en las alteraciones del plasmalema a nivel molecular

Estudo da p53, p21 e perfil glicoesfingolipídico da pele tratada com ciclosporina A pela via tópica e submetida à radiaçäo ultravioleta / p53, p21 and glycosphingolipid profile of the skin after tropical ciclosporine A and ultraviolet radiation

o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da associação da CsA aplicada pela via tópica na pele de camundongos submetidos à radiação ultravioleta(UVR)através da pesquisa de p53, p2l e perfil glicoesfingolipídico. Trinta camundongos fêmeas, C57BL/6 foram distribuídos, casualmente em 3 grupos de dez animais. Todos os animais tiveram os pêlos dorsais epilados 24 horas antes do início do experimento. No Grupo I(GI) cada animal sofreu 4 exposições de 3 minutos à UVR, em dias alternados, sem a aplicaçäo de qualquer substância. No Grupo II (GII), repetiu-se o procedimento dos animais de GI, sendo que, nos intervalos das exposições à radiação, cada animal recebeu a aplicação tópica de CsA (l4mg/kg/dia). No Grupo III (GIII) repetiu-se o procedimento realizado em GI e GII sendo que a solução de CsA foi substituída por óleo de oliva. O tempo de observação foi de 10 dias, ao final dos quais Os animais foram submetidos à eutanásia, procedendo-se à dosagem sangüínea da CsA, pesquisa de p53 e p2l através da imunohistoquímica e Western Blotting e determinação do perfil glicoesfingolipídico através da HPTLC. A dosagem sangüínea da CsA não atingiu 200ng/ml em nenhum animal de GII. A pesquisa do p53 e p2l mostrou-se negativa nos dois métodos estudados. O perfil glicoesfingolipídico da pele dos animais de GI foi idêntico ao dos animais de GIII e pele normal. Porém, GII apresentou diferença caracterizada pelo aparecimento de uma banda corada com primulina e resorcinol, compatível com GQ. Estes achados permitiram concluir que a CsA associada à UVR mudou o perfil glicoesfingolipídico da pele e esta alteração foi diferente daquela causada apenas pela aplicação tópica da droga

Efeito do ácido all-trans retinóico aplicado pela via tópica na pele de retalho dorsal submetido á radiaçäo ultravioleta: pesquisa de p53, p21 e perfil glicoesfingolipídico / Retinoic scid and ultraviolet radiation: evaluation of p53, p21 and glycosphingolipid profile of the skin

O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do ácido all-trans retinóico(AR) aplicado pela via tópica na pele de retalho dorsal de camundongos submetidos à radiação ultravioleta(UV), utilizando-se p53, p2l e perfil glicoesfingolipídico. MÉTODO: 40 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6, com idade entre 9 e 11 semanas foram distribuídos aleatoriamente em 4 Grupos contendo 10 animais cada. Todos as animais foram submetidos a retalho cutâneo na região dorsal, medindo 2X3cm, com pedículo proximal e expostos à radiação ultravioleta A e B durante 1O minutos ao dia, até o término do experimento. No Grupo A, cada animal recebeu AR O,05 por cento em veículo alcoólico 01 vez ao dia, após cada exposição, durante 30 dias. No Grupo B, cada animal foi submetido às mesmas condições do grupo A durante 15 dias. No Subgrupo CA, os animais receberam veiculo alcoólico após cada exposição ao UV durante 30 dias. No Subgrupo CB, ao animais receberam veículo alcoólico após cada exposição ao UV durante 15 dias. RESULTADOS: Os Grupos A e B apresentaram resultados significantes quanto ao aumento da espessura da epiderme, aumento no número de melanócitos ativos e hipertricose. No Subgrupo CA, observou-se o aparecimento de glicoesfingollpídeos compatíveis com GD1a e GT1a, enquanto que no grupo CB notou-se o aparecimento de glicoesfingolipídeo compatível com GQI. CONCLUSÃO: O AR não foi associado a modificações do perfil glicoesfingolipídico da pele ou a alterações das p53 e p2l. O AR e UV foram associados ao aumento na pigmentação, na espessura da epiderme e quantidade de folículos pilosos do retalho dorsal

Inhibition of mouse and rat lymphoproliferation by gangliosides

Our previous study have demonstrated that Glycosphingolipids (GSLs) have an immunosuppressive effect on murine lymphoproliferation and IL-2 production. In the present study we examined the effect of a pool of Gangliosides (Gang) on spleen lymphocyte proliferation from either isogeneic strains of Wistar rats or BALB/c mice. Two hundred-fifty grams adult female isogeneic Wistar rats and 8-week-old BALB/c mice were used. The animals were sacrificed and the spleen harvested aseptically for cellular assays. Spleen cells suspensions were obtained by homogenization in RPMI 1640 with a loose tissue grinder. After washing, the cells were suspended in RPMI 1640 supplemented. Cell viability was measured by Trypan blue exclusion. Cells were cultured in triplicate using increasing concentrations of Gang (1; 2; 5; 10; 15; 20 mg/well) and in the presence of Concanavalin A. The cells were incubated for 48 hours and were pulsed with [3H] thymidine 18 hours prior to harvesting on glass fiber paper for counting in a beta-counter. Data were presented as rate of inhibition, as previously described. At concentrations 1 and 2 mug/well, Gang stimulated lymphoproliferation (30 percent and 50 percent, rats and mice respectively), while at concentration from 5 to 20 mg/well an increasing inhibition was observed for spleen cells from both mouse and rat (from 40 percent up to 80 percent). In preliminary studies we observed inhibition of mixed lymphocyte reaction on spleen cells from rats treated with Gang for 10 days (data not shown). Our data suggest that Gang may be investigated as a immunosuppressive drug in organ transplantation.

Efeito imunossupressor dos gangliosídeos: estudo in vivo / Immunosupressive effect of gangliosides: in vivo study

Imunomodulação mais específica e eficaz é uma meta importante a ser atingida na área de órgão. Neste sentido, foi estudado previamente o papel imunomodulador dos gangliosídeos "in vitro". No presente trabalho objetivou-se avaliar este efeito agora "in vivo", mimetizando a situação do transplante alogênico. Foram utilizados 26 ratos Wistar 1 EPM, machos, com 3 meses de idade, pesando cerca de 250g, procedentes do Centro de Desenvolvimento de Pesquisa Experimental em Medicina e Biologia. Os animais fora mantidos por 5 dias, para adaptação, no biotério setorial da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, recebendo água e ração própria para a espécie. Os animais foram distribuídos em grupos conforme segue: grupos experimento (que receberam 1, 3 e 6 mg/kg/dia de gangliosídeos) e um grupo controle que recebeu veículo, todos por via intramuscular durante 7 dias consecutivos. No 8º dia, com os animais anestesiados com éter etílico foi feita a remoção cirúrgica do baço de todos os animais, os quais foram sacrificados por exsanguinação, ainda sob efeito anestésico. Os baços removidos foram processados para a obtenção de linfócitos os quais foram cultivados em placa de cultura com 96 poços, distribuídos da seguinte forma: 1,5x10(5) linfócitos viáveis de cada animal dos grupos experimento e controle foram cultivados com 1,5x10(5) linfócitos viáveis de um rato não tratado, sendo assim realizada a reação mista de linfócitos. Os linfócitos provenientes dos animais dos grupos controle e 1 mg apresentaram aumento da proliferação sem nenhuma alteração. Por outro lado, foi observada uma taxa de inibição ao redor de 70 por cento sobre a proliferação linfocitária dos animais dos grupos 3 e 6 mg comparados aos animais dos grupos controle e 1 mg. O resultado desta investigação estimula a utilização dos gangliosídeos no tratamento da rejeição alogênica.

Glycosphingolipid antigens from Leishmania (L.) amazonensis amastigotes. Binding of antiglycosphingolipid monoclonal antibodies in vitro and in vivo

Specific glycosphingolipid antigens of Leishmania (L.) amazonensis amastigotes reactive with the monoclonal antibodies (MoAbs) ST-3, ST-4 and ST-5 were isolated, and their structure was partially elucidated by negative ion fast atom bombardment mass spectrometry. The glycan moieties of five antigens presented linear sequences of hexoses and N-acetylhexosamines ranging from four to six sugar residues, and the ceramide moieties were found to be composed by a sphingosine d18:1 and fatty acids 24:1 or 16:0. Affinities of the three monoclonal antibodies to amastigote glycosphingolipid antigens were also analyzed by ELISA. MoAb ST-3 reacted equally well with all glycosphingolipid antigens tested, whereas ST-4 and ST-5 presented higher affinities to glycosphingolipids with longer carbohydrate chains, with five or more sugar units (slow migrating bands on HPTLC). Macrophages isolated from footpad lesions of BALB/c mice infected with Leishmania (L.) amazonensis were incubated with MoAb ST-3 and, by indirect immunofluorescence, labeling was only detected on the parasite, whereas no fluorescence was observed on the surface of the infected macrophages, indicating that these glycosphingolipid antigens are not acquired from the host cell but synthesized by the amastigote. Intravenous administration of 125I-labeled ST-3 antibody to infected BALB/c mice showed that MoAb ST-3 accumulated significantly in the footpad lesions in comparison to blood and other tissues.

Characterization of T cell responses to purified leishmania antigens in subjects infected with Leishmania chagasi

T cell responses to lipophosphoglycan-associated protein (LPG-AP) and the rgp63 antigens were studied in subjects with either asymptomatic L. chagasi infection or cured visceral leishmaniasis. The [3H]-thymidine uptake of lymphocytes stimulated with LPG-AP and rgp63 (mean +/- SD) was 14275 +/- 5048 and 3523 +/- 1678 cpm, respectively, for subjects with asymptomatic L. chagasi infection and 20046 +/- 5102 and 5086 +/- 3500 cpm, respectively, for subjects cured of visceral leishmaniasis. The responses to LPG-AP in both asymptomatic and cured visceral leishmaniasis were higher (P < 0.01) than those observed with rpg63. LPG-AP induced IFN-gamma production in all subjects studied, while rgp63 did not induce lymphocyte proliferation or IFN-gamma production in the majority of the subjects tested. IFN-gamma levels in cultures stimulated with LPG-AP were 103 +/- 81 pg/ml in individuals with asymptomatic L. chagasi infection and 127 +/- 123 pg/ml in subjects cured of visceral leishmaniasis. IFN-gamma levels in cultures stimulated with LPG-AP from subjects with asymptomatic L. chagasi infection were comparable to those observed in subjects cured of visceral leishmaniasis (P > 0.05). These data indicate that LPG-AP is recognized and induces T cell proliferation and IFN-gamma production in subjects with protective immune response against Leishmania chagasi.

Structures of four oligosaccharides derived from the glycoinositolphospholipid of Leishmania adleri

Glycoinositolphospholipids (GIPLs) were extracted from the trypanosomatid Leishmania adleri by hot phenol extraction and the carbohydrate moieties isolated after base cleavage. Purification of the crude oligosaccharides by high performance anion exchange (HPAE) chromatography yielded four fractions whose structures were determined by a combination of methylation analysis, fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry and two-dimensional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy

The use of NMR spectroscopy in the structure determination of a Leptomonas samueli glycosylphosphosphingolipid-derived oligosaccharide

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy provides an extremely powerful technique to determine the structure of oligosaccharides, particularly when used in conjuction with other physical techniques such as methylation analysis and fast atom bombardment mass spectroscopy (FAB-MS). This brief review describes the application of NMR to the determination of the structure of an oligosaccharide isolated from the glycophosphosphingolipid (GPS) from the monogenetic trypanosomatid Leptomonas samueli. Where ambiguities arise in the NMR interpretation, the use of other data will be discussed