RESUMO
SUMMARY: Gastrin plays a vital role in the development and progression of gastric cancer (GC). Its expression is up-regulated in GC tissues and several GC cell lines. Yet, the underlying mechanism remains to be investigated. Here, we aim to investigate the role and mechanism of gastrin in GC proliferation. Gastrin-overexpressing GC cell model was constructed using SGC7901 cells. Then the differentially expressed proteins were identified by iTRAQ analysis. Next, we use flow cytometry and immunofluorescence to study the effect of gastrin on the mitochondrial potential and mitochondria-derived ROS production. Finally, we studied the underlying mechanism of gastrin regulating mitochondrial function using Co-IP, mass spectrometry and immunofluorescence. Overexpression of gastrin promoted GC cell proliferation in vitro and in vivo. A total of 173 proteins were expressed differently between the controls and gastrin- overexpression cells and most of these proteins were involved in tumorigenesis and cell proliferation. Among them, Cox17, Cox5B and ATP5J that were all localized to the mitochondrial respiratory chain were down-regulated in gastrin-overexpression cells. Furthermore, gastrin overexpression led to mitochondrial potential decrease and mitochondria-derived ROS increase. Additionally, gastrin-induced ROS generation resulted in the inhibition of cell apoptosis via activating NF-kB, inhibiting Bax expression and promoting Bcl-2 expression. Finally, we found gastrin interacted with mitochondrial membrane protein Annexin A2 using Co-IP and mass spectrometry. Overexpr ession of gastrin inhibits GC cell apoptosis by inducing mitochondrial dysfunction through interacting with mitochondrial protein Annexin A2, then up-regulating ROS production to activate NF-kB and further leading to Bax/Bcl-2 ratio decrease.
La gastrina juega un papel vital en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico (CG). Su expresión está regulada al alza en tejidos de CG y en varias líneas celulares de CG. Sin embargo, el mecanismo subyacente aun no se ha investigado. El objetivo de este estudio fue investigar el papel y el mecanismo de la gastrina en la proliferación de CG. El modelo de células CG que sobre expresan gastrina se construyó usando células SGC7901. Luego, las proteínas expresadas diferencialmente se identificaron mediante análisis iTRAQ. A continuación, utilizamos la citometría de flujo y la inmunofluorescencia para estudiar el efecto de la gastrina en el potencial mitocondrial y la producción de ROS derivada de las mitocondrias. Finalmente, estudiamos el mecanismo subyacente de la gastrina que regula la función mitocondrial utilizando Co-IP, espectrometría de masas e inmunofluorescencia. La sobreexpresión de gastrina promovió la proliferación de células CG in vitro e in vivo. Un total de 173 proteínas se expresaron de manera diferente entre los controles y las células con sobreexpresión de gastrina y la mayoría de estas proteínas estaban implicadas en la tumorigenesis y la proliferación celular. Entre estas, Cox17, Cox5B y ATP5J, todas localizadas en la cadena respiratoria mitocondrial, estaban reguladas a la baja en las células con sobreexpresión de gastrina. Además, la sobreexpresión de gastrina provocó una disminución del potencial mitocondrial y un aumento de las ROS derivadas de las mitocondrias. Por otra parte, la generación de ROS inducida por gastrina resultó en la inhibición de la apoptosis celular mediante la activación de NF-kB, inhibiendo la expresión de Bax y promoviendo la expresión de Bcl-2. Finalmente, encontramos que la gastrina interactuaba con la proteína de membrana mitocondrial Anexina A2 usando Co-IP y espectrometría de masas. La sobreexpresión de gastrina inhibe la apoptosis de las células CG al inducir la disfunción mitocondrial a través de la interacción con la proteína mitocondrial Anexina A2, luego regula el aumento de la producción de ROS para activar NF-kB y conduce aún más a la disminución de la relación Bax/Bcl-2.
Assuntos
Animais , Camundongos , Neoplasias Gástricas/metabolismo , Neoplasias Gástricas/patologia , Gastrinas/metabolismo , Anexina A2/metabolismo , Mitocôndrias/patologia , Espectrometria de Massas , NF-kappa B , Imunofluorescência , Espécies Reativas de Oxigênio , Apoptose , Linhagem Celular Tumoral , Imunoprecipitação , Proliferação de Células , Carcinogênese , Citometria de FluxoRESUMO
Anexinas são proteínas ligantes de fosfolipídeos dependente de cálcio que exercem funções celulares como organização do citoesqueleto, transporte de íons e sinalização celular. Por estarem relacionadas com a organização de actina e com a proliferação celular;; alterações na sua expressão podem ser implicadas na tumorigênese de diferentes tipos de câncer. A anexina A2 (ANXA2), promove a proliferação, migração e invasão celular quando superexpressa. Em estudo recente, sugeriu-se a utilização da anexina A2 como biomarcador do desenvolvimento do câncer colorretal (CCR). Contudo, existem poucas evidências sobre como a ANXA2 é regulada e seu papel na modulação de vias de sinalização é pouco conhecido. O objetivo desse estudo foi a elucidação do papel da ANXA2 em eventos relacionados com a progressão do CCR. Análise da expressão de ANXA2 em amostras de pacientes de CCR revelou aumento da expressão no tecido tumoral, corroborados pela análise do banco de dados do TCGA e por nossos resultados de IHC indicando relação da ANXA2 com estadios mais avançados e marcação diferencial na metástase. Foram realizados ensaios in vitro para avaliar os níveis de expressão e fosforilação (resíduo Y23) da proteína anexina A2, em linhagens celulares de adenocarcinoma de cólon (Caco-2, HT-29 e HCT-116), através de imunoblotting. Para a avaliação do papel da ANXA2 na progressão tumoral, submetemos células HT-29, silenciada ou não para a ANXA2, ao tratamento com TGF-ß , avaliando o potencial proliferativo, migratório e invasivo destas células. Os resultados mostram que as células Caco-2 apresentam um nível de fosforilação da ANXA2 menor do que os níveis observados nas células HT-29 e HCT-116, as quais apresentaram níveis similares de fosforilação desta proteína. Para avaliação de eventos relacionados com a EMT, foram analisados marcadores epiteliais e mesenquimas por meio de imunoblotting e imunofluorescência. Mediante tratamento com TGF-ß , a linhagem HT-29 exibiu alterações morfológicas características com o desenvolvimento da EMT, assim como redução de E-caderina e aumento na expressão de marcadores mesenquimais como a vimentina. Houve aumento de expressão total de ANXA2, da sua forma fosforilada e relocalização da superfície celular para o citoplasma na linhagem HT-29. Concomitantemente ao tratamento com TGF-ß observou-se a perda dos contatos intercelulares mediada pela internalização da E-caderina e ANXA2. A análise de microscopia de iluminação estruturada confirmou a colocalização de ambas proteinas intracelularmente, assim como a transfecção de mutantes sítios específicos para a ANXA2 provou a sua interação com E-caderina. O ensaio de proliferação mostrou que o TGF-ß e o silenciamento de ANXA2 são anti-proliferativos. O silenciamento causou redução na migração (Wound Healing), independente do aumento migratório causado pelo TGF-ß . A indução da EMT por TGF-ß levou ao aumento na capacidade invasiva destas células, aumento que não ocorreu nas células silenciadas para a ANXA2 ou tratadas com STA21 (inibidor de STAT3). O uso deste inibidor, STA21 e de PP2 (inibidor de Src) impediram a EMT nas células tratadas com TGF-ß. Concluimos que a ANXA2 atua na manutenção das junções celulares mediadas pela E-caderina;; do aumento da capacidade invasiva, características do processo de EMT, via Src/ANXA2/STAT3 e também na proliferação e migração celular.
