Inibição combinada do receptor AT1 e produtos finais de glicação avançada na nefropatia diabética / Combined inhibition of AT1 receptor and advanced glycation end products in diabetic nephropathy

O diabetes mellitus (DM) é um grande problema de saúde pública, que afeta cerca de 463 milhões de pessoas no mundo e pode alcançar 700 milhões de pessoas até 2045. A nefropatia é uma das complicações microvasculares do diabetes e a maior causa de insuficiência renal. Uma vez que a ativação do receptor AT1 pela angiotensina II causa vasoconstrição da artéria aferente, e que o acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs) causam glicotoxicidade intracelular de células mesangiais, podocitárias e tubulares, foi avaliado se o tratamento combinado de olmersatana (OLM) e piridoxamina (PYR) é capaz de melhorar a nefropatia diabética quando comparado aos tratamentos isolados. Para isto, o diabetes mellitus experimental foi induzido em 50 camundongos C57BL/6 pela administração de estreptozotocina (50 mg/kg/dia via intraperitoneal por 5 dias). Os animais foram divididos em cinco grupos: controle, diabéticos, diabéticos tratados com OLM (20 mg/Kg/dia), diabéticos tratados com PYR (400 mg/Kg/dia) e diabéticos tratados com OLM e PYR (20 mg/Kg/dia e 400 mg/Kg/dia, respectivamente) Os tratamento durou 16 semanas. Como resultado, os camundongos que receberam STZ desenvolveram hiperglicemia e doença renal, diminuição de peso, poliúria, polidipsia, polifagia, e albuminúria, além de aumento de frutosamina, ferro, uréia e fosfatase alcalina na urina, diminuição da atividade de catalase no rim e aumento de excreção dos AGEs na urina. Histologicamente, houve aumento de área glomerular e do espaço de BowmanO tratamento com OLM atenuou a albuminúria e atenuou o declínio da função renal, uma vez que o OLM melhorou a polidipsia, polifagia, poliúria, marcadores bioquímicos de disfunção renal e parâmetros histológicos, apesar de não apresentar ação sobre a fosfatase alcalina, uréia, ferro, frutosamina e ácido úrico. O tratamento isolado com PYR melhorou a maioria dos parâmetros alterados pela doença, entre eles a ingestão alimentar, ingestão hídrica, volume urinário, creatinina sérica, excreção de albumina na urina, ACR, AGEs no tecido renal e urina, ureia na urina e todos os parâmetros morfológicos analisados, contudo sem efeito sobre a fosfatase alcalina, ferro, frutosamina e ácido úrico. O tratamento combinado (PYR e OLM) melhorou a polifagia, polidipsia e poliúria comparado aos animais diabéticos sem tratamento, entretanto não houve diferença comparado a cada tratamento isolado. Os parâmetros histológicos e bioquímicos (creatinina no soro, albumina na urina, ACR e uréia) também apresentaram melhorara em relação aos animais diabéticos sem tratamento, mas não em relação aos animais em tratamento isolado. Tanto PYR quanto OLM não influenciaram a excreção de AGEs na urina. Esses dados nos levam a concluir que o tratamento combinado não ofereceu efeitos benéficos adicionais quando comparado aos tratamentos isolados, e que o tratamento que mais ofereceu benefícios foi o tratamento isolado com PYR nos parâmetros metabólicos, morfológicos e de função renal. (AU)

Planejamento e desenvolvimento de ligantes não peptídicos com atividade agonista enviesada no receptor de angiotensina II tipo 1 empregando-se técnicas de modelagem molecular e ensaios in vitro / Drug design of non-peptidic biased agonists for angiotensin II type 1 receptor using molecular modeling techniques and in vitro tests

A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome de elevada morbimortalidade, correspondendo a um grave problema de saúde pública. Uma das abordagens terapêuticas para IC consiste no uso de antagonistas do receptor de angiotensina II do tipo 1 (AT1R), conhecidos como sartanas. Estudos apontam que uma nova classe de compostos, os agonistas enviesados, é capaz de induzir a sinalização da via da ß-arrestina sem ativação da via da proteína G. Essa seletividade funcional é particularmente interessante, pois a via dependente da proteína G é responsável pelo aumento da pressão arterial, morte celular e fibrose tecidual, levando a hipertrofia cardíaca e progressão da IC. No entanto, a via da ß-arrestina está associada com renovação celular e aumento do inotropismo. Além disso, estudos in vivo sugerem que agonistas enviesados poderiam corresponder a uma terapia superior à dos antagonistas convencionais, que bloqueiam ambas as vias. Apesar do potencial terapêutico, esses compostos possuem estrutura peptídica e, por isso, tem sua administração restrita à via intravenosa. A resolução da estrutura cristalográfica do AT1R permitiu estudos de modelagem molecular mais acurados. Tendo isso em mente, nesse trabalho foram propostos agonistas enviesados de natureza não peptídica para o AT1R por meio de técnicas de modelagem molecular e validação das hipóteses levantadas por ensaios in vitro. Foram realizados estudos de dinâmica molecular com o AT1R (PDB ID: 4YAY) em uma bicamada lipídica e ensaios de ancoramento molecular da angiotensina II (AngII) e do ligante enviesado TRV027. As poses de ancoramento molecular selecionadas foram utilizadas em dinâmicas de complexo, que revelaram diferenças entre os sistemas apo (sem nenhum ligante) e holo (com o ligante no sitio de ligação). Nossos resultados sugerem que o TRV027 induz um padrão exclusivo de ligações de hidrogênio e de estrutura secundária, enquanto que a AngII afeta os resíduos do bolso hidrofóbico do sitio de ligação, principalmente a conformação do Trp2536.48. Com base nas simulações, três farmacóforos foram criados e utilizados de maneira complementar em triagens virtuais na base de dados ZINC15, resultando na seleção de cinco compostos. Um desses compostos apresentou afinidade pelo receptor AT1R e, ainda que estudos complementares de ativação de vias especificas sejam necessários para que o composto possa ser classificado como agonista enviesado, já se constitui em molécula potencialmente promissora. Além disso, esses estudos permitiram a proposição de estruturas inéditas que podem vir a ser hits no processo de desenvolvimento de agonistas enviesados para AT1R. Portanto, como continuidade desse trabalho, essas moléculas serão sintetizadas e investigadas quanto à possível interação com o receptor.

Heart Failure (HF) is a common syndrome with high morbimortality, being considered a serious public health problem. One of the therapeutic approaches for HF consists in the use of the sartan class, which are angiotensin II type 1 receptor (AT1R) antagonists. Recent studies have shown that a new class of compounds, known as biased agonists, is able to induce signaling via ß-arrestin without G-protein activation. This functional selectivity is particularly interesting since G-protein dependent signaling is responsible for cell death and cardiac tissue fibrosis, which leads to cardiac muscle hypertophy and HF progression. On the other hand, ß-arrestin signaling is associated with cellular renewal and increased inotropism. In vivo studies suggests that biased agonists could correspond to a superior therapy over conventional angiotensin II type 1 receptor antagonists, which blocks cell signaling as a whole, however their peptidic structure restricts their use to intravenous administration. Moreover, the AT1R crystal structure determination holds great promise for more accurate molecular modeling studies. With that being said, the aim of this work was to plan and develop new non-peptidic biased agonists for ATR1 employing molecular modeling techniques and in vitro tests for hypothesis validation. Molecular dynamics (MD) simulations of the refined AT1R crystal (PDB ID: 4YAY) embedded in a lipid bilayer and molecular docking studies with angiotensin II (AngII) and TRV027 (biased agonist) were conducted. Selected docking poses from both ligands underwent complex MD simulations revealing differences between apo (ligand free) and holo (ligand in the binding site) systems. Our results suggest that TRV027 induces an exclusive hydrogen bond and secondary structure pattern, while AngII affects the hydrophobic pocket conformation, mainly Trp253. Based on the simulations, three pharmacophore models were created and used in virtual screenings in the ZINC15 database, resulting in the selection of five compounds that were tested in vitro. One of the compounds displayed affinity for AT1R and is a promising molecule. Nonetheless, it needs further pathway activation characterization in order to be a classified as a biased agonist. Furthermore, these results have contributed significantly for the proposition of new structures that could be hits with biased agonist activity for AT1R. Thus, for future works, we point out the necessity for synthesis and characterization of this new compounds

Participation of hepatic α/β-adrenoceptors and AT1 receptors in glucose release and portal hypertensive response induced by adrenaline or angiotensin II

It has been previously demonstrated that the hemodynamic effect induced by angiotensin II (AII) in the liver was completely abolished by losartan while glucose release was partially affected by losartan. Angiotensin II type 1 (AT1) and adrenergic (∝1- and β-) receptors (AR) belong to the G-proteins superfamily, which signaling promote glycogen breakdown and glucose release. Interactive relationship between AR and AT1-R was shown after blockade of these receptors with specific antagonists. The isolated perfused rat liver was used to study hemodynamic and metabolic responses induced by AII and adrenaline (Adr) in the presence of AT1 (losartan) and ∝1-AR and β-AR antagonists (prazosin and propranolol). All antagonists diminished the hemodynamic response induced by Adr. Losartan abolished hemodynamic response induced by AII, and AR antagonists had no effect when used alone. When combined, the antagonists caused a decrease in the hemodynamic response. The metabolic response induced by Adr was mainly mediated by ∝1-AR. A significant decrease in the hemodynamic response induced by Adr caused by losartan confirmed the participation of AT1-R. The metabolic response induced by AII was impaired by propranolol, indicating the participation of β-AR. When both ARs were blocked, the hemodynamic and metabolic responses were impaired in a cumulative effect. These results suggested that both ARs might be responsible for AII effects. This possible cross-talk between β-AR and AT1-R signaling in the hepatocytes has yet to be investigated and should be considered in the design of specific drugs.

Association of polymorphisms within the Renin-Angiotensin System with metabolic syndrome in a cohort of Chilean subjects

ABSTRACT Objective Metabolic syndrome (MetS) is associated with hypertension, obesity and dyslipidemia. Thus, genetic variants related with these conditions may modulate its development. We evaluated the effect of polymorphisms in the renin-angiotensin system (RAS) on metabolic syndrome risk in a cohort of Chilean subjects. Subjects and methods A total of 152 subjects, 83 with MetS (51.2 ± 9.6 years) and 69 without MetS (49.5 ± 9.3 years) of both genders were included, according to the ATP III update criteria. The rs4340 Insertion/Deletion (I/D), rs699 (T>C) and rs5186 (A>C) of the ACE, AGT and AGTR1 genes, respectively, were genotyped. Results After adjusting for age and gender, we observed the DD genotype of rs4340 associated with MetS (p = 0.02). Specifically, the DD genotype was associated with MetS risk in women (OR = 4.62, 95%CI, 1.41 – 15.04; p < 0.01). In males, the AA genotype for rs5186 variant was associated with an increased risk for developing MetS when compared with women carrying the same genotype (OR = 3.2; 95%CI, 1.03 – 9.89; p = 0.04). In subjects without MetS, DD genotype was associated with increased waist circumference (p = 0.023) while subjects with MetS carrying the rs5186 TT genotype showed higher levels of HDL-cholesterol (p = 0.031). Conclusion The present study contributes data highlighting the role for RAS polymorphisms in predisposing to metabolic syndrome in Chilean subjects.

Avaliação dos eixos ECA / ANG II / AT1 e ECA-2 / ANG (1-7) / MAS em fibroblastos de gengiva e ligamento periodontal humanos estimulados por IL-1ß e sua contribuição na produção e regulação de citocinas e quimiocinas / Evaluation ACE /ANG II /AT1 and ACE-2 /ANG (1-7) /MAS axis in gingival and periodontal ligament human fibroblasts stimulated with IL-1ß and its contribution in the production of cytokines and chemokines

O Sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido relatado como um importante modulador de processos inflamatórios e imunológicos, incluindo a doença periodontal (DP). Estudos sugerem neste sistema um eixo alternativo (ECA-2 /ANG(1-7) /MAS) que atuaria como um contra-regulador de efeitos mediados pelo clássico eixo (ECA /ANGII /AT1). Sabe-se que bactérias periodontopatogênicas, como a Porphyromonas gingivalis (Pg), possuem componentes bioativos de membrana (ex. lipopolissacarídeos-LPS) capazes de induzir uma forte resposta imune no hospedeiro devido à liberação de citocinas nas células, entre elas Interleucina (IL)- 1ß. Neste contexto, fibroblastos são as células mais abundantes nos tecidos periodontais e possuem em sua superfície celular receptores necessários para o reconhecimento da invasão bacteriana, ativando cascatas intracelulares, que levam à produção de citocinas. O objetivo deste estudo foi verificar se os eixos ECA/ ANGII/ AT1 e ECA-2/ ANG(1-7)/ MAS contribuem para a produção e/ ou regulação de citocinas inflamatórias (CI) por fibroblastos de gengiva humana (HGF) e ligamento periodontal humano (HPLF) estimulados por IL-1ß. Após o pré-tratamento com Losartan e Ang (1-7) ou silenciamento mediado por RNA de interferência (RNAi) de AT1, HGF e HPLF foram estimulados por IL-1ß por 3 horas (RNAm) ou 24 horas (proteína). Expressão de RNAm para AT1, MAS, ECA, ECA-2, IL-1ß, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-ß, CXCL12, RANK-L e OPG foram avaliados por RT-qPCR e das proteínas IL-6, IL-8, ECA e ECA-2 por ELISA. Foi realizado também Western Blot para detecção de AT1 e ECA nos extratos celulares e dosagem de nitrito no sobrenadante das culturas. Ambos os subtipos de fibroblastos mostraram aumento da expressão de RNAm para AT1, IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α e OPG, quando estimulados por IL-1ß. No entanto, apenas em HPLF foi observado aumento para MAS, ECA e TGF-ß. Losartan e Ang (1-7) não modularam o transcrito, a secreção de CI e nem a produção de nitrito no sobrenadante das culturas, tanto em HGF como em HPLF. O silenciamento do receptor AT1 reduziu a secreção de IL-6 e IL-8 induzida por IL-1ß em cultura de HGF e HPLF e aumentou a expressão gênica de OPG somente em HGF. Estes resultados sugerem que o silenciamento de AT1, mas não o bloqueio farmacológico deste receptor pelo antagonista Losartan, em HGF e HPLF, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal.(AU)

The renin-angiotensin system (RAS) has been reported as an important modulator of inflammatory and immune responses, including periodontal disease (PD). Studies suggest an alternative axis as part of this system (ACE-2 / ANG (1-7) / MAS) that would act as counter-regulatory to the classical axis (ECA / ANGII / AT1). It is known that periodontal bacteria such as Porphyromonas gingivalis (Pg) have bioactive components in their membrane (such as lipopolysaccharide-LPS) capable of inducing a strong immune response in the host due to the release of cytokines in cells, including interleukin (IL) - 1ß. In this regard, fibroblasts are the most abundant cells in periodontal tissues and receptors needed for the recognition of bacterial invasion by activating intracellular cascades that lead to cytokine production. The aim of this study was to determine whether the axes ACE / ANGII / AT1 and ACE-2 / ANG (1-7) / MAS contribute to the production and / or regulation of inflammatory cytokines (IC) by fibroblasts of human gingiva (HGF) and human periodontal ligament (HPLF) stimulated IL-1ß. After pre-treatment with Losartan, Ang (1-7) or silencing mediated by RNA interference (RNAi) of AT1, HGF and HPLF were stimulated by IL-1ß for 3 hours (RNAm) or 24 hours (protein). Expression mRNA for AT1, MAS, ACE, ACE-2, IL-1ß, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-ß, CXCL12, RANK-L and OPG was assessed by RT- qPCR and proteins IL-6, IL-8, ACE and ACE-2 by ELISA. Western Blot for the detection of AT1 and ECA and dosage of nitrite was also performed. Experiments stimulated by IL-1ß showed a positive control for gene expression AT1, IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α and OPG in HGF and HPLF and MAS, ACE and TGF-ß only HPLF. Losartan and Ang (1-7) did not modulate the transcription and secretion of IC and no nitrite production in the culture supernatant of HGF and HPLF. The silencing AT1 reduced IL-6 secretion and IL-8 induced by IL- ß in cultured HGF and HPLF and increased OPG gene expression only HGF. These results suggest that silencing AT1, but not pharmacological blockade of this receptor by Losartan in HPLF and HGF, can control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to the pathogenesis of periodontal disease.(AU)

Angiotensin II type 1 and 2 receptors and lymphatic vessels modulate lung remodeling and fibrosis in systemic sclerosis and idiopathic pulmonary fibrosis

OBJECTIVE: To validate the importance of the angiotensin II receptor isotypes and the lymphatic vessels in systemic sclerosis and idiopathic pulmonary fibrosis. METHODS: We examined angiotensin II type 1 and 2 receptors and lymphatic vessels in the pulmonary tissues obtained from open lung biopsies of 30 patients with systemic sclerosis and 28 patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Their histologic patterns included cellular and fibrotic non-specific interstitial pneumonia for systemic sclerosis and usual interstitial pneumonia for idiopathic pulmonary fibrosis. We used immunohistochemistry and histomorphometry to evaluate the number of cells in the alveolar septae and the vessels stained by these markers. Survival curves were also used. RESULTS: We found a significantly increased percentage of septal and vessel cells immunostained for the angiotensin type 1 and 2 receptors in the systemic sclerosis and idiopathic pulmonary fibrosis patients compared with the controls. A similar percentage of angiotensin 2 receptor positive vessel cells was observed in fibrotic non-specific interstitial pneumonia and usual interstitial pneumonia. A significantly increased percentage of lymphatic vessels was present in the usual interstitial pneumonia group compared with the non-specific interstitial pneumonia and control groups. A Cox regression analysis showed a high risk of death for the patients with usual interstitial pneumonia and a high percentage of vessel cells immunostained for the angiotensin 2 receptor in the lymphatic vessels. CONCLUSION: We concluded that angiotensin II receptor expression in the lung parenchyma can potentially control organ remodeling and fibrosis, which suggests that strategies aimed at preventing high angiotensin 2 receptor expression may be used as potential therapeutic target in patients with pulmonary systemic sclerosis and idiopathic pulmonary fibrosis. .

Asociación y efectos de interacción en los genes AGT , AGTR1 , ACE , ADRB2 , DRD1 , ADD1, ADD2, ATP2B1, TBXA2R y PTGS2 sobre la hipertensión en la población antioqueña / Association and interaction of AGT, AGTR1, ACE, ADRB2, DRD1, ADD1, ADD2, ATP2B1, TBXA2R and PTGS2 genes on the risk of hypertension in Antioquian population

Introducción. La hipertensión arterial es una enfermedad multifactorial influenciada por componentes genéticos y ambientales, cuya prevalencia varía entre grupos étnicos. Se han llevado a cabo numerosos estudios en genes de sistemas reguladores de la presión arterial, como el sistema renina-angiotensinaaldosterona, el sistema nervioso simpático, los factores endoteliales, y el balance de sodio, mostrando resultados incongruentes entre poblaciones. Objetivos. Evaluar el efecto de variantes en los genes AGT , AGTR1 , ACE , ADRB2 , DRD1 , ADD1 , ADD2 , ATP2B1 , TBXA2R y PTGS2 y del componente ancestral individual, sobre la hipertensión arterial y las cifras de presión arterial en una muestra de población antioqueña. Materiales y métodos. Se genotipificaron 107 casos y 253 controles para 12 variantes en los genes AGT , AGTR1 , ACE , ADRB2 , DRD1 , ADD1 , ADD2 , ATP2B1 , TBXA2R y PTGS2 , y para 20 marcadores informativos de ascendencia. Se evaluó la asociación de los polimorfismos y sus interacciones, y de la composición genética ancestral con hipertensión y cifras de presión arterial. Resultados. Los genes ADD2 , rs4852706 (OR=3,0; p=0,023); DRD1 , rs686 (OR=0,38; p=0,012) y ADRB2 , rs1042718 (OR=10,0; p=0,008); y combinaciones genotípicas de DRD1 con AGTR1 ; de AGT con ADD1 ; y de ADD1 con ATP2B1 y PTGS2 , se asociaron con hipertensión arterial. El componente ancestral amerindio se asoció con disminución en la presión arterial diastólica. Conclusiones. Variantes en los genes ADD2 , DRD1 , ADRB2 , AGTR1 , AGT , ADD1 , ATP2B1 y PTGS2 , individualmente o en su interacción, se encuentran asociadas con hipertensión. El componente ancestral amerindio tiene un efecto sobre las cifras de presión arterial.

Introduction: Hypertension is a multifactorial disease influenced by genetic and environmental components, with its prevalence varying across ethnic groups. Manifold studies on blood pressure regulatory system genes have been carried out -such as the renin-angiotensin-aldosterone system, the sympathetic nervous system, endothelial factor, and sodium balance-, but the results yielded were inconsistent among populations. Objectives: To evaluate the effect of both variants in genes AGT, AGTR1, ACE, ADRB2, DRD1, ADD1, ADD2, ATP2B1, TBXA2R PTGS2, and the result of the individual ancestry component on hypertension and blood pressure levels among population in Antioquia. Methods and materials: 107 cases and 253 controls were genotyped for 12 variants on genes AGT, AGTR1, ACE, ADRB2, DRD1, ADD1, ADD2, ATP2B1, TBXA2R y PTGS2, and for 20 ancestry informative markers. The association of polymorphisms and their interactions, and the association of ancestral genetic composition with hypertension and blood pressure levels were examined. Results: Genes ADD2, rs4852706 (OR=3.0; p=0.023); DRD1, rs686 (OR=0.38; p=0.012) and ADRB2, rs1042718 (OR=10.0; p=0.008); as well as genotypic combinations of DRD1 and AGTR1; AGT and ADD1; and ADD1 to ATP2B1 and PTGS2 were associated to hypertension. The Amerindian ancestry component was associated to some decrease in diastolic blood pressure. Conclusion: Variants on genes ADD2, DRD1, ADRB2, AGTR1, AGT, ADD1, ATP2B1 and PTGS2 individually or interacting, are associated to hypertension. The Amerindian ancestry component has an effect on blood pressure.

Señalización de la angiotensina II, a través de la producción de radicales libres en estructuras del sistema nervioso: papel en el estres agudo y crónico / Angiotensin II signaling, through the production of free radicals in structures of the nervous system: role in acute and chronic stress

Existen evidencias que apoyan la participación de las especies reactivas de oxígeno en las cascadas de señalización y transducción intracelular de la angiotensina II. La ANG II es importante en el mantenimiento de la homeostasis corporal, regulando la presión arterial y el metabolismo de fluidos y electrolitos. Se sabe que en la periferia, la ANG II es capaz de estimular a la NAD(P)H oxidasa con la subsiguiente producción de ERO. El anión superóxido es metabolizado secuencialmente por las enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa, la catalasa y la glutatión peroxidasa. A su vez, las especies reactivas de oxígeno son capaces de activar a las proteínas kinasas activadas por mitógenos, las cuales se encuentran asociadas al crecimiento y la diferenciación celular. Se evaluó la posible participación de las especies reactivas de oxígeno en el mecanismo de señalización intracelular mediado por el receptorAT1en el hipotálamo, el órgano subfornicaly médula suprarrenal de la rata. Nuestros resultados demostraron que la estimulación del tejido nervioso con ANG II in vitroincrementó la actividad de la enzimas antioxidante. Al evaluar el papel del receptor AT1, la NAD(P)H oxidasa, el anión superóxido y la proteína kinasa C; así como la activación de las ERK1/2 en la señalización de la ANG II en el hipotálamo, OSF y MSR, demostramos que el bloqueo del receptor AT1con losartán, la interferencia del ensamblaje de la NAD(P)H oxidasa con apocinina, el secuestro de anión superóxido empleando un mimético de la SOD, tempol,y la inhibición de la PKC con cheleritrina, bloquearon completamente el efecto que produce la ANG II sobre las enzimas antioxidantes in vitro.Igualmente, la activación de la ERK1/2 inducida por la ANG II fue reducida por APO y LOS a nivel hipotalámico. Adicionalmente, el bloqueo del receptor AT2hipotalámico con PD123319, no bloqueo sino que mas bien potenció la respuesta de las enzimas antioxidantes y la activación de las ERK1/2 inducida por la ANG II, lo que desenmascaró el efecto contra regulatorio del receptor AT2sobre la acción de la ANG II mediada por el receptor AT1. Se sabe que durante el estrés el sistema renina angiotensina circulante y cerebral se encuentra estimulado, por lo tanto el incremento de la ANG II endógena debería desencadenar vías de señalización similares a las reportadas in vitro. Efectivamente, nuestros hallazgos demostraron que tanto,el estrés agudo inducido por la inmovilización forzada,como el estrés crónico en ratas espontáneamente hipertensas incrementaron la actividad de las enzimas antioxidantes en las tres estructuras cerebrales estudiadas. Este efecto es mediado por la vía del receptor AT1, la estimulación de la NAD(P)H oxidasa y la producción de anión superóxido ya que el tratamiento in vivo con LOS, APO y TEM fue capaz de bloquear completamente el incremento de la actividad de las enzimas antioxidantes inducidas por el estrés y por ende por la ANG II endógena.A nivel de la MSR demostramos, por primera vez, que la estimulación del receptor AT2 esta asociada a la estimulación de la NAD(P)H oxidasa, ya que la APOy el PD 123319 fueron capaces de bloquear el incremento de la actividad de las enzimas antioxidantes inducida por la ANG II. Demostrando así, que el receptor AT1en la MSR contrarregula la acción de la ANG II a través del receptor AT2.En conclusión, nuestros resultados indican que a nivel del sistema nervioso las especies reactivas de oxígeno participan en la cascada de señalización intracelular de la ANG II, y ejercen un importante papel en la respuesta al estrés y la hipertensión.

Eccentric and concentric cardiac hypertrophy induced by exercise training: microRNAs and molecular determinants

Among the molecular, biochemical and cellular processes that orchestrate the development of the different phenotypes of cardiac hypertrophy in response to physiological stimuli or pathological insults, the specific contribution of exercise training has recently become appreciated. Physiological cardiac hypertrophy involves complex cardiac remodeling that occurs as an adaptive response to static or dynamic chronic exercise, but the stimuli and molecular mechanisms underlying transduction of the hemodynamic overload into myocardial growth are poorly understood. This review summarizes the physiological stimuli that induce concentric and eccentric physiological hypertrophy, and discusses the molecular mechanisms, sarcomeric organization, and signaling pathway involved, also showing that the cardiac markers of pathological hypertrophy (atrial natriuretic factor, β-myosin heavy chain and α-skeletal actin) are not increased. There is no fibrosis and no cardiac dysfunction in eccentric or concentric hypertrophy induced by exercise training. Therefore, the renin-angiotensin system has been implicated as one of the regulatory mechanisms for the control of cardiac function and structure. Here, we show that the angiotensin II type 1 (AT1) receptor is locally activated in pathological and physiological cardiac hypertrophy, although with exercise training it can be stimulated independently of the involvement of angiotensin II. Recently, microRNAs (miRs) have been investigated as a possible therapeutic approach since they regulate the translation of the target mRNAs involved in cardiac hypertrophy; however, miRs in relation to physiological hypertrophy have not been extensively investigated. We summarize here profiling studies that have examined miRs in pathological and physiological cardiac hypertrophy. An understanding of physiological cardiac remodeling may provide a strategy to improve ventricular function in cardiac dysfunction.

Acciones de endotelina 1 y angiotensina II en embarazos complicados con preeclampsia / Endothelin 1 and angiotensin II in preeeclampsia

Introduction. It is generally thought that development of hypertension in preeclampsia (PE) is due to generalized endothelial dysfunction and/or results from an imbalance in the production and/or action of vasoactive factors, resulting in higher citosolic Ca2+ concentration which in turn leads to vasoconstriction and decreased blood pressure perfusion in organs, including the fetoplacental unit. Among vasoactive factors involved in blood pressure regulation, endothelin 1 (ET-1) and angiotensin II (Ang II) regulate citosolic Ca2+ concentrations and therefore are considered in this review. PE is associated with higher circulating and placental ET-1 levels, observation that explains, at least in part, vasoconstriction and oxidative stress. Higher and lower Ang II sensitivity seen in PE and normal pregnancy, respectively, could not be explained by changes in renin-angiotensin system components, including Ang II receptors (ATI). During normal pregnancy, ATI receptors are found as monomers and are inactivated by reactive oxygen species (ROS) leading to lower Ang II sensitivity. In contrast, PE is associated with increased ATl/bradicinin receptors (B2) heterodimers which are resistant to inactivation by ROS, maintaining increased ATI-receptor stimulated signaling in PE. In adittion, AT-1 agonistic antibodies (AT1-AA) obtained from PE women increases intracellular Ca2+, NADPH oxidase components and ROS, effects not observed with normal pregnancy AT1-AA. Conclusion. High ET-1 levels, the presence of AT1/B2 receptor heterodimers and increased AT1-AA are involved, at least in part, in the hypertensive and oxidative stress states in PE.

Introducción. Se reconoce que el desarrollo de la hipertensión en la preeclampsia (PE) resulta del daño endotelial generalizado y/o de la falta de equilibrio en la producción y/o acción de agentes vasoactivos, lo que conlleva al incremento en la concentración citosólica de Ca2+ que resulta en vasoconstricción y disminución de la perfusión sanguínea en los órganos, incluyendo la unidad fetoplacentaria. Dentro de los factores vaso-activos que regulan la presión arterial, en la presente revisión se consideró a la endotelina 1 (ET-1) y a la angiotensina II (Ang II), factores que regulan la concentración citosólica de Ca2+. En comparación con el embarazo normal, la PE se asocia con mayor concentración en suero y placenta de ET-1, lo que explica en parte la vasoconstricción y el estado de estrés oxidativo. La respuesta exagerada en la PE y el estado de refractariedad en el embarazo normal a la Ang II no pueden explicarse por componentes del sistema renina-angiotensina, incluyendo a los receptores de Ang II (ATI). Durante el embarazo normal los receptores AT-1 se encuentran en forma de monómeros y son inactivados por las especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que se asocia con menor respuesta a Ang II. En cambio, la respuesta exagerada a la Ang II durante la PE puede deberse a la heterodimerizacion de los receptores ATI con los de bradicinina (B2), estado que les confiere resistencia a la inactivación por las especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que explica el incremento en la concentración del Ca2+ intracelular. Además, los anticuerpos agonistas del receptor ATI (AT1-AA) de mujeres PE aumenta la concentración de Ca2+ intracelular, de la NADPH oxidasa y de ROS, efectos que no se presentan al utilizar AT1-AA de embarazadas normotensas. Conclusión. Las altas concentraciones de ET-1, la presencia de receptores ATI en forma de heterodimeros ATI/ B2 y el aumento en los AT1-AA explican en parte, el estado de hipertensión y de estrés oxidativo de la PE.

Angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphism and essential hypertension in San Luis

Essential hypertension is considered a multifactorial trait resulting from a combination of environmental and genetic factors. The angiotensin II type 1 receptor mediates the vasoconstrictor and growth-promoting effects of Ang II. The A1166C polymorphism of the AT1 receptor gene may be associated with cardiovascular phenotypes, such as high arterial blood pressure, aortic stiffness, and increased cardiovascular risk. We investigated the association between this A1166C polymorphism and hypertension in hypertense and normotense subjects from San Luis (Argentina) by mismatch PCR-RFLP analysis. Hypertense patients exhibited significant increases in lipid related values and body mass index. The frequency of occurrence of the C1166 allele was higher among patients with hypertension (0.19) than in the control group (0.06). No significant association was found between this polymorphism and essential hypertension in the study population, although the AC genotype prevalence was higher in patients with hypertension and positive family history of hypertension (32%) than in control subjects (12%). Patients with the A1166C polymorphism exhibited higher levels of serum total cholesterol, LDL-cholesterol and BMI than in control subjects. Taken together the genotype and biochemical parameters and considering the restrictive selection criteria used, the present results suggest a correlation between AT1 A1166C gene polymorphism and risk of cardiovascular disease.

A importância da medicação anti-hipertensiva na adesão ao tratamento / The importance of the antihypertensive agent in the compliance to the treatment

Apesar dos conhecidos benefícios da terapia anti-hipertensiva na prevenção das complicações cardiovasculares da hipertensão arterial, o percentual de pacientes hipertensos que alcançam os alvos-terapêuticos é baixo. Como os atuais agentes anti-hipertensivos são eficazes em reduzir a pressão arterial, a baixa adesão à terapia medicamentosa é uma das principais razões do baixo percentual de controle destes pacientes. Significativas diferenças na adesão têm sido demonstradas quando do uso de diferentes classes de anti-hipertensivos, evidenciando melhor adesão às medicações com menor perfil dê éfeitos colaterais. Esta revisão enfoca trabalhos sobre a adésão ao valsartana, um antagonista dos receptores do tipo 1 da angiotensina II, comparativamente a outros anti-hipertensivos. Os trabalhos levantados na literatura apontaram maior índice de adesão e persistência a terapia anti-hipertensiva com o uso do valsartana, mesmo quando comparado com drogas reconhecidamente bem toleradas, como os inibidores da enzima de conversão da angiotensina e os antagonistas dos canais de cálcio, indicando assim, que a escolha da classe de anti-hipertensivo, influencia a adesão ao tratamento medicamentoso, sendo, portanto, uma forma de melhorar os índices de controle da hipertensão arterial

Liberacion de endotelina-1 por angiotensina ii en miocitos cardiacos aislados / Angiotensin II-induced endothelin-1 release in cardiac myocytes

Muchos de los efectos de la angiotensina II (Ang II) son mediados en realidad por la acción de endotelina (ET) endógena liberada y/o producida en respuesta a la Ang II. En este trabajo evaluamos la interacción Ang II/ET-1, sus consecuencias en la contractilidad cardíaca y el papel de las especies reactivas del oxígeno (EROs). Se usaron cardiomiocitos aislados de gato. La Ang II, 1 nM, produjo un efecto inotrópico positivo (EIP) de 31.8±3.8% que fue cancelado por inhibición de los receptores AT1, de los receptores de ET, del intercambiador Na+/H+ (NHE), del modo inverso del intercambiador Na+/Ca2+ (NCX) o por el secuestro de EROs. La Ang II, 100 nM, produjo un EIP de 70.5±7.6% que fue cancelado por inhibición de los receptores AT1y bloqueado en parte por inhibición de los receptores de ET, del NHE, del modo inverso del NCX o por el secuestro de EROs. La Ang II, 1 nM, incrementó el ARNm de la preproET-1 lo cual fue anulado por el bloqueo de los receptores AT1. Los resultados permiten concluir que el EIP de la Ang II es debido a la acción de la ET-1 endógena liberada/formada por la Ang II. La ET-1 produce: estimulación del NHE, activación del modo inverso del NCX y un consecuente EIP. Dentro de esta cascada también participarían los EROs.

Many of the effects thought to be due to angiotensin II (Ang II) are due to the release/formation of endothelin (ET). We tested whether Ang II elicits its positive inotropic effect (PIE) by the action of endogenous ET-1 and the role played by the reactive oxygen species (ROS) in this mechanism. Experiments were performed in cat isolated ventricular myocytes in which sarcomere shortening (SS) was measured to asses contractility after pharmacological interventions and the effect of Ang II on inotropism were analyzed. Ang II 1 nM increased SS by 31.8±3.8% (p<0.05). This PIE was cancelled by AT1 receptor blockade, by ET-1 receptors blockade, by Na+/H+ exchanger (NHE) inhibition, by reverse mode Na+/Ca2+ exchanger (NCX) blockade or by ROS scavenging. Ang II 100 nM increases SS by 70.5±7.6% (p<0.05). This PIE was completely abolished by AT1 receptors blockade and were partially bocked by ET-1 receptors blockade, by NHE inhibition, by reverse mode NCX blockade or by ROS scavenging. Ang II increased preproET-1 mRNA, effect that was blunted by AT1 receptors blockade. We conclude that Ang II induces (through its AT1 receptor) release/formation of ET-1, which acting in autocrine fashion on ET receptors of the isolated myocytes increases inotropism through NHE stimulation and NCX reverse mode activation. The participation of ROS is involved is this chain of events.

Efeito de mutações sítio-dirigidas nas hélices I, V e VI sobre a maturação, dimerização e interação com o agonista do receptor AT1 de angiotensina II / Effect of site-directed mutations in helices I, V and VI on the maturation, dimerization and interaction with agonist of angiotensin II AT1 receptor

Objetivos: Analisar a participação de resíduos aromáticos e alifáticos específicos encontrados na face mais externa das hélices I, V e VI do receptor AT1 na maturação, tráfego, formação do complexo agonista/receptor e dimerização. Métodos: Construção do vetor contendo o receptor A T 1 alinhado com a proteína fluorescente verde (EGFP) e realização de mutações pontuais nos resíduos V29 e 137 da hélice I, L195, L197, 1201, L202, L205 e F2o6 da hélice V e 1258, F259, F261, L262, L265 e 1266 da hélice VI para ácido glutâmico e alanina. Células HEK293 transfectadas com estas construções de forma transiente ou estável foram utilizadas para a realização dos experimentos de microscopia de fluorescência, ligação e afinidade à Ang II, BRET, análise do trafego subcelular, dimerização do receptor e experimentos funcionais através de ensaio de gene repórter. Resultados: O estudo da distribuição subcelular do receptor AT1 mostrou que o receptor selvagem encontra-se na membrana e que a substituição de resíduos para alanina, em todos os casos, não afetou sua localização, exceto no mutante L205A que foi encontrado no núcleo. Por outro lado, as mutações para ácido glutâmico, na maioria das vezes, afetaram o tráfego do receptor. Embora muitos dos mutantes da hélice V contendo ácido glutâmico tenham sido encontrados na membrana, todos os da hélice VI ficaram retidos no retículo endoplasmático. Da mesma forma, a afinidade pela Ang II nos mutantes para alanina não foi afetada, enquanto que as mutações para resultaram em diminuição da afinidade. A homodimerização do receptor A T 1 selvagem foi observada, sendo que a mutação dos resíduos em questão, que acarreta efeitos diversos não interferiu com a dimerização na maioria dos casos, como observado nos experimentos de BRET. Ensaios com o gene repórter para luciferase confirmaram a funcionalidade de alguns dos receptores mutantes do AT1 estudados aqui. É interessante que alguns mutantes para ácido glutâmico tiveram aumento na atividade da luciferase mesmo não sendo expressos na membrana plasmática como é o caso do mutante L 197E. Conclusões: Os resíduos alifáticos e aromáticos da hélice V do receptor AT1 são responsáveis por manter a configuração do sítio de ligação para Ang II. Além disso, os resultados do presente trabalho permitem sugerir que a face externa da hélice VI seja necessária para o correto dobramento do receptor AT1. Finalmente, nossos dados corroboram evidências anteriores que o receptor AT1 seja um homodímero.

Modulação da função do receptoe AT1 da angiotensina II em células ovarianas de hamster chinês expressando o receptor AT1 selvagem ou mutante: mecanismos moleculares / Modulation of the angiotensin II AT1 recptor funcion in chines hamster ovary cells expressing wild and mutants AT1 receptors: molecular mechanisms

Durante o mestrado obtivemos mutantes (L265D e L262D) que apresentaram redução na afinidade, expressão funcional, e significante redução no ritmo de crescimento celular com baixa ativação da fosfolipase C, que foi correlacionado com um aumento significativo nos níveis basais de AMPc. Portanto foi nosso interesse reavaliar o fenótipo produzido pela expressão destes mutantes que apresentaram propriedades diferentes daquelas do receptor AT, selvagem. No doutorado novas mutações foram planejadas, e, para examinar a possível participação da segunda ponte dissulfeto na manutenção e conformação funcional do receptor ligado ao peptídio, os resíduos de cisteína no domínio EC da membrana foram substituídos pela serina e produzidos dois mutantes, C18S e o C18, 274S para estudar as consequências funcionais destas mutações. Também foi investigado o papel de uma inserção, isto é, uma sequência de 9 aminoácidos (de GIn26' a LyS171 ) a mais da terceira alça EC que não consta na maioria dos GPCRs, deletando esse segmento para verificar a expressão e a função do receptor. E, o papel do resíduo de asparagina 176 da EC-2 do receptor AT, em promover a interação intramolecular ou mesmo com a AII, através da produção do mutante N176A. Essas mutações foram testadas em células CHO transfectadas com os vetores de expressão contendo os cDNAs do receptor AT, selvagem (WT) com as devidas substituições introduzidas. O estudo com os mutantes previamente obtidos, L262D e 1-265D, mostraram elevados valores basais de cAMP e IP, que, foram bem correlacionados com a inibição do crescimento celular e com a concentração reduzida de DNA genômico em comparação ao receptor WT. A ação mediada pelo AMPc pareceu não ser limitada à proliferação celular, pois foi também observada transformação morfológica das células CHO que foi atribuída à ação do AMPc…(au)

O polimorfismo A1166C do receptor tipo 1 da angiotensina II no infarto agudo do miocárdio / The A1166C polymorphism of the angiotensin II type-1 receptor in acute myocardial infarction

RESUMO OBJETIVO:Avaliar a associação do polimorfismo A1166C do gene do receptor AT1 da angiotensina II (AT1R) com o infarto agudo do miocárdio e a severidade da doença arterial coronariana. MÉTODOS: Estudo prospectivo, transversal de 110 pacientes com infarto agudo do miocárdio submetidos à angiografia coronariana com lesão significante (> 50 por cento) avaliada por três critérios de severidade: número de vasos lesados, morfologia da placa aterosclerótica e escore de risco coronariano. Sem lesões coronarianas 104 indivíduos controles. O polimorfismo A1166C do gene do AT1R foi determinado pela reação em cadeia da polimerase no DNA dos leucócitos do sangue periférico. Os fatores de risco coronariano clássicos foram analisados em todos os indivíduos. RESULTADOS: Na estratificação dos genótipos em relação aos fatores de risco apenas o tabagismo teve predominância nos heterozigotos AC (p = 0,02). A freqüência dos genótipos nos pacientes infartados foi de AA = 54,5 por cento; AC = 35,5 por cento e CC = 10 por cento, sendo similar e não significativa em relação aos controles (p = 0,83). Não houve aumento do risco de infarto agudo do miocárdio nas comparações dos genótipos CC vs AA (OR = 1,35; IC-95 por cento = 0,50 - 3,59), AC vs AA (OR = 1,03; IC-95 por cento = 0,58 - 1,84 e AA+AC vs AA (OR = 1,33; IC-95 por cento = 0,51 - 3,45). Nenhum dos critérios de severidade teve associação significativa com os genótipos. CONCLUSAO: Os nossos resultados indicam não haver associação do polimorfismo A1166C do AT1R com o infarto agudo do miocárdio e nem com a severidade da doença arterial coronariana segundo nossos resultados.

Efectos de la administración temprana de losartan sobre el remodelamiento ventricular en conejos con infarto de miocardio experimental / Effects of the early administration of losartan on ventricular remodeling in rabbits with experimental myocardial infarction

En el presente trabajo se evaluaron los efectos de la administración temprana de losartán (Los) sobre el remodelamiento ventricular (RV) en conejos con infarto de miocardio experimental (IM). Conejos Neozelandeses fueron sometidos a ligadura de la arteria coronaria izquierda. Se analizaron 4 grupos: operación simulada o sham (G1, n=13), IM (G2, n=13), sham+Los (G3, n=13), IM+Los (G4, n=13). Los (12.5 mg/ kg/día) comenzó a administrarse a las 3 horas post-cirugía. Los animales fueron sacrificados a los 35 días y los corazones fueron perfundidos según la técnica de Langendorff. Se determinaron curvas presión-volumen (P/V) sistólicas y diastólicas. Cuatro animales por grupo se utilizaron para análisis histológico. Los corazones fueron fijados en formol, se calculó la relación entre el peso del corazón y del animal (Pc/Pa), seguidamente fueron cortados y teñidos con tricrómico de Masson y picrosirius red. Se midió el tamaño de infarto (TIM%), el espesor del septum (ES) y de la cicatriz, mediante análisis morfométrico. Los valores se expresaron como X ±SEM. Resultados: El TIM% fue en G2=25.38±5.31% y en G4=21.85±4.13%. El Pc/Pa fue: 3.45±0.16; 3.52±0.25; 2.87±0.16 (p<0.05 vs grupos no tratados) y 3.23±0.18 en G1, G2, G3 y G4 respectivamente. El Los desplazó la relación P/V diastólica a la derecha tanto en G3 y G4 (p<0.05 vs G1 y G2) y no modificó la función sistólica. El ES fue menor en G3 y G4 (P<0.05 vs G2), y G4 presentó menor cantidad de colágeno en la cicatriz (p<0.05 vs G2). En conclusión: la administración temprana de losartán modificó desfavorablemete el RV, incrementando la dilatación y disminuyendo el colágeno y el espesor de la cicatriz.