Modificação de proteínas por produtos de oxidação do colesterol: mecanismos e implicações biológicas / Modification of proteins by oxidation products of cholesterol: mechanisms and biological implications

O colesterol é um importante componente das membranas celulares em eucariotos superiores, desempenhando papéis estruturais e funcionais. O colesterol possui uma insaturação em sua estrutura sendo, portanto, alvo de oxidação mediada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. A oxidação não enzimática do colesterol gera, como produtos primários, os hidroperóxidos de colesterol. Tais moléculas, por sua vez, são altamente reativas e podem reagir com metais livres e/ou metaloproteínas, trazendo consequências à celula. Neste sentido, o primeiro capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação dos hidroperóxidos de colesterol (ChOOH) com o citocromo c (citc), uma heme proteína envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria. Análises de espectroscopia no UV-Vis mostraram que o ChOOH promove o bleaching da banda Soret do citc de uma maneira dose-dependente. Mais ainda, esta reação leva à formação de radicais centrados em carbono tanto na proteína como no lipídeo, sugerindo uma redução homolítica do ChOOH. Como consequências, pode-se observar a oligomerização do citc, um processo que pode influenciar no transporte de elétrons bem como na sinalização para a apoptose. A partir da reação do citc com ChOOH podem surgir, direta ou indiretamente, outras espécies reativas, como aldeídos, cetonas e epóxidos. Dentre estas, destacam-se os aldeídos de colesterol, em particular o colesterol secoaldeído (CSec) e o carboxialdeído (ChAld), uma vez que foram encontrados elevados em placas ateroscleróticas e em tecidos cerebrais de pacientes com doenças neurodegenerativas. Tais espécies podem reagir com resíduos de aminoácidos provocando alterações estruturais e funcionais em proteínas. Neste sentido, o segundo capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação do ChAld com citc. Usando modelos mimétivos de membrana e espectrometria de massas, foi mostrado que o ChAld modifica covalentemente o citc por um mecanismo consistente com a formação de bases de Schiff. Tal modificação ocorre preferencialmente em resíduos de lisina que interagem com a membrana. Estas modificações influenciam na afinidade do citc pela membrana, aumentando sua aderência, o que pode ter influência no transporte de elétrons e sinalização para a apoptose. No terceiro e último capítulo deste trabalho nós buscamos uma ferramente analítica que permitisse analisar modificação de proteínas promovidas por produtos de oxidação de colesterol e outros esteróis. Em um estudo realizado em colaboração com o grupo do professor Porter na Universidade de Vanderbilt, utilizamos ensaios baseados em click chemistry para buscar proteínas modificadas. Para isso, foram sintetizados derivados de colesterol e 7-deidrocolesterol (7-DHC, precursor imediato do colesterol) contendo um grupo alquinil na sua cadeia lateral. Este grupo pode ser ligado a um grupo azida por meio de uma reação de cicloadição, em um processo conhecido como click chemistry. Após a síntese e caracterização dos derivados lipídicos contendo o grupo alquinil na cadeia lateral, células Neuro2a foram tratadas com o alquinil-7-DHC e o alquinil-colesterol para averiguar seu metabolismo. Análises por HPLC-MS/MS mostraram que ambos derivados contendo o grupo alquinil foram metabolisados e convertdos nos respectivos ésteres. Usando um modelo celular para a doença conhecida como Sindrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS), doença caracterizada pela deficiência na enzima 7-deidrocolesterol redutase, foi mostrado que o acúmulo característico de 7-DHC nos pacientes pode levar a uma maior modificação de proteínas promovidas por seus derivados, o que pode contribuir para o desenvolvimento da doença

Cholesterol is an important component of eukaryotic cellular membranes, where it has an influence in the fluidity and stability. Due to the presence of a double bond in its structure, cholesterol can be oxidized by reactive oxygen and nitrogen species. This non-enzymatic oxidation generates, as primary products, cholesterol hydroperoxides. Such molecules, in turn, are highly reactive and can react with free metal ions and/or metalloproteins, affecting cell metabolism. Therefore, the first chapter of the present study aims to investigate the reaction of cholesterol hydroperoxides (ChOOH) with cytochrome c (cytc), a heme protein involved in the mitochondrial electron transport. Spectroscopic analyses in the UV-Vis region showed that ChOOH induces a dose-dependent bleaching of cytc's Soret band. In addition, this reaction leads to the formation of carbon-centered radicals on both protein and lipid, suggesting a homolytic reduction of ChOOH. As consequences, cytc undergoes oligomerization, a process that can influence electron transport and apoptosis signaling. The reaction of cytc and ChOOH can produce, directly or indirectly, reactive species such as epoxides, aldehydes and ketones. Among them, cholesterol aldehydes, such as cholesterol secoaldehyde (CSec) and cholesterol carboxyaldehyde (ChAld), are of particular interest, since they were previously found elevated in atherosclerotic plaques and brain tissue of patients bearing neurodegenerative diseases. These species can also react with amino acid residues leading to protein denaturation and malfunction. With that in mind, the second chapter of this study aims to investigate the reaction of ChAld and cytc. Using mimetic membrane models and mass spectrometry analyses, we showed that ChAld covalently modifies cytc through a mechanism consistent with the formation of Schiff base adducts. Such modification occurs mostly at lysine residues that are known to interact with the membrane. The modifications have an influence in the affinity of cytc to the membrane, where they increase its binding to the membrane, a process that could affect the electron transport and apoptosis signaling. In the last and third chapter of this study we wanted an analytical tool that allowed the investigation of protein adduction promoted by cholesterol and other sterols-derived oxidation products. In a study performed in collaboration with the Porter group from Vanderbilt University, we used analyses based on click chemistry to search for protein adduction. To address that, we first synthesized derivatives of cholesterol and 7-dehydrocholesterol (7-DHC, the immediate precursor of cholesterol) containing an alkynyl group in the side chain. The alkynyl group can be ligated to an azide group through a cycloaddition reaction, in a process known as click chemistry. After the synthesis and characterization of alkynyl derivatives, Neuro2a cells were treated with alkynyl-7-DHC and alkynyl-cholesterol to check their metabolism. HPLC-MS/MS analyses showed that both alkynyl derivatives are metabolized and converted into their respective esters. In addition, using a cell model for Smith-Lemli-Optiz Syndrome (SLOS), a disease characterized by the deficiency in the dehydrocholesterol reductase 7, we showed that the characteristic accumulation of 7-DHC in SLOS patients might be associated with protein adduction promoted by its oxidation products, which might contribute to the development of the disease

Proteínas totales y factor de bioconcentración por exposición a metales en la Gambusia punctata (Poeciliidae) / Total proteins and bioconcentration factor by metal exposure in Gambusia punctata (Poeciliidae)

El objetivo del presente trabajo fue evaluar niveles de proteínas totales y el factor de bioconcentración por exposición a metales en la Gambusia punctata. La especie fue muestreada en el ecosistema Filé y luego trasladada hacia condiciones de laboratorio, donde fueron diseñados 3 tratamientos a 2 réplicas con 25 ejemplares. Se determinó la concentración letal media (CL-50) como parámetro de toxicidad durante 48 horas de bioensayo. Los metales analizados fueron plomo y cadmio, cuantificados por espectroscopia de plasma inductivamente acoplados con vista axial. Transcurrido el experimento, la CL-50 correspondió a 0,1, ensayándose las concentraciones 0,06 y 5,78 mg/L, además del control negativo. Posteriormente se cuantificó el nivel de proteínas totales y los metales en agua, tejido y su relación mediante el factor de bioconcentración. El menor valor de proteínas fue ante la exposición al cadmio, con 43,9 por ciento de inhibición (p< 0,05) en comparación con el control; en el caso del plomo se determinó 2,5 por ciento de estimulación. Las mayores concentraciones en agua y tejido correspondieron a este último, no así para el factor de bioconcentración. Se concluyó que los resultados mostraron sensibilidad en la respuesta del contenido de proteínas totales y alta capacidad bioacumulativa para ambos metales.

The aim of this study was to evaluate levels of total proteins and the bioconcentration factor by metal exposure in Gambusia punctata. The species was sampled in the ecosystem Filé and then transferred to the laboratory, where 3 treatments in 2 replications with 25 copies were designed. Mean lethal concentration (CL-50) was determined as a toxicity parameter for 48 hours of bioassay. The analyzed metals were lead and cadmium, quantified by plasma spectroscopy inductively coupled with axial view. After the experiment, the CL-50 corresponded to 0.1 and concentrations of 0.06 and 5.78 mg/L and the negative control were tested. Then the level of total proteins and metals in water, tissue and its relationship by means of the bioconcentration factor were quantified. The lower value of proteins was by exposure to cadmium with 43.9 percent of inhibition (p <0.05) compared with the control; for lead 2.5 percent of stimulation was determined. The highest concentrations in water and tissue corresponded to the latter, but not for the bioconcentration factor. It was concluded that the results showed sensitivity in the response of total protein content and a high bioaccumulative capacity for both metals.

Estudo da expressão imuno-histoquímica das MMps -2, -7, -9 e TIMPs -1 e -2 em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores / Study of immunohistochemical expression of MMPs -2, -7, -9, and TIMPs -1 and -2 in pleomorphic adenomas and adenoid cystic carcinoma of minor salivary glands

0 balanço entre a expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs) tem sido relacionado a vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo a morfogênese de glândulas salivares e os processos de invasão e metástase tumoral. O adenoma pleomórfico (AP) e o carcinoma adenóide cístico (CAC) representam,respectivamente, neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares que, embora compartilhem a mesma origem celular, apresentam comportamentos biológicos distintos. O propósito deste estudo foi comparar a expressão imuno-histoquímica das MMPs -2, -7, -9 e -26 e dos TIMPs -1 e -2 em casos de AP e CAC de glândulas salivares menores. Vinte casosde AP e vinte casos de CAC foram avaliados quanto à presença, intensidade e localização das MMPs e TIMPs no parênquima tumoral. A maioria dos APs e CACs apresentaram alta expressão das MMPs e dos TIMPs, predominantemente localizada nas células tumorais. Nãohouve diferença estatisticamente significativa na expressão das MMPs -2 (p=0,359), -7 (p=0,081) e -26 (p=0,553), bem como dos TIMPs -1 (p=0,657) e -2 (p=0,248), entre o parênquima dos APs e CACs. A MMP-9 demonstrou uma diferença significativa de expressão entre os dois tumores, apresentando o CAC uma marcação mais intensa para esta gelatinase(p=0,041). A forte expressão da MMP-9 observada no parênquima dos CACs sugere que esta gelatinase possa desempenhar um papel importante no comportamento biológico destes tumores. Por outro lado, apesar de não ocorrer uma diferença significativa entre as médias das MMPs -2, 7 e 26 nos tumores estudados, os dados quando analisados em conjunto sugeremque estas proteases podem estar participando de processos de remodelação tecidual em ambos os tumores, mas não apresentam uma relação direta com o padrão de agressividade do CAC...

Hydrogen peroxide induces a specific DNA base change profile in the presence of the iron chelator 2, 2’ dipyridyl in Escherichia coli

Pretreatment of Escherichia coli cultures with the iron chelator 2,2’-dipyridyl (1 mM) protects against the lethal effects of low concentrations of hydrogen peroxide (<15 mM). However, at H2O2 concentrations equal to or greater than 15 mM, dipyridyl pretreatment increases lethality and mutagenesis, which is attributed to the formation of different types of DNA lesions. We show here that pretreatment with dipyridyl (1 mM) prior to challenge with high H2O2 concentrations (≥15 mM) induced mainly G:C→A:T transitions (more than 100X with 15 mM and more than 250X with 20 mM over the spontaneous mutagenesis rate) in E. coli. In contrast, high H2O2 concentrations in the absence of dipyridyl preferentially induced A:T→T:A transversions (more than 1800X and more than 300X over spontaneous mutagenesis for 15 and 20 mM, respectively). We also show that in the fpg nth double mutant, the rpoB gene mutation (RifS-RifR) induced by 20 mM H2O2 alone (20X higher) was increased in 20 mM H2O2 and dipyridyl-treated cultures (110X higher), suggesting additional and/or different lesions in cells treated with H2O2 under iron deprivation. It is suggested that, upon iron deprivation, cytosine may be the main damaged base and the origin of the pre-mutagenic lesions induced by H2O2.

Purification and characterization of extracellular lipase from a new strain: Pseudomonas aeruginosa SRT 9 / Purificação e caracterização de uma lipase extracelular produzida por uma nova cepa: Pseudomonas aeruginosa SRT9

An extra cellular lipase was isolated and purified from the culture broth of Pseudomonas aeruginosa SRT 9 to apparent homogeneity using ammonium sulfate precipitation followed by chromatographic techniques on phenyl Sepharose CL- 4B and Mono Q HR 5/5 column, resulting in a purification factor of 98 fold with specific activity of 12307.8 U/mg. The molecular weight of the purified lipase was estimated by SDS-PAGE to be 29 kDa with isoelectric point of 4.5. Maximum lipase activity was observed in a wide range of temperature and pH values with optimum temperature of 55ºC and pH 6.9. The lipase preferably acted on triacylglycerols of long chain (C14-C16) fatty acids. The lipase was inhibited strongly by EDTA suggesting the enzyme might be metalloprotein. SDS and metal ions such as Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+ and Fe2+ decreased the lipase activity remarkedly. Its marked stability and activity in organic solvents suggest that this lipase is highly suitable as a biotechnological tool with a variety of applications including organo synthetic reactions and preparation of enantiomerically pure pharmaceuticals. The Km and Vmax value of the purified enzyme for triolein hydrolysis were calculated to be 1.11 mmol/L and 0.05 mmol/L/minrespectively.

Uma lipase extracelular foi isolada e purificada a partir de um caldo de cultura de Pseudomonas aeruginosa SRT9 até homogeneidade visível empregando-se precipitação com sulfato de amônia, seguida de técnicas cromatográficas em colunas de fenil sefarose CL-4B e Mono Q HR 5/5, obtendo-se um fator de purificação de 98 vezes, e atividade especifica de 12307,8 U/mg. Por SDS_PAGE, estimou-se que o peso molecular da lipase purificada é 29kDa, com um ponto isoelétrico de 4,5. A lipase apresentou atividade máxima em uma ampla faixa de temperatura e pH, com ótimos a 55ºC e pH 6,9. A lípase foi mais ativa sobre triacilglicerois de cadeia longa (C14-C16). A lipase foi fortemente inibida por EDTA, o que sugere que a enzima pode ser uma metaloproteína. SDS e íons metálicos, como Hg2+, Zn2+,Cu2+, Ag2+ e Fe2+, diminuíram marcadamente a atividade da lipase. Sua grande estabilidade e atividade em solventes organicos sugerem que esta lípase pode ser uma excelente ferramenta tecnológica com várias aplicações como reações organosintéticas e preparação de produtos farmacêuticos enantiomericamente puros. Os valores de Km e Vmax para a enzima purificada na hidrólise de trioleina foram 1,11 mmol/L e 0,05 mmol/L/min, respectivamente.

Contribuição à avaliação de pacientes com adednocarcinoma pulmonar avançado: estudo imunohistoquimico da espressão de fator 1 e de transcrição tireoidiano e da metaloproteínas 9 / Contribution to the prognostic assessment of patientes with advanced lunh adenovarcinoma; evaluation by immunohistochemical methods of thyroid transcription factor-1 and matrix metalloproteinase-9

O valor prognóstico da expressão do Fator 1 de Transcrição Tireoideano (TTF-1) e da metaloproteinase-9 (MMP-9) foi avaliado em 51 pacientes com adenocarcinoma pulmonar avançado. Foram fatores de mau prognóstico : baixa capacidade funcional (P=0,017), baixa expressão de TTF-1 (p=0,001) e alta expressão de MMP-9 (p=0,008). Identificaram-se três grupos de risco para mortalidade : baixo risco (TTF-140 por cento e MMP-9<80 por cento; sobrevida : 127,6 semanas), risco intermediário (TTF-1<40 por cento ou MMP-980 por cento; sobrevida : 39,0 semanas) e alto risco (TTF-1<40 por cento e MMP-980 por cento; sobrevida: 16,4 semanas). Com a detecção destes marcadores, podem-se identificar subgrupos com prognósticos clinicamente distintos / The prognostic value of Thyroid Transcription Factor-1 (TTF-1) and Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) tumor expression was evaluated in 51 patients with advanced lung adenocarcinoma. Poor performance status (P=0,017), low TTF-1 (P=0.001), and high MMP-9(P=0.008) were independent prognostic factors. There were three risk group: low risk (TTF-140 per cent and MMP-9<80 per cent; median survival: 127.6 wk), intermediate risk (TTF-1<40 per cent or MMP-9>80 per cent; median survival: 39.0WK), and high risk (TTF-1<40 per cent and MMP-9 80 per cent; median survival: 16.4 wk). Evaluation of TTF-1 and MMP-9 may allow us to identify different, clinically meaningful, prognostic group of lung adenocarcinoma patients ...

Expresión de biomarcadores de contaminación ambiental en organismos acuáticos bonaerenses / Biomarkers of contamination in coastal aquatic organisms of Río de La Plata (Argentina)

El desarrollo y aplicación de herramientas bioanalíticas en el diagnóstico ambiental ha cobrado un importante auge en la última década. De éstas, el grupo constituido por el conjunto de modificaciones a nivel celular y molecular que indican la presencia de contaminantes, ha recibido la denominación de "biomarcadores de contaminación". Estos se caracterizan por indicar en organismos centinelas la presencia subletal de xenobióticos de forma temprana. Entre los biomarcadores se destaca el estudio de la expresión de proteínas citosólicas como las metalotioneínas (o fitoquelatinas cuando de plantas se trata), y las proteínas de estrés ("Stress Proteins"), constituyendo ambos grupos descripciones complementarias, refiriendo sólo el primero respuesta específica a la exposición a metales. En esta presentación se exponen los resultados obtenidos en el desarrollo y optimización de biomarcadores en organismos representativos de la biota presente en la franja costera sur del Río de La Plata como Corbicula fluminea y Limnoperna fortunei (malacofauna regional) y Schoenoplectus californicus, Pistia stratiotes y Sagitaria montevidensis, plantas acuáticas de gran ubicuidad en la zona. Particularmente se analizan las cinéticas de captación de metales por parte de dichos organismos y su correlación con la expresión de proteínas citosólicas. La concentración de metales se determina por absorción atómica, mientras que el análisis de los perfiles proteicos se realiza mediante electroforesis SDS-PAGE (Tris-tricina)

Porphyrinosilica and metalloporphyrinosilica: hybrid organic-inorganic materials prepared by prepared by sol-gel processing

New materials porphyrinosilica and metalloporphyrinosilica template have been obtained by a sol-gel processing where functionalyzed porphyrins and metalloporphyrins "building blocks" were assembled into a three-dimensional silicate network. The optimized conditions for preparation of these materials are reviseed. The monomer precursors porphyrinopropylsilyl and metalloporphyrinopropylsilyl preparation reactions and subsequent one pot sol-gel processing with tetraethoxysilane are discussed. In the case of metalloporphyrins the nitrogen base coordinates to the central metal and acts as a template in the molecular imprinting technique. UV-visible absorption spectroscopy, thermogravimetric analysis, electron paramagnetic resonance, nuclear magnetic spectra, infrared spectra, luminescence spectra, surface area and electron spectroscopy imaging of the materials are used to characterize the prepared materials. The catalytic activities of these metalloporphyrinosilica-template are compared.

Calcium- and zinc-binding proteins in intracellular transport

The complex mechanism of intracellular transport is regulated by free calcium in different manners. Calcium binding proteins regulate several aspects of the vesicle fusion mechanism mediated by NSF (N-ethylmaleimide sensitive fusion factor). At least in some regulated exocytosis, calcium-binding proteins are the trigger for fusion downstream of NSF, Still, calcium-binding proteins, such as annexins, may be part of a different fusion mechanism mediating some specific transport steps or working in parallel to the NSF-dependent fusion process. Calcium is not the only ion necessary for the function of factors involved in vesicular transport. A zinc requirement has been also proposed. One of the zinc-dependent factors is probably a protein with a cysteine-rich region that coordinates zinc and binds phorbol esters. Although protein kinase C is the more prominent family of proteins carrying this domain, the factor necessary for transport does not appear to function as a kinase.