Nitric oxide modulates ATP-evoked currents in mouse Leydig cells

Testosterone synthesis within Leydig cells is a calcium-dependent process. Intracellular calcium levels are regulated by different processes including ATP-activated P2X purinergic receptors, T-type Ca2+ channels modulated by the luteinizing hormone, and intracellular calcium storages recruited by a calcium-induced calcium release mechanism. On the other hand, nitric oxide (NO) is reported to have an inhibitory role in testosterone production. Based on these observations, we investigated the interaction between the purinergic and nitrergic systems in Leydig cells of adult mice. For this purpose, we recorded ATP-evoked currents in isolated Leydig cells using the whole cell patch clamp technique after treatment with L-NAME (300 μM and 1 mM), L-arginine (10, 100, 300, and 500 μM), ODQ (300 μM), and 8-Br-cGMP (100 μM). Our results show that NO produced by Leydig cells in basal conditions is insufficient to change the ATP-evoked currents and that extra NO provided by adding 300 μM L-arginine positively modulates the current through a mechanism involving the NO/cGMP signaling pathway. Thus, we report an interaction between the nitrergic and purinergic systems in Leydig cells and suggest that Ca2+ entry via the purinergic receptors can be regulated by NO.

Indirect orthodontic bonding - a modified technique for improved efficiency and precision

INTRODUCTION: The indirect bonding technique optimizes fixed appliance installation at the orthodontic office, ensuring precise bracket positioning, among other advantages. In this laboratory clinical phase, material and methods employed in creating the transfer tray are decisive to accuracy. OBJECTIVE: This article describes a simple, efficient and reproducible indirect bonding technique that allows the procedure to be carried out successfully. Variables influencing the orthodontic bonding are analyzed and discussed in order to aid professionals wishing to adopt the indirect bonding technique routinely in their clinical practice. .

INTRODUÇÃO: a técnica de colagem indireta prioriza a otimização do procedimento de montagem do aparelho fixo na clínica ortodôntica, assegurando, entre outras, vantagens relacionadas à precisão no posicionamento dos braquetes. Nesse procedimento clínico laboratorial, o material e o método de confecção da moldeira de transferência são determinantes no quesito precisão. OBJETIVO: este artigo descreve uma técnica de colagem indireta simples, eficiente e reprodutível, para que o procedimento possa ser realizado com sucesso. Variáveis que exercem influência sobre o procedimento são analisadas e discutidas, a fim de auxiliar o profissional a adotar, de forma rotineira, a técnica de colagem indireta em sua prática clínica. .

Evolution of mammographic image quality in the state of Rio de Janeiro / A evolução da qualidade da imagem em mamografia no Estado do Rio de Janeiro

Objective: To evaluate the evolution of mammographic image quality in the state of Rio de Janeiro on the basis of parameters measured and analyzed during health surveillance inspections in the period from 2006 to 2011. Materials and Methods: Descriptive study analyzing parameters connected with imaging quality of 52 mammography apparatuses inspected at least twice with a one-year interval. Results: Amongst the 16 analyzed parameters, 7 presented more than 70% of conformity, namely: compression paddle pressure intensity (85.1%), films development (72.7%), film response (72.7%), low contrast fine detail (92.2%), tumor mass visualization (76.5%), absence of image artifacts (94.1%), mammography-specific developers availability (88.2%). On the other hand, relevant parameters were below 50% conformity, namely: monthly image quality control testing (28.8%) and high contrast details with respect to microcalcifications visualization (47.1%). Conclusion: The analysis revealed critical situations in terms of compliance with the health surveillance standards. Priority should be given to those mammography apparatuses that remained non-compliant at the second inspection performed within the one-year interval. .

Objetivo: Avaliar a evolução da qualidade da imagem de mamógrafos localizados no Estado do Rio de Janeiro, de 2006 a 2011, com base em parâmetros medidos e observados durante inspeções sanitárias. Materiais e Métodos: Estudo descritivo sobre a evolução de parâmetros que condicionam a qualidade da imagem focalizou 52 mamógrafos, inspecionados no mínimo duas vezes, com intervalo de um ano. Resultados: Dos 16 parâmetros avaliados, 7 apresentaram mais de 70% de conformidade: força do dispositivo de compressão (85,1%), processamento dos filmes (72,7%), resposta do filme do serviço (72,7%), detalhes lineares de baixo contraste (92,2%), visualização de massas tumorais (76,5%), ausência de artefatos de imagem (94,1%), existência de processadoras específicas para mamografia (88,2%). Importantes parâmetros apresentaram-se abaixo de 50% de conformidade: realização de testes mensais da qualidade de imagem pelo estabelecimento (28,8%) e detalhes de alto contraste, que dizem respeito à visualização de microcalcificações (47,1%). Conclusão: A análise revelou situações críticas da atuação da vigilância sanitária, cuja prioridade deveria ser dirigida aos estacionários, ou seja, os mamógrafos que permaneceram na situação de não conformidade nas inspeções realizadas com intervalo de um ano. .

Tuberculosis in renal transplant patients: The experience of a single center in Medellín-Colombia, 2005-2013 / Tuberculose em pacientes transplantados renais: experiência de um único centro em Medellín-Colômbia, 2005-2013

Introduction: Tuberculosis is a common opportunistic infection in renal transplant patients. Objective: To obtain a clinical and laboratory description of transplant patients diagnosed with tuberculosis and their response to treatment during a period ranging from 2005 to 2013 at the Pablo Tobón Uribe Hospital. Methods: Retrospective and descriptive study. Results: In 641 renal transplants, tuberculosis was confirmed in 12 cases. Of these, 25% had a history of acute rejection, and 50% had creatinine levels greater than 1.5 mg/dl prior to infection. The disease typically presented as pulmonary (50%) and disseminated (33.3%). The first phase of treatment consisted of 3 months of HZRE (isoniazid, pyrazinamide, rifampicin and ethambutol) in 75% of the cases and HZME (isoniazid, pyrazinamide, moxifloxacin and ethambutol) in 25% of the cases. During the second phase of the treatment, 75% of the cases received isoniazid and rifampicin, and 25% of the cases received isoniazid and ethambutol. The length of treatment varied between 6 and 18 months. In 41.7% of patients, hepatotoxicity was associated with the beginning of anti-tuberculosis therapy. During a year-long follow-up, renal function remained stable, and the mortality rate was 16.7%. Conclusion: Tuberculosis in the renal transplant population studied caused diverse nonspecific symptoms. Pulmonary and disseminated tuberculosis were the most frequent forms and required prolonged treatment. Antituberculosis medications had a high toxicity and mortality. This infection must be considered when patients present with a febrile syndrome of unknown origin, especially during the first year after renal transplant. .

Introdução: A tuberculose é uma infecção oportunista comum em pacientes transplantados renais. Objetivo: Oferecer uma descrição clínica e laboratorial de pacientes transplantados com diagnóstico de tuberculose e sua resposta ao tratamento durante o período entre 2005 e 2013 no Hospital Pablo Tobón Uribe. Métodos: Estudo retrospectivo descritivo. Resultados: Em 641 transplantes renais, a tuberculose foi confirmada em 12 pacientes. Destes, 25% tinham histórico de rejeição aguda e 50% apresentaram níveis de creatinina superiores a 1,5 mg/dl antes da infecção. A patologia geralmente se apresentava como pulmonar (50%) e disseminada (33,3%). A primeira fase do tratamento consistiu de três meses de HZRE (isoniazida, pirazinamida, rifampicina e etambutol) em 75% dos casos e HZME (isoniazida, pirazinamida, moxifloxacina e etambutol) em 25% dos pacientes. Durante a segunda fase do tratamento, 75% dos pacientes receberam isoniazida e rifampicina e 25% isoniazida e etambutol. A duração do tratamento variou entre seis e 18 meses. Em 41,7% dos pacientes, hepatotoxicidade foi associada ao início do tratamento da tuberculose. Durante o seguimento de um ano a função renal manteve-se estável e a taxa de mortalidade foi de 16,7%. Conclusão: A tuberculose foi responsável por diversos sintomas inespecíficos na população de transplantados renais estudada. Tuberculose pulmonar e disseminada foram as formas mais frequentes de acometimento e necessitaram de tratamento prolongado. Medicamentos contra a tuberculose apresentaram alta toxicidade e mortalidade. Esta infecção deve ser considerada quando o paciente apresenta síndrome febril de origem desconhecida, especialmente durante o primeiro ano após o transplante renal. .

Identificação de resíduos de treonina e tirosina importantes na regulação da atividade do receptor P2X4 humano através de mutagênese sítio-dirigida / Identification of threonine and tyrosine residues important for human P2X4 receptor activity by site-directed mutagenesis

O receptor P2X4 (canal iônico controlado por adenosina-5'-trifosfato-ATP) está amplamente distribuído no sistema nervoso central e, após sua ativação, pode regular os níveis de cálcio intracelulares via permeação direta e por ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes. Tem sido proposto que a atividade do receptor pode ser importante na plasticidade sináptica. Tendo em vista a importância do receptor P2X4, sobretudo na fisiologia do sistema nervoso central, é útil caracterizá-lo farmacologicamente e entender os mecanismos moleculares que regulam sua atividade. Examinamos o papel que resíduos específicos N- e C-terminais desempenham na atividade do receptor P2X4 humano, combinando técnicas de biologia molecular, bioquímica e patch-clamp em células de rim de embrião humano (células HEK-293T). Células HEK-293T expressando o receptor P2X4 wild-type apresentaram correntes iônicas, cujas amplitudes dependeram da concentração de ATP, fornecendo um valor de EC50 de 1,37 ± 0,21 µM. Os receptores mutantes E14A e D16A exibiram respostas ao ATP equiparáveis àquelas do receptor selvagem, ao passo que os mutantes Y15A e T17A não foram funcionais, apesar de serem expressos na membrana plasmática das células. A inibição de tirosina fosfatases por pervanadato diminuiu fortemente correntes induzidas por ATP. Subsequente análise de citometria de fluxo na presença de um anticorpo contra resíduos de fosfotirosina indicaram que, entre as células que expressam o receptor P2X4, a percentagem de células fosfo-tirosina-positivas é a mesma para os mutantes Y372A (86 ± 10%) e Y378A (79 ± 6.9%), mas substancialmente menor para os mutantes Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) e Y372F (31 ± 1.7%), quando comparados com células que expressam o receptor wild-type (76 ± 5.6%). Resultados semelhantes foram obtidos quando quantificamos a expressão relativa de proteínas fosforiladas em resíduos de tirosina e expressamos através dos valores de intensidade de fluorescência média. Ensaios de western-blot revelaram que mesmo o mutante T17A é fosforilado em resíduos de treonina, sugerindo que o receptor P2X4 contém outros sítios de fosforilação. Entretanto, nenhum sinal de fosfotirosina foi detectado no receptor wild-type e nos mutantes, em que resíduos de tirosina foram substituídos por alanina ou fenilalanina. Não parece ser o resíduo Y15 o alvo de tal fosforilação, cabendo a ele um papel estrutural mais importante. Nossos dados também sugerem que a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas intermediárias regula a atividade do receptor P2X4

The human P2X4 receptor (ATP-gated ion channel) is widely distributed in the CNS and, after activation, participates in regulation of levels of intracellular calcium through direct permeation and activation of voltage-dependent calcium channels with well-defined functions including synaptic plasticity. Given the importance of the P2X4 receptor, especially in CNS physiology, we investigated the role that specific N- and C-termini residues play in human P2X4 receptor activity, by combining techniques of molecular biology, biochemistry and patch-clamping in human embryonic kidney cells (HEK-293T cells). HEK-293T cells expressing the wild-type P2X4 receptor showed ionic currents whose amplitudes depended on the ATP concentration, providing an EC50 value of 1.37 ± 0.21 mM. E14A and D16A receptor mutants exhibited responses to ATP comparable to those ones of wild-type receptor, whereas Y15A and T17A mutants were not functional, despite being expressed in the plasma membrane of cells. The inhibition of tyrosine phosphatases by pervanadate decreased strongly ATP-induced currents. Subsequent flow cytometry analysis in the presence of an antibody against phosphotyrosine residues indicated that, among the cells that express the P2X4 receptor, the percentage of phosphotyrosine-positive cells was the same for Y372A (86 ± 10%) and Y378A (79 ± 6.9%) mutants, however, substantially lower for Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) and Y372F (31 ± 1.7%) mutants when compared with cells expressing the wild-type receptor (76 ± 5.6%). Similar results were obtained by quantifying the relative expression of phosphotyrosine proteins. Western blot assays revealed that even the T17A mutant was phosphorylated at threonine residues, suggesting that the human P2X4 receptor also contains further phosphorylation sites. However, no phosphotyrosine-antibody signal was detected in the wild-type receptor and mutants in which tyrosine residues were replaced by alanine or phenylalanine. The residue Y15 is supposedly not the target of such phosphorylation, despite its important structural role. However, the present work indicates that tyrosine phosphorylation of intermediate signaling proteins regulates P2X4 receptor activity

Inibição da corrente de cálcio tipo l por tramadol e enantiômeros em miócitos cardíacos de ratos / Inhibition of L-type calcium current by tramadol and enantiomers in cardiac myocytes from rats

FUNDAMENTO: O tramadol é um analgésico de ação central cujo mecanismo de ação envolve a ativação de um receptor opioide. Anteriormente, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros apresentavam um efeito inotrópico negativo sobre o músculo papilar no qual o (+)-enantiômero era mais potente que (-)- e (±)-tramadol. OBJETIVO: No presente trabalho, investigamos os efeitos do tramadol e seus enantiômeros na corrente de cálcio tipo L (I Ca-L). MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em miócitos ventriculares isolados de ratos Wistar utilizando a técnica de patch-clamp com configuração de célula inteira. RESULTADOS: O tramadol (200 µM) reduziu a amplitude de pico do I Ca-L em potenciais de 0 a +50 mV. Em 0 mV, a I Ca-L foi reduzida em 33,7 ± 7,2 por cento. (+)- e (-)-tramadol (200 µM) produziram uma inibição semelhante da I Ca-L, na qual a amplitude do pico foi reduzida em 64,4 ± 2,8 por cento e 68,9 ± 5,8 por cento, respectivamente a 0 mV (P > 0,05). O tramadol, (+)- e (-)-tramadol mudaram a inativação de estado estacionário de I Ca-L para potenciais de membrana mais negativos. Além disso, tramadol e (+)-tramadol alteraram significativamente a curva de recuperação dependente de tempo da I Ca-L para a direita e reduziram a recuperação de I Ca-L da inativação. A constante de tempo foi aumentada de 175,6 ± 18,6 a 305,0 ± 32,9 ms (P < 0,01) para o tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms para 359,0 ± 23,8 ms (P < 0,05) para o (+)-tramadol. O agonista do receptor µ-opioide (DAMGO) não tem nenhum efeito na I Ca-L. CONCLUSÃO: A inibição da I Ca-L induzida por tramadol e seus enantiômeros não teve relação com a ativação de receptores opioides e poderia explicar, pelo menos em parte, seu efeito inotrópico negativo cardíaco.

BACKGROUND: Tramadol is a centrally acting analgesic, whose mechanism of action involves opioid-receptor activation. Previously, we have shown that tramadol and its enantiomers had a negative inotropic effect on the papillary muscle in which the (+)-enantiomer is more potent than (-)- and (±)-tramadol. OBJECTIVE: In this study, we investigated the effects of tramadol and its enantiomers on L-type calcium current (I Ca-L). RESULTS: Tramadol (200 µM) reduced the peak amplitude of I Ca-L at potentials from 0 to +50 mV. At 0 mV, I Ca-L was reduced by 33.7 ± 7.2 percent. (+)- and (-)-tramadol (200 µM) produced a similar inhibition of I Ca-L, in which the peak amplitude was reduced by 64.4 ± 2.8 percent and 68.9 ± 5.8 percent, respectively at 0 mV (p > 0.05). Tramadol, (+)- and (-)-tramadol shifted the steady-state inactivation of I Ca-L to more negative membrane potentials. Also, tramadol and (+)-tramadol markedly shifted the time-dependent recovery curve of I Ca-L to the right and slowed down the recovery of I Ca-L from inactivation. The time constant was increased from 175.6 ± 18.6 to 305.0 ± 32.9 ms (p < 0.01) for tramadol and from 248.1 ± 28.1 ms to 359.0 ± 23.8 ms (p < 0.05) for (+)-tramadol. The agonist of µ-opioid receptor DAMGO had no effect on the I Ca-L. CONCLUSION: The inhibition of I Ca-L induced by tramadol and its enantiomers was unrelated to the activation of opioid receptors and could explain, at least in part, their negative cardiac inotropic effect.

Development and validation of an electroanalytical methodology for determination of isoniazid and rifampicin content in pharmaceutical formulations / Desenvolvimento e validação de uma metodologia eletroanalítica para a determinação do teor de isoniazida e rifampicina em preparações farmacêuticas

Tuberculosis remains a major public health problem, especially in developing countries. Brazil presents the largest number of cases in Latin America and is among the 22 countries considered priorities by the World Health Organization (WHO). The Rio de Janeiro state has the largest number of cases registered in the country. The treatment of patients, commonly, makes use of the drugs isoniazid and rifampicin for six months. This study aimed to develop and validate an electroanalytical methodology, using the technique of differential pulse voltammetry for the determination of these drugs in the associated form, in order to evaluate the quality of medicines distributed in the state of Rio de Janeiro. The potential reduction for the isoniazid and rifampicin were -1.10 and -0.90 V. The developed and validated electroanalytical method presented a linear range of 0.25 to 1.25 mg/L to isoniazid, limits of detection and quantification of 0.05 and 0.14 mg/L, and recovery of 98.2 ± 0.4 percent; a tracking linear of 0.40 to 2.00 mg/L for rifampicin, with limits of detection and quantification of 0.07 and 0.19 mg/L and recovery of 95.8 ± 0.6 percent. Six lots of medicines from two pharmaceutical companies were analyzed. Only one of the samples showed unsatisfactory levels of rifampicin.

A tuberculose continua sendo um importante problema de saúde pública, especialmente em países em desenvolvimento. O Brasil apresenta o maior número de casos da América Latina, estando entre os 22 países considerados prioritários nas ações de controle da doença pela Organização Mundial da Saúde (OMS). No Brasil, o Rio de Janeiro é o estado com o maior número de casos registrados no país. O tratamento de doentes com tuberculose faz uso dos fármacos isoniazida e rifampicina durante seis meses. O presente trabalho objetivou desenvolver e validar metodologia eletroanalítica, utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial, para a determinação desses dois princípios ativos na forma associada e avaliar a qualidade dos medicamentos distribuídos no estado do Rio de Janeiro. Os potenciais de redução para a isoniazida e rifampicina foram respectivamente -1,10 e -0,90 V. O método eletroanalítico desenvolvido e validado apresentou para a isoniazida faixa linear de 0,25 a 1,25 mg/L, limites de detecção e quantificação de 0,05 e 0,14 mg/L e recuperação de 98,2 ± 0,4 por cento; para a rifampicina faixa linear de 0,40 a 2,00 mg/L, limites de detecção e quantificação de 0,07 e 0,19 mg/L e recuperação de 95,8 ± 0,6 por cento. Foram analisados 6 lotes de medicamentos de dois laboratórios farmacêuticos. Apenas uma das amostras apresentou teor de rifampicina insatisfatório.

Diferenciação neuronal in vitro de células-tronco mesenquimais humanas para uso em transplante neural / Neuronal differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro for neural transplantation

Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas...

Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into...

Estudo do segmento consenso adjacente ao domínio TM2 e parte do domínio TM2 do receptor P2X7: dinâmica molecular e atividade de canal iônico / Study of the segment adjacent consensus to domain TM2 and part of domain TM2 of receiver P2X7: molecular dynamics and activity of ionic canal

Os receptores purinérgicos do subtipo P2X7 (P2X7R) são proteínas de membrana que formam canais em resposta ao ATP extracelular. Permitem a passagem de cátions através da membrana celular, sendo expressos, preferencialmente, em células do sistema imune. Além disso, o P2X7R possui características bastante distintas dos demais subtipos da família P2X (P2XR) como, por exemplo, o domínio C-terminal mais longo e a capacidade de formar um grande poro citolítico que permite a passagem de moléculas de até 900 Da, sob ativação prolongada de ATP. Apesar dos vários estudos para a elucidação dos mecanismos de formação do poro associado a esses receptores, nenhum dado conclusivo foi publicado. O mesmo ocorrendo com sua estrutura molecular. Entretanto, alguns autores sugerem que o segmento M2 dos P2XRs, mais especificamente a região prevista como uma alfa-hélice transmembrana (TM2), não poderia estar configurada apenas como uma alfa-hélice, e sendo ainda esta região responsável pela seletividade desses canais. Outros autores demonstraram, através de ferramentas de bioinformática, que os P2XRs estariam configurados preferencialmente em folha beta e voltas. Nesse contexto, analisamos o segmento M2 e a região desse segmento composta por resíduos consensos (entre todos os subtipos de P2XRs) adjacentes ao TM2 do P2X7R de humano e parte do mesmo (peptídeo ADSEG) por programas de bioinformática. Os resultados das predições de bioinformática confirmaram os dados descritos na literatura de que o segmento M2 não estaria apenas configurado com estruturas em alfa-hélice, mas também em folhas beta. Com relação ao peptídeo ADSEG as predições de bioinformática e de dinâmica molecular foram confirmadas experimentalmente por dicroísmo circular. Onde esse segmento também estaria configurado preferencialmente em folha beta. Com o objetivo de testar se esse peptídeo e o P2X7R recombinante formariam canais ou poro citolítico, utilizamos bicamada lipídica artificial e patch-clamp.

A proteína recombinante do P2X7R não formou canal em bicamada lipídica artificial. Entretanto, quando o peptideo foi incorporado à bicamada lipídica planar, houve a formação de canais iônicos com condutância de 25,1 pS :t 0,2 (150 mM KCI) e 14,0 pS :t 0,1 (NaCI 150 mM). Sendo cátion seletivos e mais permeáveis ao KCI (PK+/PCI- = 9/1) do que ao NaCI (PN//PCI- = 4/1) e voltagem independentes entre -90 e +90 mV. O tempo médio de abertura desses canais foi londo (1,025 s :t 0,115 em 2,5 mM KCI) , compatível com os canais do P2X7R. Íon monovalente, como o NMDG+, de alto peso molecular inibiu drasticamente a condutância desses canais (12,4 pS para 4,7 pS). Cátions divalentes como o Mg2+ mostrou também inibir a condutância desses canais (17,8 pS para 12,1 pS). Um perfil semelhante foi observado quando o peptídeo ADSEG foi avaliado em patch-clamp, em células HEK 293, onde os canais apresentaram condutância de 9,9 pS (150 mM KCI). Nossos dados mostram, pela primeira vez, que o peptídeo ADSEG, configurado como uma folha beta, apresenta grande probabilidade de estar compondo estruturalmente o canal iônico dos P2X7Rs, podendo participar do filtro de seletividade do canal e compor parte da parede do canal formado pelo segmento M2. Além disso, coloca em dúvida o paradigma que o canal ou poro citolítico do P2X7R seria formado por estruturas em alfa-hélice.

Single-channel response of hamster oocytes to fertilization with homologous spermatozoa

Electrophysiological events occur early after fertilization, along with changes in intracellular Ca2+ concentration. Passive electrical parameters were determined in golden hamster oocytes by whole cell patch-clamp method. In separate experiments the effect of 4-aminopyridine on resting oocytes was tested. The single-channel patch clamp configuration was employed to assess the electrical response to fertilization with homologous sperm. Structure of oocytes submitted to patch clamp was evaluated with scanning electron microscopy and found to be preserved.Oocyte diameter was 70.2 ± 2.2 µm; their resting parameters were: membrane potential 23.8 ± 0.8 mV; total membrane specific resistance 519.1 ± 94.6 Ù.cm2, and specific capacity 0.99 ± 0.03 µF.cm-2. Total membrane current was decreased by 42 % by 4-aminopyridine.Control oocytes and oocytes exposed to sperm differed in their membrane currents in response to a voltage ramp clamping membrane potential from - 100 mV to + 100 mV. In both cases, currents were largest at the most negative potentials, but sperm-exposed oocytes had larger currents. Additionally, while in controloocytes the current was inward at negative potentials but outward at positive potentials, in the presence of spermatozoa oocytes was inward within the whole voltage range tested. This latter current may represent Ca2+ en try

Apical Maxi-chloride channel from human placenta: 12 years after the first electrophysiological recordings

The Maxi-chloride channel was the first ion channel described by electrophysiological methods in placenta. Because it is difficult to access a complex epithelium such as the placenta for electrophysiological procedures, the studies of ion channels from placental membranes have been performed only very recently. It was only in 1993 that a direct demonstration of a high-conductance chloride channel in apical membranes of intact trophoblastic epithelium was mentioned, and two years later, the description of this channel was reported from purified placental apical membranes reconstituted into artificial lipid membranes suitable for patch-clamp recordings. This brief review comments on the work done with regard to the electrophysiological characterization and regulation of the large-conductance or "Maxi" chloride channel and its contribution to the development of a cellular model for syncytiotrophoblast ion transport.

Altered calcium currents in cultured sensory neurons of normal and trisomy 16 mouse fetuses, an animal model for human trisomy 21 (Down Syndrome)

Down syndrome is determined by the presence of an extra copy of autosome 21 and is expressed by multiple abnormalities, with mental retardation being the most striking feature. The condition results in altered electrical membrane properties of fetal dorsal root ganglia (DRG) neurons, as in the trisomy 16 fetal mouse, an animal model of the human condition. Cultured trisomic DRG neurons from human and mouse fetuses present faster rates of depolarization and repolarization in the action potential compared to normal controls and a shorter spike duration. Also, trisomy 16 brain and spinal cord tissue exhibit reduced acetylcholine secretion. Therefore, we decided to study Ca2+ currents in cultured DRG neurons from trisomy 16 and age-matched control mice, using the whole-cell patch-clamp technique. Trisomic neurons exhibited a 62 percent reduction in Ca2+ current amplitude and reduced voltage dependence of current activation at -30 and -20 mV levels. Also, trisomic neurons showed slower activation kinetics for Ca2+ currents, with up to 80 percent increase in time constant values. Kinetics of the inactivation phase were similar in both conditions. The results indicate that murine trisomy 16 alter Ca2+ currents, which may contribute to impaired cell function, including neurotransmitter release. These abnormalities also may alter neural development.

Properties of voltage-gated Ca2+ currents measured from mouse pancreatic â-cells in situ

We used the single-microelectrode voltage-clamp technique to record ionic currents from pancreatic â-cells within intact mouse islets of Langerhans at 37C, the typical preparation for studies of glucose-induced "bursting" electrical activity. Cells were impaled with intracellular microelectrodes, and voltage pulses were applied in the presence of tetraethylammonium. Under these conditions, a voltage-dependent Ca2+ current (I Cav), containing L-type and non-L-type components, was observed. The current measured in situ was larger than that measured in single cells with whole-cell patch clamping, particularly at membrane potentials corresponding to the action potentials of â-cell electrical activity. The temperature dependence of I Cav was not sufficient to account for the difference in size of the currents recorded with the two methods. During prolonged pulses, the voltage-dependent Ca2+ current measured in situ displayed both rapid and slow components of inactivation. The rapid component was Ca2+-dependent and was inhibited by the membrane-permeable Ca2+ chelator, BAPTA-AM. The effect of BAPTA-AM on â-cell electrical activity then demonstrated that Ca2+-dependent inactivation of I Cav contributes to action potential repolarization and to control of burst frequency. Our results demonstrate the utility of voltage clamping â-cells in situ for determining the roles of ion channels in electrical activity and insulin secretion.

Single-channel recording of inositol trisphosphate receptor in the isolated nucleus of a muscle cell line

Nuclear calcium appears to have an important role in the regulation of gene expression in many cells, but the mechanisms involved in controlling nuclear Ca2+ signaling are controversial and still poorly understood. We have described the presence of inositol 1,4,5 trisphosphate (IP3) receptors in the nuclei of skeletal muscle cells. Now, we have characterized the properties of the IP3 receptors channels present in the nuclei of the 1B5 cell line, which do not express any isoforms of the ryanodine receptor. Immunocytochemistry of isolated nuclei confirmed the presence of IP3R in the nuclear envelope and fluorescence measurements in nuclei suspensions allowed us to document ATP-dependent calcium loading by the nucleus and its release upon IP3 addition. Patch clamp of nuclear membranes was performed, and single-channel activity recorded was dependent on the presence of IP3 in the pipette; single-channel conductance was in the range reported in the literature for these channels, and the open probability was shown to be dependent on IP3 concentration.

Electrophysiological evidence for the presence of NR2C subunits of N-methyl-D-aspartate receptors in rat neurons of the nucleus tractus solitarius

The nucleus tractus solitarius (NTS) plays an important role in the control of autonomic reflex functions. Glutamate, acting on N-methyl-D-aspartate (NMDA) and non-NMDA ionotropic receptors, is the major neurotransmitter in this nucleus, and the relative contribution of each receptor to signal transmission is unclear. We have examined NMDA excitatory postsynaptic currents (NMDA-EPSCs) in the subpostremal NTS using the whole cell patch clamp technique on a transverse brainstem slice preparation. The NMDA-EPSCs were evoked by stimulation of the solitary tract over a range of membrane potentials. The NMDA-EPSCs, isolated pharmacologically, presented the characteristic outward rectification and were completely blocked by 50 æM DL-2-amino-5-phosphonopentanoic acid. The I-V relationship of the NMDA response shows that current, with a mean (± SEM) amplitude of -41.2 ± 5.5 pA, is present even at a holding potential of -60 mV, suggesting that the NMDA receptors are weakly blocked by extracellular Mg2+ at near resting membrane potentials. This weak block can also be inferred from the value of 0.67 ± 0.17 for parameter delta obtained from a fit of the Woodhull equation to the I-V relationship. The maximal inward current measured on the I-V relationship was at -38.7 ± 4.2 mV. The decay phase of the NMDA currents was fitted with one exponential function with a decay time constant of 239 ± 51 and 418 ± 80 ms at a holding potential of -60 and +50 mV, respectively, which became slower with depolarization (e-fold per 145 mV). The biophysical properties of the NMDA receptors observed in the present study suggest that these receptors in the NTS contain NR2C subunits and may contribute to the synaptic signal integration.

Electrophysiological evidence for glial-subtype glutamate transporter functional expression in rat cerebellar granule neurons

A glutamate-sensitive inward current (Iglu) is described in rat cerebellar granule neurons and related to a glutamate transport mechanism. We examined the features of Iglu using the patch-clamp technique. In steady-state conditions the Iglu measured 8.14 ± 1.9 pA. Iglu was identified as a voltage-dependent inward current showing a strong rectification at positive potentials. L-Glutamate activated the inward current in a dose-dependent manner, with a half-maximal effect at about 18 æM and a maximum increase of 51.2 ± 4.4 percent. The inward current was blocked by the presence of dihydrokainate (0.5 mM), shown by others to readily block the GLT1 isoform. We thus speculate that Iglu could be attributed to the presence of a native glutamate transporter in cerebellar granule neurons

Aspectos farmacológicos e eletrofisiológicos da dessensibilizaçäo do íleo de cobaia à bradicinina / Pharmacological and electrophysiological aspects the desensibitization of the guinea pig ileum induced by bradykinin

O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos responsáveis dessensibilizaçao do íleo de cobaia estimulado pela bradicinina (BK), por meio do estudo dos efeitos desta cinina sobre a resposta contrátil isométrica de segmentos da camada longitudinal de íleo de cobaia (CLIC), do registro das correntes iônicas em fragmentos de membrana de miócitos recém dispersos da CLIC na configuraçao "cell-attached" da técnica de "patch clamp" e das medidas da concentraçao de cálcio intracelular ([Ca2+]i) em segmentos da CLIC carregadas com o indicador fluorescente fura-2. Dois aspectos foram focalizados: o primeiro, a dissipaçao do componente tônico da contraçao promovida pelo contato prolongado da CLIC com a BK; e o segundo, o estudo da sensibilidade do tecido à BK, pela determinaçao dos parâmetros farmacológicos obtidos das curvas concentraçoes-resposta aos estimulantes (pD2 e Emáx), antes e depois da CLIC ser dessensibilizada pela concentraçao máxima de BK (dessensibilizaçao homóloga) ou de outros agonistas, tanto peptídicos (lisina2-angiotensina II, angiotensina II e substância P) quanto nao peptídicos (acetilcolina e histamina) (dessensibilizaçao heteróloga). A importância das diferentes vias de sinalizaçao associadas ao receptor 132 para os dois aspectos acima referidos foi avaliada pela açao de vários agentes farmacológicos: inibidores da PKC (bisindolilmaleimida, calfostin C e queleritrine), inibidor da cicloxigenase (indometacina), inibidor da PLA2 (decadron), inibidor da tirosina cinase (genisteína), inibidor da NO sintase (L-NNA), inibidor das Ca 2+-ATPases do retículo sarcoplasmático (tapsigargina), ativador da adenilil ciclase (forskolina); bloqueadores de canais de K+: iberiotoxina (IbTx), 4-aminopiridina (4 AP), apamina e BaC12; e por despolarizaçao direta pelo aumento de [K+]el A dissipaçao do componente tônico por contato prolongado com a BK foi um fenômeno que se instalou ao redor del 5 min, independentemente da concentraçao de BK utilizada para disparar o processo. Essa queda da resposta nao foi conseqüência da degradaçao da BK pela presença de cininases no tecido, de alteraçoes das vias de sinalizaçao classicamente associadas com a ativaçao do receptor 132, ou de alteraçoes da atividade das Ca2+-ATPases do i retículo sarcoplasmático, mas é sensível ao potencial de membrana, uma vez que foi bloqueada pela IbTx 87 nM e por despolarizaçao induzida...(au)

Correntes iônicas, induzidas por ATP, em células de Leydig / Ionic currents induced by ATP in Leydig cells

As células de Leydig produzem e secretam testosterona, num processo controlado pelo Hormônio Luteinizante (LH) e modulado através de diversos fatores. O trifosfato de adenosina (ATP), no meio extracelular, tem se constituído num novo modulador do processo, atuando via ativação de receptores purinérgicos. Neste trabalho, a técnica de "patch-clamp" foi utilizada para detectar e caracterizar as correntes iônicas, induzidas pela ativação desses receptores, em células de Leydig, isoladas a fresco, de testículos de camundongos. A adição de ATP ao banho levou ao surgimento de uma corrente orientada para dentro, em potenciais hiperpolarizantes. A amplitude da corrente é dependente da dose de ATP, para cada nível de potencial aplicado à célula, e apresenta dessensibilização para doses acima de 60 μM. A relação corrente-voltagem é fortemente retificada na direção de potenciais hiperpolarizantes e apresenta um potencial de reversão próximo de zero mV, indicando uma via de baixa seletividade a cátions. Esses resultados vêm confirmar a presença de receptores purinérgicos em células de Leydig, muito provavelmente pertencentes à família P2X

Bloqueo del ion bario sobre una coriente de potasio rectificadora entrante en ovocitos de rana xenopus laevis / Blockade of barium ions on inward rectifier potassium current study in frog's oocytes

Se caracterizó el efecto del ion bario (Ba²+) sobre un canal de potasio rectificador entrante endógeno (IRK-endo) de ovocitos de Xenopus laevis con la técnica de fijación de voltaje con 2 microelectrodos. Al modificar la [K+] o se provocó un cambio en el potencial de inversión y en el valor de la pendiente de la recta, tal y como se espera para una corriente predominantemente de K+. El bloqueo de IRK-endo por el Ba²+ externo presentó una baja afinidad del canal de dos formas diferentes. Una fue un bloqueo en el pico de corriente independiente de voltaje con una Kd de 0.9 ñ 0.1 mM. En contraste, un segundo efecto se observó al final del pulso (80 ms). Este bloqueo en la corriente es dependiente tanto de tiempo como de voltaje, con una Kd que muestra una dependencia de voltaje monoexponencial (t = 50 ñ 5 mV). Estos resultados sugieren la presencia de dos sitios de unión diferentes para el Ba²+; uno en la parte externa del canal y otro situado dentro del canal Nuestros resultados demuestran la existencia de canal. Nuestros resultados demuestran la existencia de una corriente endógena de K+ en ovocitos de Xenopus laevis con características semejantes a otras corrientes rectificadoras entrantes de K+ encontradas en otras especies

Patch-clamp detection of macromolecular translation along nuclear pores

The present paper reviews the application of patch-clamp principles to the detection and measurement of macromolecular translocation along the nuclear pores. We demonstrate that the tight-seal `gigaseal' between the pipette tip and the nuclear membrane is possible in the presence of fully operational nuclear pores. We show that the ability to form a gigaseal in nucleus-attached configurations does not mean that only the activity of channels from the outer membrane of the nuclear envelope can be detected. Instead, we show that, in the presence of fully operational nuclear pores, it is likely that the large-conductance ion channel activity recorded derives from the nuclear pores. We conclude the technical section with the suggestion that the best way to demonstrate that the nuclear pores are responsible for ion channel activity is by showing with fluorescence microscopy the nuclear translocation of ions and small molecules and the exclusion of the same from the cisterna enclosed by the two membranes of the envelope. Since transcription factors and mRNAs, two major groups of nuclear macromolecules, use nuclear pores to enter and exit the nucleus and play essential roles in the control of gene activity and expression, this review should be useful to cell and molecular biologists interested in understanding how patch-clamp can be used to quantitate the translocation of such macromolecules into and out of the nucleus.