Novel Pathogenic Mutation Mapping of ASPM Gene in Consanguineous Pakistani Families with Primary Microcephaly / Novo mapeamento de mutações patogênicas do gene ASPM em famílias consanguíneas com microcefalia primária do Paquistão

Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a neurodevelopmental disorder characterized by a congenitally reduced head circumference (-3 to -5 SD) and non-progressive intellectual disability. The objective of the study was to evaluate pathogenic mutations in the ASPM gene to understand etiology and molecular mechanism of primary microcephaly. Blood samples were collected from various families across different remote areas of Pakistan from February 2017 to May 2019 who were identified to be affected with primary microcephaly. DNA extraction was performed using the salting-out method; the quality and quantity of DNA were evaluated using spectrophotometry and 1% agarose gel electrophoresis, respectively in University of the Punjab. Mutation analysis was performed by whole exome sequencing from the Cologne Center for Genomics, University of Cologne. Sanger sequencing was done in University of the Punjab to confirm the pathogenic nature of mutation. A novel 4-bp deletion mutation c.3877_3880delGAGA was detected in exon 17 of the ASPM gene in two primary microcephaly affected families (A and B), which resulted in a frame shift mutation in the gene followed by truncated protein synthesis (p.Glu1293Lysfs*10), as well as the loss of the calmodulin-binding IQ domain and the Armadillo-like domain in the ASPM protein. Using the in-silico tools Mutation Taster, PROVEAN, and PolyPhen, the pathogenic effect of this novel mutation was tested; it was predicted to be "disease causing", with high pathogenicity scores. One previously reported mutation in exon 24 (c.9730C>T) of the ASPM gene resulting in protein truncation (p.Arg3244*) was also observed in family C. Mutations in the ASPM gene are the most common cause of MCPH in most cases. Therefore, enrolling additional affected families from remote areas of Pakistan would help in identifying or mapping novel mutations in the ASPM gene of primary microcephaly.

Microcefalia primária autossômica recessiva (MCPH) é um distúrbio do neurodesenvolvimento caracterizado por uma redução congênita do perímetro cefálico (-3 a -5 DP) e deficiência intelectual não progressiva. O objetivo do estudo foi avaliar mutações patogênicas no gene ASPM a fim de compreender a etiologia e o mecanismo molecular da microcefalia primária. Amostras de sangue foram coletadas de várias famílias em diferentes áreas remotas do Paquistão de fevereiro de 2017 a maio de 2019, que foram identificadas como afetadas com microcefalia primária. A extração do DNA foi realizada pelo método salting-out; a qualidade e a quantidade de DNA foram avaliadas por espectrofotometria e eletroforese em gel de agarose a 1%, respectivamente, na Universidade de Punjab. A análise de mutação foi realizada por sequenciamento completo do exoma do Cologne Center for Genomics, University of Cologne. O sequenciamento de Sanger foi feito na Universidade do Punjab para confirmar a natureza patogênica da mutação. Uma nova mutação de deleção de 4 bp c.3877_3880delGAGA foi detectada no exon 17 do gene ASPM em duas famílias afetadas por microcefalia primária (A e B), que resultou em uma mutação de frame shift no gene seguida por síntese de proteína truncada (pGlu1293Lysfs * 10), bem como a perda do domínio IQ de ligação à calmodulina e o domínio do tipo Armadillo na proteína ASPM. Usando as ferramentas in-silico Mutation Taster, PROVEAN e PolyPhen, o efeito patogênico dessa nova mutação foi testado; foi previsto ser "causador de doenças", com altos escores de patogenicidade. Uma mutação relatada anteriormente no exon 24 (c.9730C > T) do gene ASPM, resultando em truncamento de proteína (p.Arg3244 *) também foi observada na família C. Mutações no gene ASPM são a causa mais comum de MCPH na maioria dos casos . Portanto, a inscrição de famílias afetadas adicionais de áreas remotas do Paquistão ajudaria a identificar ou mapear novas mutações no gene ASPM da microcefalia primária.

O Uso do Sequenciamento Total do Exoma no Diagnóstico do Adenocarcinoma Ductal Pancreático / Using Whole Exome Sequencing on Diagnosis of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma / El uso de la Secuenciación del Exoma Total en el Diagnóstico del Adenocarcinoma Ductal Pancreático

Introdução: O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é uma doença agressiva responsável no Brasil por 2% das neoplasias e 5% das mortes por câncer. A análise do exoma ­ parte do DNA que codifica as proteínas ­ permite identificar as variantes somáticas do tumor e as germinativas do paciente. Essa informação é necessária para implementar a terapia-alvo para o PDAC, pois fornece evidência para selecionar, ou excluir, tratamentos para a doença. Objetivo: Identificar as variantes de interesse clínico e farmacológico presentes no PDAC de quatro pacientes, por meio da técnica de sequenciamento total do exoma(WES). Método: Foram utilizados dados públicos de quatro amostras de pares tumor-normal de PDAC, localizados na cabeça do pâncreas de pacientes caucasianos, estádio T3N1M0, sequenciadas e publicizadas pelo Texas Cancer Research Biobank. Para identificar as variações somáticas e germinativas, utilizou-se o software GATK. As consequências clínicas e farmacológicas dessas variações foram anotadas por meio do software VEP e analisadas mediante o softwareestatístico R. Resultados: Dos quatro tumores, um possui variante estrutural com duplicação do gene AKT2; outro, variantes nos genes da via das ciclinas CDK14 e CDKN2C, o que altera o regime quimioterápico; na linhagem germinativa, um paciente tem variantes no gene XRCC1, que sugere aumento da resposta à platina. Conclusão: Embora a patologia classifique todos os tumores como PDAC, cada paciente ­ bem como o respectivo tumor ­ apresenta especificidades que afetam o diagnóstico e as possibilidades terapêuticas. O WES permite identificá-las a um custo baixo, o que amplia as possibilidades de tratamento do PDAC.

ntroduction: The prevalence of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) in Brazil is around two percent of all neoplasms. It is an aggressive disease responsible for five percent of all deaths by cancer. The analysis of exome ­ part of the DNA encoding the proteins ­ allows the identification of tumor-specific variants and the patient polymorphism. This information is necessary to implement target therapy for PDAC, as it provides evidence to select, or exclude, PDAC treatments. Objective: Identify the somatic and germinative variants of clinical and pharmacological interest in the PDAC for four patients through the whole-exome sequencing technique (WES). Method: Public sequencing exome data published by Texas Cancer Research Biobank were utilized, from four tumor-normal samples pair of PDAC located in the pancreas head of Caucasian patients, T3N1M0 stage. To identify somatic and germinative variations, the GATK software was adopted. Furthermore, these variants were noted with their clinical and pharmacological information through the VEP software and its consequences were analyzed through the statistical software R. Results: Of the four tumors, one has a structural variant with duplication of the AKT2 gene; another, changes in the pathway of cyclins CDK14 and CDKN2C. Both findings alter the chemotherapy regimen; in the germline, one patient has variants in the XRCC1 gene, which suggests increased response to platinum. Conclusion: Although the pathology classifies all tumours as PDAC, each patient ­ as well as their respective tumor ­ shows specificities that affect the diagnosis and therapeutic possibilities. WES allows to identify them at a low cost, expanding the treatment possibilities of PDAC.

Introducción: El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad agresiva que causa en Brasil 5% de las muertes por cáncer. El análisis del exoma ­ parte del ADN que codifica las proteínas ­ permite la identificación de mutaciones específicas del tumor, así como los polimorfismos del paciente. Esta información es necesaria para implementar la terapia dirigida para PDAC. Objetivo: Identificar las variaciones de interés clínico y farmacológico presentes en el PDAC de cuatro pacientes, mediante la técnica secuenciación del exoma completo (WES). Método: Se utilizaron datos públicos de cuatro muestras de pares de tumores normales (T-N) de PDAC, localizados en la cabeza del páncreas de pacientes caucásicos, estadio T3N1M0, secuenciadas y publicadas por Texas Cancer Research Biobank. Para identificar las variaciones somáticas y germinativas, se utilizó el softwareGATK. Se observaron las consecuencias clínicas y farmacológicas de estas variaciones a través del software VEP. Y analizadas sus consecuencias a través del software estadístico R. Resultados: De los cuatro tumores, uno tiene una variante estructural con duplicación del gen AKT2; otro, cambios en la vía de las ciclinas CDK14 y CDKN2C, que altera el régimen de quimioterapia; en el linaje germinal, un paciente tiene variantes en el gen XRCC1, lo que sugiere una mayor respuesta al platino. Conclusión: Aunque la patología clasifica todos los tumores como PDAC, cada paciente ­ así como el tumor respectivo ­ presenta especificidades que afectan el diagnóstico y las posibilidades terapéuticas. WES le permite identificarlos a un bajo costo, lo que amplía las posibilidades de tratamiento de PDAC

Caracterização fenotípica das epilepsias geneticamente determinadas diagnosticadas pelo sequenciamento de nova geração / Phenotypic characterization of genetically determined epilepsies diagnosed by next-generation sequencing

Nos últimos anos, o emprego na prática clínica de painéis genéticos e do sequenciamento do exoma e do genoma permitiu o diagnóstico em pacientes sem uma etiologia definida, principalmente nas Encefalopatias Epilépticas e do Desenvolvimento (EEDs). A identificação das formas de epilepsia geneticamente determinadas permite caracterizar melhor sua história natural e orientar o tratamento, ao mesmo tempo em que propicia o aconselhamento genético. O objetivo do estudo foi descrever o fenótipo de indivíduos com epilepsia geneticamente determinada com variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas, previamente identificadas pelo NGS. Foram incluídos pacientes até a idade de 18 anos, acompanhados por serviços de Neurologia Infantil e/ou de Genética Médica no estado do Rio de Janeiro, provenientes de hospitais públicos ou de clínicas privadas. O estudo, de natureza descritiva e transversal, foi realizado através da análise de uma amostra de conveniência. No período de abril de 2020 até dezembro de 2021, foram incluídos 75 pacientes, cujo diagnóstico etiológico foi relacionado a 53 genes diferentes. O tipo de sequenciamento de nova geração realizado foi exoma em 56 (74,6%) pacientes, painel genético em 18 (24%) e genoma em um (1,7%). Em relação ao padrão de herança dos 53 genes, 50 (67%) pacientes apresentavam variantes deletérias em genes de herança autossômica dominante (AD), dez (13%) em genes com herança autossômica recessiva (AR), 12 (16%) em genes com o padrão dominante ligado ao X (XD) e 3 (4%) em genes com herança recessiva ligada ao X (XR). O teste em trio foi realizado em 37 pacientes (49,3%) e 33 pacientes apresentaram variantes de novo. O tipo de variante mais frequente foi a missense, seguida pelas variantes frameshift, variantes em regiões de sítio de splicing, deleções in-frame e variantes nonsense. A média de idade do diagnóstico da epilepsia foi de 18 meses, variando entre o primeiro dia de vida até 12 anos. Diagnóstico de EED foi estabelecido em 97,3% pacientes (N=73), na média de idade de 3 anos e 1 mês, e 36 pacientes apresentam uma síndrome epiléptica específica, sendo as mais comuns as Síndromes de West e de Lennox-Gastaut. O padrão de herança de maior frequência no grupo estudado foi AD. Os genes mais frequentes encontrados na nossa amostra foram: genes com herança AD: SCN8A (8%), STXBP1 (8%), KCNQ2 (6,6%), KCNT1 (4%); ligada ao XD: CDKL5 (4%); PCDH19 (4%); e AR: RARS2 (2,6%). O maior número de pacientes está associado a genes que sintetizam canais iônicos voltagem-dependentes (N=19/25,3%) e os genes mais frequentes foram, sucessivamente: SCN8A, KCNQ2, KCNT1, KCNA2. Na nossa amostra, somente dois pacientes conseguiram realizar o exame pelo SUS. O tempo médio de espera para realização do NGS foi de 8 meses. O conhecimento e a interpretação dos resultados dos testes genéticos moleculares têm evoluído de maneira substancial. Disponibilizar o NGS de forma universal para pacientes com suspeita de epilepsia de origem genética, permitirá o diagnóstico de um maior número de pacientes, a identificação de casos atípicos e a adequação terapêutica.

In recent years, the use in clinical practice of genetic panels, exome and genome sequencing has allowed the diagnosis in patients without a defined etiology, mainly in epileptic and developmental encephalopathies (EED). The identification of genetically determined forms of epilepsy makes it possible to better characterize its natural history, guide treatment and provide genetic counseling. The aim of the study was to describe the phenotype of individuals with genetically determined epilepsy with pathogenic or probably pathogenic variants, previously identified by NGS. Patients up to the age of 18 years, followed by Child Neurology and/or Medical Genetics services in the State of Rio de Janeiro, from Public Hospitals or private clinics were included. The study was descriptive and transversal, through the analysis of a convenience sample. From April 2020 to December 2021, 75 patients were included, whose etiological diagnosis was related to 53 different genes. The type of next-generation sequencing performed was exome in 56 (74.6%) patients, genetic panel in 18 (24%) and 1 (1.7%) performed the genome. Regarding the inheritance pattern of the 53 genes, 50 (67%) patients had deleterious variants in genes of autosomal dominant inheritance (AD), 10 (13%) in genes with autosomal recessive inheritance (AR), 12 (16%) with dominant pattern X-linked (XD) and 3 (4%) with X-linked recessive inheritance (XR). Trio testing was performed in 37 patients (49.3%) and 33 patients have de novo variants. The most frequent type of variant was missense, followed by frameshift variants, variants in splicing site regions, in- frame and nonsense variants. The mean age of epilepsy diagnosis was 18 months, ranging from the first day of life to 12 years. Diagnosis of DEE was established in 97.3% patients (N=73), with a mean age of 3 years and 1 month and 36 patients presented a specific epileptic syndrome, the most common being West syndrome and Lennox- Gastaut. The most frequent inheritance pattern in the studied group was AD. The most frequent genes found in our sample were: genes with AD inheritance: SCN8A (8%), STXBP1 (8%), KCNQ2 (6.6%), KCNT1 (4%); XD-linked: CDKL5 (4%); PCDH19 (4%); and AR: RARS2 (2.6%). The largest number of patients is associated with genes that synthesize voltage-gated ion channels (N=19/25.3%) and the most frequent genes were successively: SCN8A, KCNQ2, KCNT1, KCNA2. In our sample, only 2 patients were able to perform the exam through the SUS. The mean waiting time for performing the NGS was 8 months. Knowledge and interpretation of molecular genetic test results have evolved substantially. Making NGS universally available in patients suspected of having epilepsy of genetic origin, will allow the diagnosis of a greater number of patients, identification of atypical cases and therapeutic adequacy.

Estudios genéticos y neurodesarrollo: De la utilidad al modelo genético / Genetic studies and neurodevelopment. From effectiveness to genetic models]

Los avances en la genética han podido apoyar la sospecha que aportaba la experiencia clínica sobre el gran componente hereditario de la mayor parte de estos trastornos del neurodesarrollo (TND). Los estudios iniciales de heredabilidad, ligamiento o asociación evidenciaron desde los inicios la gran contribución de la variación genotípica a la clínica en general, y a los TND en particular. No debe obviarse la utilidad de los estudios genéticos en el ejercicio clínico, encaminados al diagnóstico etiológico. La mayor parte de los mismos están protocolizados en el estudio de trastornos como la discapacidad intelectual y el autismo; dentro de éstos, la hibridación por arrays cromosómicos ha aportado una mayor rentabilidad diagnóstica respecto a técnicas citogenéticas históricas (3 vs. 10% respectivamente). Sin embargo, la irrupción y rentabilidad de técnicas de genética molecular por secuenciación, particularmente la exómica y genómica en trío, analizando a padres, (tasas diagnósticas del 30-50%), están condicionando la modificación de los algoritmos genéticos en el diagnóstico de trastornos graves del neurodesarrollo. El mayor conocimiento de variantes causales de discapacidad intelectual y autismo está igualmente modificando los modelos teóricos poligénicos establecidos hasta la fecha.

Advances in genetics have been able to support the clinical suspicion on the large hereditary component of most of these neurodevelopmental disorders (NDD). Initial studies on heritability, linkage or association showed from the beginning the great contribution of genotypic variation to the clinic in general, and to NDD in particular. The effectiveness of genetic studies in clinical practice, targeted to aetiological diagnosis, should not be ignored. Most of these are protocolized in the study of disorders such as intellectual disability and autism; within these, the array comparative genomic hybridization have supported a greater diagnostic effectiveness with respect to historical cytogenetic techniques (3 vs. 10% respectively). However, the irruption and success of molecular genetic sequencing techniques, particularly the exome and genome in trio, analyzing the parents (diagnostic rates of 30-50%), are conditioning the modification of the genetic algorithms in the diagnosis of different NDD. The greater knowledge of causal variants in intellectual disability and autism is also modifying the polygenic theoretical models established to date.

Whole-exome sequencing in familial keratoconus: the challenges of a genetically complex disorder / Sequenciamento do exoma no ceratocone familiar: os desafios de uma doença genética complexa

ABSTRACT Purpose: The underlying genetic causes of keratoconus are essentially unknown. Here, we conducted whole-exome sequencing in 2 Brazilian families with keratoconus. Methods: Whole-exome sequencing was performed on 6 keratoconus-affected individuals of 2 unrelated pedigrees from Southern Brazil. Pathogenic variants were identified in a modified Trio analysis (1 parent and 2 children) using candidate gene filtering. All the affected subjects underwent detailed corneal tomographic evaluation. Clinically relevant variants that were present in affected individuals at minor allele frequencies <1% were examined in the 1000 Genomes Project single nucleotide polymorphism ABraOM and transcription gene (RefSeq and Ensembl) databases. Results: In family 1, a sequence variant in chromosome 1 (q21.3) was observed within the filaggrin gene. All the tested family members shared a heterozygous missense pathogenic variant in the c.4678C>T position. In family 2, exome analysis demonstrated a sequence variant in chromosome 16 (q24.2) within the gene encoding zinc finger protein 469 (ZNF469). Members of family 2 shared a heterozygous missense variant in the c.1489G>A position. In addition, the exomes of the 2 families were examined for shared genetic variants among all affected individuals. Filtering criteria did not identify any rare sequence variants in a single gene segregated in both families. Conclusion: Our findings show that a complete genotype-phenotype correlation could not be identified, suggesting that keratoconus is a genetically heterogeneous disease. In addition, we believe that whole-exome sequencing-based segregation analysis is probably not the best strategy for identifying variants in families with isolated keratoconus.

RESUMO Objetivos: As causas genéticas subjacentes do ceratocone são essencialmente desconhecidas. Aqui, realizamos o sequenciamento de todo exoma de duas famílias brasileiras com ceratocone. Métodos: O sequenciamento total do exoma foi realizado em 6 indivíduos com ceratocone de duas famílias distintas do sul do Brasil. Variantes patogênicas foram identificadas em uma análise no formato de trio-modificada (um dos pais e dois filhos) usando a filtragem de genes candidatos. Todos os indivíduos afetados passaram por avaliação de tomografia de córnea. Variantes clinicamente relevantes que estavam presentes em indivíduos afetados em menores frequências alélicas <1% foram avaliadas na base de dados de polimorfismo de nucleotídeo único do 1000 Genomes Project ABraOM e do gene de transcrição (RefSeq e Ensembl). Resultados: Na família 1, uma variante de sequência no cromossomo 1 (q21.3) foi observada dentro do gene da filagrina. Todos os membros dessa família compartilhavam uma mutação missense na posição c.4678C>T. Na família 2, a análise do exoma demonstrou uma variante alélica no cromossomo 16 (q24.2) dentro do gene que codifica a proteína de dedo de zinco 469 (ZNF469). Os membros dessa família compartilham uma mutação missense heterozigota na posição c.1489G>A. Além disso, os exomas das duas famílias foram avaliados para variantes genéticas compartilhadas entre todos os indivíduos afetados. Os critérios de filtragem não identificaram variantes de sequência rara em um único gene segregado em ambas as famílias. Conclusão: Nossos achados indicam que uma completa correlação genótipo-fenótipo não pode ser identificada, sugerindo que o ceratocone é uma doença geneticamente heterogênea. Além disso, acreditamos que análises de segregação baseadas no sequenciamento de todo exoma provavelmente não é a melhor estratégia para identificar variantes em famílias isoladas com ceratocone.

Estudo genômico do tumor embrionário hepatoblastoma / Genomic study of the embryonal tumor hepatoblastoma

O hepatoblastoma, câncer de fígado mais comum na infância, é um tumor embrionário que se supõe surgir da interrupção da diferenciação hepática durante a embriogênese. O genoma deste tipo tumoral carrega poucas alterações somáticas, principalmente aneuploidias cromossômicas e mutações em CTNNB1. Essa relativa escassez de mutações somáticas representa um desafio à estratificação de risco dos pacientes e ao desenvolvimento de terapias direcionadas. Neste trabalho, investigamos por sequenciamento de exoma o espectro de mutações somáticas em um grupo de 10 hepatoblastomas, pareados com suas respectivas amostras germinativas, incluindo um caso de tumor congênito. Os dados genômicos revelaram que os hepatoblastomas tem número reduzido de mutações somáticas codificadoras não-sinônimas (média de ~6 variantes/tumor, com exclusão do caso congênito), totalizando 94 mutações (92 diferentes) nos 10 tumores, mapeadas em 87 genes. Apenas três genes apresentaram mutações detectadas em mais de uma amostra, CTNNB1, CX3CL1 e CEP164. As mutações foram validadas pelo sequenciamento de um painel composto pelos genes identificados no exoma, também utilizado para investigar estes genes em um grupo adicional de 12 tumores; apenas mutações em CTNNB1 foram detectadas neste grupo adicional. Mutações somáticas em CTNNB1 foram detectadas em ~54% do grupo estudado (22 hepatoblastomas): sete variantes patogênicas do tipo nucleotídeo único (SNV) ou indel foram identificadas em oito hepatoblastomas (~36%), uma delas nunca previamente descrita (A21_S33del); deleções intragênicas foram detectadas por sequenciamento Sanger em quatro outros tumores (~18%). A proteína ß-catenina foi avaliada por imunohistoquímica, apresentando translocação para o núcleo, o que indica ativação da via WNT; esse resultado também foi observado em tumores nos quais mutações em CTNNB1 não foram detectadas. O principal achado do estudo do exoma de hepatoblastomas foi a identificação de uma mutação somática recorrente no éxon 3 do gene CX3CL1 (A235G), observada em dois diferentes tumores. A análise de expressão gênica e proteica de CX3CL1 e de seu receptor CX3CR1 revelou aumento de expressão de CX3CL1 em hepatoblastomas; este resultado foi replicado em duas coortes independentes. O detalhamento da análise evidenciou um padrão bimodal: (a) linfócitos infiltrados em regiões tumorais de inflamação pós-quimioterapia eram negativos para essas proteínas, que deveriam estar expressas neste tipo celular em condições normais, enquanto as células tumorais as expressavam; (b) nas áreas de necrose tumoral pós-quimioterapia, houve detecção das proteínas CX3CL1/CX3CR1 nos linfócitos, mas não nas células tumorais. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação da via CX3CL1/CX3CR1 ocorre em parte dos hepatoblastomas, independentemente da detecção de mutações, o que parece ser um achado relevante, potencialmente relacionado a inflamação e/ou resistência à quimioterapia. Adicionalmente, três assinaturas mutacionais foram detectadas nos hepatoblastomas, duas delas com predomínio das assinaturas do COSMIC, HB-S1 (COSMIC 1 e 6, presentes em todos os tipos de câncer) e HB-S2, com similaridades à assinatura COSMIC 29, relacionada apenas a carcinoma oral de células escamosas (gengivo-bucal) associado ao hábito de mascar tabaco; uma nova assinatura mutacional foi observada em um subconjunto de hepatoblastomas (HB-S3), com padrão inespecífico de pequeno aumento de mutações C>A. As assinaturas mutacionais já relatadas para câncer de fígado não foram evidentes nestes hepatoblastomas, sugerindo um processo mutacional diferente em sua origem. Por fim, análise de mutações germinativas no caso de hepatoblastoma congênito levou à identificação de variantes germinativas em genes de predisposição a câncer (BRCA1 e FAH), levantando a questão do papel da predisposição genética no desenvolvimento destes tumores embrionários (AU)

Hepatoblastoma, the most common liver cancer in infancy, is an embryonal tumor supposed to arise from differentiation impairment during embryogenesis. Hepatoblastomas genomes carry few somatic changes, mainly chromosomal aneuploidies and mutations in the CTNNB1 gene. This relative paucity of somatic mutations poses a challenge to risk stratification and development of targeted therapies. In this work, we investigated the burden of somatic mutations in a cohort of 10 hepatoblastomas paired with their respective germline samples, including a case of congenital tumor. Data revealed a low number of non-synonymous somatic coding mutations (mean of ~6 variants/tumor), totalizing 94 mutations in the 10 tumors, mapped in 87 genes; only three genes exhibited mutations detected in more than one sample, CTNNB1, CX3CL1 and CEP164. Target sequencing was used for validation and screening of the mutated genes in an additional group of 12 tumors; only CTNNB1 mutations were detected in this additional group. CTNNB1 mutations were detected in ~54% of the cohort (22 hepatoblastomas): seven single nucleotide variant or indel mutations were identified in eight hepatoblastomas (~36%), including the A21_S33del mutation, not previously reported; intragenic deletions were detected by Sanger sequencing in 4 tumors (~18%). The ß-catenin protein was evaluated by immunohistochemistry, presenting translocation to the nucleus, indicating activation of the WNT pathway; this result was also observed in tumors without CTNNB1 mutations. The main finding of the exome study was the identification of a recurrent somatic mutation in the exon 3 of the CX3CL1 gene (A235G) in two different hepatoblastomas. Gene expression and protein analysis of CX3CL1 and its receptor CX3CR1 revealed increased expression of CX3CL1 in hepatoblastomas, a result that was replicated in two independent cohorts. A bimodal pattern of expression was observed: (a) lymphocytes infiltrated in tumor regions of inflammation post-chemotherapy were negative for these proteins, which should be expressed in this cell type under normal conditions, while the tumor cells expressed them; (b) in areas of tumor necrosis after chemotherapy, CX3CL1/CX3CR1 proteins were detected in lymphocytes, but not in tumor cells. Taken together, these results suggest that activation of the CX3CL1/CX3CR1 pathway occurs in part of the hepatoblastomas, regardless of mutation detection, potentially related to inflammation and/or resistance to chemotherapy. Additionally, three mutational signatures were detected, two of them with a predominance of signatures of COSMIC, HB-S1 (COSMIC 1 and 6, present in all types of cancer) and HB-S2 (COSMIC 29 signature, related only to oral cell carcinoma gingival-buccal associated with the habit of chewing tobacco). A new mutational signature was observed in a subset of hepatoblastomas (HB-S3), with a non-specific pattern of small increase in C>A mutations. Mutational signatures already reported for liver cancer were not evident in these hepatoblastomas, suggesting a different mutational process. Finally, an exploration of germline mutations in the congenital hepatoblastoma led to the identification of variants in genes of cancer predisposition (BRCA1 and FAH), raising the question of the role of genetic predisposition in the development of these embryonal tumors (AU)

Avaliação do perfil de mutações somáticas em uma coorte de pacientes com adenocarcinoma gástrico / Tumor molecular profiling in a Brazilian cohort of gastric adenocarcinoma patients

INTRODUÇÃO: O adenocarcinoma gástrico (AdG) é responsável por 5,7% de todos os casos novos e por 8,2% das mortes relacionadas a câncer no mundo. A literatura sobre AdG tem enriquecido com a publicação de amplas análises moleculares nos últimos anos, mas boa parte delas carece de dados de sobrevida e do impacto prognóstico das alterações descritas OBJETIVOS: 1) Descrever o perfil mutacional e avaliar o impacto prognóstico das mutações mais relevantes de AdGs em uma coorte de 112 pacientes tratados no A.C. Camargo Cancer Center; 2) Determinar a ancestralidade genômica e seu impacto prognóstico nesta coorte; 3) Investigar o impacto da carga mutacional global do tumor sobre o prognóstico; 4) Buscar novos marcadores moleculares prognósticos através do sequenciamento comparativo do exoma tumoral completo de 24 pacientes da mesma coorte. MÉTODOS: Este é um estudo longitudinal, retrospectivo, com amostragem não-aleatória e consecutiva de 112 pacientes com AdG, independente de estádio clínico, com amostras disponíveis no biobanco institucional e diagnóstico entre 2007 e 2013. O DNA tumoral foi sequenciado com um painel de captura incluindo 99 genes e 24 amostras também tiveram o exoma tumoral completo sequenciado. Utilizamos um pool de 1600 marcadores informativos de ancestralidade para determinar a ancestralidade genômica dos casos. RESULTADOS: Os dez genes mais frequentemente mutados em nossa coorte foram TP53 (30%), LAMA1 (21%), ARID1A (19%), CIC (19%), FAT4 (17%), PKHD1 (16%), KMT2C (15%), MACF1 (15%), PKHDL1 (15%) e BRCA2 (14%). Demonstramos que em uma população etnicamente miscigenada como a brasileira, a ancestralidade genômica asiática per se não representa um fator prognóstico independente e levantamos a hipótese de que em nossa população, a ancestralidade predominante africana talvez esteja associada a um prognóstico adverso. Identificamos a presença de mutações em RHOA como um possível fator associado a prognóstico favorável, dado que ainda carece de validação. Demonstramos que FAT4, ARID1A e BRCA2 são genes frequentemente mutados em nossa coorte e, ao contrário de relatos prévios, não estiveram associados ao prognóstico de pacientes com AdG

INTRODUCTION: Gastric adenocarcinoma (AdG) accounts for 5.7% of all tumors and 8.2% of cancer related deaths worldwide. Comprehensive reports have recently contributed to the molecular characterization of AdG, but most of them have not investigated the possible prognostic impact of the described mutations. OBJECTIVES: 1) To identify molecular alterations and to assess the prognostic impact of the most relevant mutations found in a cohort of 112 AdG patients treated at A.C. Camargo Cancer Center; 2) To determine the genomic ancestry, for the same cohort, and it's prognostic impact; 3) To assess the global tumor mutational burden and it's prognostic impact 4) To screen potential new prognostic molecular alterations through whole exome sequencing (WES) of tumors from 24 patients. METHODS: This is a retrospective longitudinal analysis that recruited 112 AdG patients, all stages, diagnosed between 2007 and 2013, with available tissue at the A.C. Camargo Cancer Center biobank. DNA extracted from tumor samples was sequenced by a targeted gene panel including 99 genes. Twenty-four tumors were also assessed by WES. We used a pool of 1600 ancestry informative markers to infer each individual genomic ancestry. RESULTS: The top 10 mutated genes in our cohort were: TP53 (30%), LAMA1 (21%), ARID1A (19%), CIC (19%), FAT4 (17%), PKHD1 (16%), KMT2C (15%), MACF1 (15%), PKHDL1 (15%) e BRCA2 (14%). Different from other studies, Asian ancestry was not an independent prognostic factor in our ethnically highly-admixed population, but we found worse prognosis in African ancestry. Mutations in RHOA were associated with good prognosis in this cohort, and we also demonstrated that, besides being common among Brazilian AdG patients, mutations in FAT4, ARID1A and BRCA2 had no prognostic impact

Autopsia molecular en muerte súbita cardíaca neonatal mediante secuenciación de siguiente generación (NGS): presentación de un caso / Molecular autopsy in neonatal sudden cardiac death by next generation sequencing (NGS): presentation of a case

Presentamos un caso de muerte súbita de una lactante de tres meses de edad. La autopsia reveló una miocardiopatía hipertrófica y la muestra de sangre del cordón umbilical almacenada fue utilizada para análisis molecular. Mediante la secuenciación de siguiente generación (NGS) de 4813 genes (exoma clínico), se identificó una variante patogénica en el gen ELAC2, (c.210_222 del p.Gly71ThrfsTer26) en estado heterocigoto y otra variante probablemente patogénica en el mismo gen (c.1177C>T p.His393Tyr) en estado heterocigoto, asociadas con miocardiopatía hipertrófica. Adicionalmente, se identificó una variante patogénica en el exón 358 del gen TTN, (c.104515C>T, het p.Arg34839X) y una VUS (variante de significado incierto) en el gen MYPN (c.2428C>T, p.Arg810Cys), la cual podría tener un efecto aditivo en el fenotipo de la paciente. Así mismo se observa un polimorfismo de riesgo en el exón 16 en el gen LRP8, asociado con enfermedad coronaria (CAD) e infarto de miocardio prematuros (MI) (NM_017522: c.2066G>A, het, p.R689Q). La cardiopatía hereditaria es una causa probable de muerte súbita cardiaca, el análisis molecular por NGS puede ayudar a realizar un diagnóstico precoz para predecir a edad temprana pacientes con riesgo potencial de muerte súbita cardiaca así como un asesoramiento genético dirigido.

We present the case of sudden death in a three month old female infant. The girl died of sudden death, and the autopsy revealed a hypertrophic cardiomyopathy as the underlying alteration. The stored umbilical cord blood sample was used for molecular analysis. A pathogenic heterocigous variant in ELAC2 (c.210_222del, p.Gly71ThrfsTer26), and another probably pathogenic variant in the same gene ( c.1177C> T p.His393Tyr,het) associated with hypertrophic cardiomyopathy was identified. In addition, a pathogenic variant is identified in exon 358 of the TTN gene (c.104515C> T, het p.Arg34839X,het) and a VUS (variant of uncertain significance) in the MYPN gene (c.2428C> T, p.Arg810Cys,het), which may have an additive effect on the patient's phenotype. A risk polymorphism at exon 16 in the LRP8 gene, associated with premature coronary artery disease (CAD) and premature myocardial infarction (MI) (NM_017522: c.2066G> A, het, p.R689Q) was also found. Hereditary heart disease is a probable cause of sudden cardiac death, molecular analysis by NGS can help an early diagnosis and to predict at an early age, the risk of sudden cardiac death as well as directed genetic counseling.

Whole exome trio sequencing reveals a novel LAMP2 mutation found in a male patient with Danon Disease: case report / Secuenciación en trío del exoma revela una nueva mutación LAMP2 encontrada en un paciente masculino con enfermedad de Danon: Reporte de caso

Abstract: Introduction: Danon syndrome was first described by Danon MJ in 1981. This rare disease is a triad consisting of dilated cardiomyopathy, myopathy and mental retardation. The etiology of the disease is associated with mutations in the LAMP2 gene on chromosome X. To date, only mutations in the LAMP2 gene have been associated with the disease. Case presentation: We present the case of a male patient who was initially suspected of being affected by Pompe disease and polymyositis without response to the treatments. He required implantation of pacemakers, and posteriorly a cardioverter defibrillator and isolation of pulmonary veins. Therefore, due to the lack of clarity in the diagnosis, endomyocardial biopsy and genetic studies were performed in order to establish the diagnosis. We found a novel mutation in the LAMP2 gene which had not been reported previously. Discussion: Danon disease is a dominant hereditary syndrome linked to the X chromosome. Danon, specifically is caused by an accumulation of glycogen in muscle cells without alterations in the enzymes responsible for its metabolism. It compromises cardiovascular, muscular and neurological systems, liver and spleen. Cardiac tissue exhibits severe fibrosis, which favors the development of supraventricular and ventricular arrhythmias. As for the diagnosis, the gold standard test is genetic analysis. The treatment is focused on the management of the manifestations that the patient presents, since there is no specific treatment. Conclusions: Danon disease requires further studies in order to obtain epidemiological data for this condition. To date, only mutations in the LAMP2 gene have been documented as the main etiology of Danon disease. We found a single nucleotide deletion in LAMP2 resulting in a frameshift mutation which is the probable cause of Danon disease in this patient.(AU)

Resumen: Introducción: El síndrome de Danon fue descrito por primera vez por MJ Danon en 1981. Esta rara enfermedad es una tríada que consiste en miocardiopatía dilatada, miopatía y retraso mental. La etiología de la enfermedad está asociada con mutaciones en el gen LAMP2 en el cromosoma X. Hasta la fecha, sólo las mutaciones en el gen LAMP2 se han asociado con la enfermedad. Presentación del caso: Presentamos el caso de un paciente masculino que inicialmente se sospechó que estaba afectado por la enfermedad de Pompe y polimiositis sin respuesta a los tratamientos. Requirió la implantación de marcapasos y, posteriormente, un desfibrilador cardioversor y el aislamiento de las venas pulmonares. Entonces, debido a la falta de claridad en el diagnóstico, se realizaron biopsias endomiocardíacas y estudios genéticos para establecer el diagnóstico. Encontramos una nueva mutación en el gen LAMP2 que no se había informado anteriormente. Discusión: La enfermedad de Danon es un síndrome hereditario dominante relacionado con el cromosoma X. Danon, específicamente es causado por una acumulación de glucógeno en las células musculares sin alteraciones en las enzimas responsables de su metabolismo. Compromete los sistemas cardiovascular, muscular y neurológico, el hígado y el bazo. El tejido cardiaco exhibe fibrosis severa, que favorece el desarrollo de arritmias supraventriculares y ventriculares. En cuanto al diagnóstico, la prueba estándar de oro es el análisis genético. El tratamiento se centra en el manejo de las manifestaciones que presenta el paciente, ya que no existe un tratamiento específico. Conclusiones: La enfermedad de Danon requiere más estudios para obtener datos epidemiológicos de esta condición. Hasta la fecha, sólo las mutaciones en el gen LAMP2 se han documentado como la principal etiología de la enfermedad de Danon. Encontramos la eliminación de un solo nucleótido en LAMP2 que resulta en una mutación de cambio de estructura que es la causa probable de la enfermedad de Danon en este paciente.(AU)

Genomics and epidemiology for gastric adenocarcinomas

Whereas the pathological aspects of Gastric Adenocarcinomas (GACs) have been well defined, the actual knowledge of its genesis and evolution remains to be translated to better diagnosis and to more effective therapeutics. As a consequence, the current treatment modalities are not yet able to modify the natural history of the disease, which still presents high mortality-rates worldwide. In this review we highlight the current status of relevant epidemiologic, therapeutic and genomics aspects of GACs and point to some of the current knowledge gaps that, if fully addressed, could contribute to a more effective treatment and better management of the patients that suffer from this often-lethal disease (AU)

Unique autosomal recessive variant of palmoplantar keratoderma associated with hearing loss not caused by known mutations

Abstract Inherited Palmoplantar Keratodermas are rare disorders of genodermatosis that are conventionally regarded as autosomal dominant in inheritance with extensive clinical and genetic heterogeneity. This is the first report of a unique autosomal recessive Inherited Palmoplantar keratoderma -sensorineural hearing loss syndrome which has not been reported before in 3 siblings of a large consanguineous family. The patients presented unique clinical features that were different from other known Inherited Palmoplantar Keratodermas -hearing loss syndromes. Mutations in GJB2 or GJB6 and the mitochondrial A7445G mutation, known to be the major causes of diverse Inherited Palmoplantar Keratodermas -hearing loss syndromes were not detected by Sanger sequencing. Moreover, the pathogenic mutation could not be identified using whole exome sequencing. Other known Inherited Palmoplantar keratoderma syndromes were excluded based on both clinical criteria and genetic analysis.

Isolation of high-quality RNA from Platycladus orientalis and other Cupressaceae plants

Platycladus orientalis has a lifespan of several thousand years in China, making it a good plant in which to study aging at the molecular level, but this requires sufficient quantities of high-quality P. orientalis RNA. However, no appropriate methods have been reported for total RNA isolation from P. orientalis leaves. The TRIzol method did not extract RNA, while cetyltrimethylammonium bromide, sodium dodecyl sulfate-phenol, and plant RNAout kit (Tianz, Inc., China) protocols resulted in low yields of poor quality RNA. Isolating total RNA using the Spectrum™ Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) resulted in a high-quality product but a low yield. However, the two-step removal of polyphenols and polysaccharides in the improved plant RNAout kit protocol resulted in the isolation of RNA with a 28S:18S rRNA ratio of band intensities that was ~2:1, the A260/A280 absorbance ratio was 2.03, and the total RNA yield from P. orientalis leaves was high. This protocol was tested on different P. orientalis tissues of different ages and on leaves of five other Cupressaceae plants. The total RNAs were successfully used in complementary DNA synthesis for transcriptome sequencing and would be suitable to use in additional experiments. The results of this study will benefit future studies in Cupressaceae plants.