Análise de fatores do controle traducional no carcinoma invasivo da mama e estruturação de metodologia de translatômica para amostras tumorais humanas / Analysis of translational control factors in invasive breast carcinoma and development of a translatomics methodology for human tumor samples

Introdução. O câncer de mama possui uma complexidade singular, apresentando considerável heterogeneidade. Os tumores desta patologia são classificados em subgrupos moleculares para um melhor direcionamento na conduta terapêutica. Entretanto, mesmo entre pacientes de um mesmo grupo existe uma ampla gama de prognósticos diferentes, o que indica a necessidade de mais estudos que possam ampliar nosso conhecimento desta enfermidade. A compreensão de mecanismos moleculares associados aos tumores de mama passa pela identificação de perfis de expressão gênica, tradicionalmente analizados pelos níveis de mRNAs. No entanto, essa abordagem não permite identificar mRNAs alvo do descontrole traducional, o que pode alterar o perfil protéico. De fato, alterações em diversas vias de sinalização que controlam a maquinaria de tradução foram observadas em tumores mamários. Portanto, o estudo do controle traducional permite compreender melhor a biologia da doença e identificar padrões de expressão gênica baseados no mRNA diferencialmente traduzido, contribuindo para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares associados ao câncer de mama. Objetivo. Padronizar e aplicar a identificação de mRNAs diferencialmente traduzidos (translatômica) em tumores de mama e estudar o impacto da expressão diferencial de fatores da maquinaria de tradução nas características clínico patológicas do câncer de mama. Métodos. A separação dos mRNAs diferencialmente traduzidos foi realizada através de perfil polissomal desenvolvido neste projeto. Os mRNAs associados aos polissomos foram isolados e identificados através de sequenciamento com construção de biblioteca single cell (Smart-Seq2). A expressão de fatores de início de tradução foi identificada utilizando imuno-histoquímica. Resultados. Foi desenvolvido um gradiente não-linear de sacarose para o isolamento de polissomos, otimizado para a extração de mRNAs em volume reduzido, permitindo a aplicação em pequenas amostras de tecido tumoral. O isolamento e identificação dos mRNAs associados a polissomos foi realizada em 306 amostras de tumores de mama. Também, reações de imuno-histoquímica foram feitas para determinar a expressão dos fatores de tradução eIF4E, eIF4G e IF5A em uma nova casuística de 278 amostras de todos os grupos moleculares distribuídas em 6 TMAs previamente construídos na instituição. No grupo luminal a expressão dos 3 fatores estava correlacionada, porém sem correlação significativa com proliferação celular. Nas amostras classificadas como triplo-negativas, eIF5A e eIF4E se correlacionam entre si e com a expressão de Ki67, no entanto, eIF4G perde sua correlação com os demais fatores. Conclusões. A padronização da translatômica e sua aplicação em amostras humanas foi realizadas com sucesso. Os resultados da futura identificação dos mRNAS diferencialmente traduzidos poderão orientar a descoberta de proteínas com expressão diferencial, as quais podem ser importantes mediadoras de processos tumorais. Com relação a expressão de fatores de início de tradução, no grupo triplo-negativo, o aumento da expressão dos fatores eIF4E e eIF5A correlaciona-se com o aumento do marcador Ki-67, indicando um possível papel destas proteínas da tradução específica e diferencial de um grupo de mRNAs importantes para este grupo molecular

Introduction. Breast cancer has a unique complexity, presenting great clinical heterogeneity. Tumors within this pathology are classified into molecular subgroups to better address therapeutic management. However, even among patients from the same molecyular subgroup there is a wide range of different prognoses, which indicates the necessity of further studies to increase our knowledge on this disease. The comprehension of the molecular mechanisms associated with breast tumors involves the identification of gene expression profiles, traditionally determined by mRNA levels. This approach does not allow the identification of mRNAs targets of translation control, which has a huge impact on the protein profile. In fact, changes in several signaling pathways that control the translation machinery have been observed in mammary tumors. Therefore, the study of translational control allows a better understanding of breast cancer biology and identifies gene expression patterns based on differentially translated mRNA, contributing to clarify molecular mechanisms associated with this disease. Goal. To develop and search for differentially translated (translatomic) mRNAs in breast tumors and to study the impact of differential expression of translation machinery factors on clinical pathological features. Methods. The isolation of differentially translated mRNAs was performed through the polysomal profiling developed in this project. mRNAs associated with polysomes were fractionated and identified by single cell library preparation (Smart-Seq2) and RNA-seq. The expression of translational start factors was evaluated using immunohistochemistry. Results. A nonlinear sucrose gradient was developed from scratch for the isolation of polysomes, optimized for mRNAs extraction in reduced volumes, allowing application of this methodology on small tissue samples. The fractionation and mRNAs associated with polysomes identification was performed on 306 breast cancer samples. Also, immunohistochemistry reactions were performed on a new set of 278 breast samples from all molecular groups distributed in 6 previously constructed TMAs to determine the expression of eIF4E, eIF4G and IF5A translation factors. In the luminal group the expression of the 3 factors was correlated, although without any significant correlation with cell proliferation. eIF5A and eIF4E correlated with each other and with Ki67 expression in triple-negative samples, however, eIF4G lost its correlation with the other factors on this group. Conclusions. The development of a methodology that allows studying translatomics on human samples was successfully performed. The results of future identification of differentially translated mRNAs may guide the discovery of proteins with differential expression that might be important mediators of tumor processes. Regarding the expression of translational factors, on the triple-negative group, the increased expression of the eIF4E and eIF5A factors correlated with increased Ki-67 staining, indicating a possible role of these specific translational proteins on a group of mRNAs important to induce proliferation in the triple-negative breast cancer molecular group

Translatômica aplicada ao descobrimento de alterações moleculares em gliomas / Translatomic aplied to the discovery of molecular alterations in gliomas

O glioblastoma (GBM) está entre os tipos tumorais mais agressivos e de menor resposta a terapias, o que requer, portanto, uma melhor compreensão sobre o comportamento deste tipo tumoral, auxiliando no desenvolvimento de novos tipos de tratamento para a doença. Atualmente, dados de expressão gênica em tumores baseiam-se na população de mRNA total. No entanto, essa abordagem fornece pouca informação sobre os mediadores moleculares das alterações tumorais, pois o nível de expressão de mRNAs não necessariamente reflete os níveis de proteínas expressos. Por outro lado, a população de mRNAs ativamente traduzidos reflete, de maneira mais fidedigna, a expressão proteica, sendo, dessa forma, mais próxima à real medida da expressão gênica. Dito isso, tem-se como objetivo estabelecer a técnica de identificação de RNAs diferencialmente traduzidos (translatômica) e utilizá-la em glioblastomas humanos, contribuindo, assim, para um avanço no conhecimento sobre essa doença. Indica-se com sucesso, como resultado desse estudo, a técnica de translatômica, com o desenvolvimento de um novo gradiente de sacarose que permitiu maior rendimento às preparações e à padronização da identificação de RNAs diferencialmente traduzidos, utilizando tanto microarrays quanto sequenciamento de nova geração. A translatômica foi primeiramente utilizada para comparar a heterogeneidade intratumoral. Comparando áreas histologicamente de maior e menor graus provenientes de um mesmo tumor, observa-se a tradução diferencial de vias de TGF-b e de ciclo celular. Em um segundo momento, a translatômica foi realizada em um número maior de amostras, sendo capaz de classificar três subgrupos moleculares, com um impacto notável na sobrevida: o grupo 1 foi caracterizado pelo aumento das vias associadas à mTORC2, às mitocôndrias à ciliogênese, com sobrevida média de 5 meses; o grupo 2 foi caracterizado por tradução dependente de mTORC1, baixa presença de mitocôndrias e aumento da angiogênese, com uma sobrevida média de 6,3 meses; e o grupo 3 teve uma sobrevida mediana de 21,1 meses e é caracterizado pela alta presença de mitocôndrias, baixa cíliogênese e baixas vias mTORC1 e 2 associadas. Esses grupos não podem ser definidos pela expressão gênica baseada no RNA total, pois não correspondem a classificações moleculares anteriores. Logo, este estudo foi capaz de desenvolver, com sucesso, a técnica de translatômica e aplicá-la ao descobrimento de vias moleculares biologicamente relevantes no processo de tumorigênese em glioblastomas

Glioblastoma (GBM) is among the most aggressive tumor types and the least response to therapy, so better understanding the behavior of this tumor type could help to develop new types of treatment for this disease. Currently, gene expression data on tumors are based on the total mRNA population. However, this approach provides little information on the molecular mediators of tumor changes, since the level of mRNA expression does not necessarily reflect expressed protein levels. Therefore, the population of actively translated mRNAs reflects more accurately the protein expression, being closer to the real measurement of the gene expression. Establish the technique of the identification of differentially translated RNAs (translatomics) and apply it in human glioblastomas, contributing to an advance in the knowledge about this disease. We successfully established the translatomic technique, with the development of a new sucrose gradient that allowed higher yields to the preparations and standardization of the identification of differentially translated RNAs using both microarrays and next generation sequencing. Translatomics was first used to compare intratumoral heterogeneity. Comparing histologically areas of higher and lower degrees from the same tumor, we observed the differential translation of the TGF-b and cell cycle pathways. Afterwards, translatomics were performed in a larger number of samples, being able to classify GBMs into three molecular subgroups, with a remarkable impact on survival. Group 1 was characterized by increased pathways associated with mTORC2, mitochondria and cilia, with an average survival of 5 months. Group 2 was characterized by mTORC1-dependent translation, low mitochondria and increased angiogenesis, with a mean survival of 6.3 months. Group 3 had a median survival of 21.1 months and is characterized by the high presence of mitochondria, low cilia and low associated mTORC1 and 2 pathways. These groups can not be defined using gene expression based on total RNA and thus do not correspond to prior molecular classifications. This study was able to successfully develop the translatomic technique and to apply it to the discovery of biologically relevant molecular pathways in the process of tumorigenesis in glioblastomas

Modificações em proteínas induzidas por compostos eletrofílicos. possível papel em esclerose lateral amiotrófica / Modifications in proteins induced by electrophilic compounds. Possible role in amyotrophic lateral

Danos em biomoléculas podem ocorrer a partir de uma interação direta entre as biomoléculas e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio como também, pela reação de produtos secundários dessas espécies como eletrófilos gerados na peroxidação lipídica. Alguns desses produtos secundários possuem estabilidade química maior que as espécies reativas das quais foram derivadas e podem se ligar covalentemente as biomoléculas comprometendo o funcionamento normal das mesmas. Portanto, modificações em proteínas por aldeídos gerados na lipoperoxidação têm sido investigadas por suas implicações com desordens patológicas relacionadas à agregação proteica, e modificações em diversas vias de sinalização amplificando os efeitos deletérios em sistemas biológicos. Os objetivos desse trabalho foi contribuir na elucidação dos mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento da esclerose lateral amiotrófica (ELA) através da identificação, caracterização e quantificação de modificações póstraducionais em proteínas pelos aldeídos 4-hidroxi-2-hexenal (HHE) e trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) in vitro (citocromo c) e in vivo (modelo ELA) a partir de técnicas de Western blot, imunoprecipitação e espectrometria de massa com abordagem proteômica de "shotgun" em ratosSOD1G93A modelo de esclerose lateral amiotrófica (ELA). Estudos com citocromo c mostraram a ligação dos aldeídos ao citocromo c e mecanismos de reação foram propostos. Foram encontrados seis peptídeos modificados por HHE e um para o HNE, e o peptídeo TGPNLHGLFGR se mostrou modificado pelos dois aldeídos paralelamente. Foi demonstrado que a histidina 33 é um "hot spot" frente as adições pelos aldeídos. Nas análises por western blot das proteínas ligadas a aldeídos foi possível observar uma tendência de aumento na concentração de proteínas ligadas ao HNE nos animais ELA, mais acentuada nas amostras de 70 dias comparadas ao controle. Com relação aos resultados obtidos com HHE tanto os animais pré-sintomáticos quanto os sintomáticos não apresentaram diferenças de HHE-proteína, tantonos controles quanto nos animais ELA. Nas amostras dos animais sintomáticos não detectamos diferença significativa na concentração de aldeído-proteína entre os grupos. Já as análises proteômicas revelaram 24 proteínas diferencialmente expressas, com destaque para proteínas com os maiores valores de significância (p-value), como a ubiquitina no grupo dos pré- sintomáticos e a neurogranina, no grupo dos animais sintomáticos e várias proteínas de metabolismo energético, de neurofilamentos, proteínas de processos redox e proteínas ligadas o metabolismo de cálcio (fundamentais na fisiopatologia em ELA). Algumas proteínas importantes foram encontradas com exclusividades nos grupos pré-sintomáticos e sintomáticos pelo diagrama de Venn. Com relação a proteínas modificadas pelos aldeídos, foram encontradas algumas relevantes como a proteína 2 de interação com a polimerase delta que foi modificada por HNE via adição de Michael encontrada nos animais ELA pré-sintomáticos e sintomáticos, a catalase que foi encontrada modificada por HNE via base de Schiff apenas nos ELA pré- sintomáticos, e a tiol redutase induzível por interferon gama no grupo dos animais ELA sintomáticos. Com relação a proteínas modificadas por HHE, foram encontradas a Janus quinase e proteína 3 de interação com microtúbulo, modificadas tanto por adição de Michael quanto via base de Schiff nos animais ELA sintomáticos. É interessante ressaltar que algumas modificações encontradas em proteínas não caracterizadas podem indicar proteínas novas ainda não descritas como modificadas por esses aldeídos. Os resultados mostram que algumas das proteínas modificadas por HNE e HHE encontradas neste trabalho, estão relacionadas ao estresse redox, vias metabólicas energéticas, proteínas envolvidas na resposta a danos oxidativos, e processos inflamatórios. Tais modificações ocorrem não só no modelo de neurodegeneração, mas foram previamente descritas em outros processos patológicos, como doença cardiovascular, lesão hepática por uso crônico de álcool

Damage to biomolecules can occur from a direct interaction between biomolecules and reactive of oxygen and nitrogen species as well as from the reaction of secondary products of these species as electrophiles generated in lipid peroxidation. Some of these by-products have greater chemical stability than the derived reactive species and can bind to biomolecules compromising their normal function. Therefore, protein modifications by aldehydes generated during lipoperoxidation have been investigated for their implications with pathological disorders related to protein aggregation and modifications in signaling pathways amplifying the deleterious effects in biological systems. The aim of this work was to contribute to the elucidation of the molecular mechanisms associated with the development of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) through the identification, characterization and quantification of posttranslational modifications in proteins by 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and trans-4-hydroxy-2- nonenal (HNE) in vitro, cytochrome c, and in vivo, rat model (SOD1G93A) of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), throught Western blot techniques, and mass spectrometry with shotgun proteomics approach. The results showed the binding of aldehydes to cytochrome c. Six peptides were modified by HHE and one by HNE. The peptide TGPNLHGLFGR was modified by the two aldehydes. Histidine 33 has been shown to be a hot spot against aldehydes additions. By western blot analysis of the aldehyde-bound proteins, it was possible to observe a tendency of increase in the concentration of HNE-bound proteins in the ALS animals, more pronounced in the samples of 70 days compared to control samples. Regarding the results obtained with HHE, both pre-symptomatic and symptomatic animals did not show HHE-protein differences, both in controls and in ALS animals. We did not detect a significant difference in the aldehyde-protein concentration between the groups in the samples of the symptomatic animals. Proteomic analysis revealed 24 differentially expressed proteins, with emphasis on proteins with thehighest values of significance (p-value), such as the ubiquitin in the pre-symptomatic group and neurogranin in the group of the symptomatic animals and several proteins of the energetic metabolism pathways, neurofilaments, proteins of redox processes and proteins linked to calcium metabolism (fundamental in the pathophysiology of ALS). Some important proteins were found exclusivity in the pre-symptomatic and symptomatic groups by the Venn diagram. With regard to aldehyde-modified proteins, some relevant ones such as Delta-2 polymerase interaction protein, that was modified by HNE via the addition of Michael found in presymptomatic and symptomatic ELA animals, catalase that was found to be modified by HNE via Schiff's base only in pre-symptomatic ALS, and gamma interferon-inducible thiol reductase in the group of symptomatic ALS animals. Janus kinase and microtubule interaction protein 3, were found to be modified by Michael addition and Schiff base pathway respectively in symptomatic ALS animals. It is interesting to note that some modifications found in uncharacterized proteins may indicate new proteins not yet described as modified by these aldehydes. The results show that some of the proteins modified by HNE and HHE found in this work are related to redox stress, energetic metabolic pathways, proteins involved in the response to oxidative damage, and inflammatory processes. Such modifications occur not only in the neurodegeneration model, but were previously described in other pathological processes, such as cardiovascular disease, liver injury due to chronic alcohol use

Paracoccidioides brasiliensis translation and protein fate machineries revealed by functional genome analysis

The translational and post-translational modification machineries of Paracoccidioides brasiliensis were assessed by means of comparative analyses of PbAESTs (P. brasiliensis assembled expressed sequence tags) with sequences deposited on different databases. Of the 79 sequences corresponding to cytosolic ribosomal proteins, we were able to find 78 in the P. brasiliensis transcriptome. Nineteen of the 27 Saccharomyces cerevisiae genes related to translation initiation were also found. All eukaryotic elongation factors were detected in P. brasiliensis transcriptome, with eEF1A as one of the most expressed genes. Translation termination is performed, in eukaryotes, by factors 1 and 3 (eRF1, eRF3). In P. brasiliensis transcriptome it was possible to identify eRF3, but not eRF1. Sixteen PbAESTs showing aminoacyl-tRNA synthetase-predicted activities were found in our analyses, but no cysteinyl-, leucyl-, asparagyl- and arginyl-tRNA synthetases were detected. Among the mitochondrial ribosomal proteins, we have found 20 and 18 orthologs to S. cerevisiae large and small ribosomal subunit proteins, respectively. We have also found three PbAESTs similar to Neurospora crassa mitochondrial ribosomal genes, with no similarity with S. cerevisiae genes. Although orthologs to S. cerevisiae mitochondrial EF-Tu, EF-G and RF1 have been found in P. brasiliensis transcriptome, no sequences corresponding to functional EF-Ts were detected. In addition, 64 and 28 PbAESTs associated to protein modification and degradation, respectively, were found. These results suggest that these machineries are well conserved in P. brasiliensis, when compared to other organisms.