The pattern of alternative splicing and DNA methylation alteration and their interaction in linseed (Linum usitatissimum L) response to repeated drought stresses

BACKGROUND: Drought stress has significantly hampered agricultural productivity worldwide and can also result in modifications to DNA methylation levels. However, the dynamics of DNA methylation and its association with the changes in gene transcription and alternative splicing (AS) under drought stress are unknown in linseed, which is frequently cultivated in arid and semiarid regions. RESULTS: We analysed AS events and DNA methylation patterns in drought-tolerant (Z141) and drought-sensitive (NY-17) linseed under drought stress (DS) and repeated drought stress (RD) treatments. We found that the number of intron-retention (IR) and alternative 3' splice site (Alt3'SS) events were significantly higher in Z141 and NY-17 under drought stress. We found that the linseed response to the DS treatment was mainly regulated by transcription, while the response to the RD treatment was coregulated by transcription and AS. Whole genome-wide DNA methylation analysis revealed that drought stress caused an increase in the overall methylation level of linseed. Although we did not observe any correlation between differentially methylated genes (DMGs) and differentially spliced genes (DSGs) in this study, we found that the DSGs whose gene body region was hypermethylated in Z141 and hypomethylated in NY-17 were enriched in abiotic stress response Gene Ontology (GO) terms. This finding implies that gene body methylation plays an important role in AS regulation in some specific genes. CONCLUSION: Our study is the first comprehensive genome-wide analysis of the relationship between linseed methylation changes and AS under drought and repeated drought stress. Our study revealed different interaction patterns between differentially expressed genes (DEGs) and DSGs under DS and RD treatments and differences between methylation and AS regulation in drought-tolerant and drought-sensitive linseed varieties. The findings will probably be of interest in the future. Our results provide interesting insights into the association between gene expression, AS, and DNA methylation in linseed under drought stress. Differences in these associations may account for the differences in linseed drought tolerance.

Triple-negative breast cancer cells respond to T cells severely at the alternative splicing layer

BACKGROUND: Cross talk of tumor­immune cells at the gene expression level has been an area of intense research. However, it is largely unknown at the alternative splicing level which has been found to play important roles in the tumor­immune microenvironment. RESULTS: Here, we re-exploited one transcriptomic dataset to gain insight into tumor­immune interactions from the point of AS level. Our results showed that the AS profiles of triple-negative breast cancer cells co-cultured with activated T cells were significantly changed but not Estrogen receptor positive cells. We further suggested that the alteration in AS profiles in triple-negative breast cancer cells was largely caused by activated T cells rather than paracrine factors from activated T cells. Biological pathway analyses showed that translation initiation and tRNA aminoacylation pathways were most disturbed with T cell treatment. We also established an approach largely based on the AS factor­AS events associations and identified LSM7, an alternative splicing factor, may be responsible for the major altered events. CONCLUSIONS: Our study reveals the notable differences of response to T cells among breast cancer types which may facilitate the development or improvement of tumor immunotherapy.

Identification of mutations in the pah gene in pku patients in the state of mato grosso / Identificação de mutações no gene da pah em pacientes com fenilcetonúria do estado de mato grosso

ABSTRACT Objective: To identify phenylalanine hydroxylase (PAH) mutations in patients with phenylketonuria (PKU) from the Newborn Screening Service in Mato Grosso, Midwest Brazil. Methods: This is a cross-sectional descriptive study. The sample consisted of 19 PKU patients diagnosed by newborn screening. Molecular analysis: DNA extraction using the "salting-out" method. Detection of IVS10nt-11G>A, V388M, R261Q, R261X, R252W, and R408W mutations by the restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique. Results: Two mutant alleles were identified in four patients (21.1%), one allele in five patients (26.2%), and none in the remaining ten patients (52.6%). A total of 13/38 alleles were detected, corresponding to 34.2% of the PAH alleles present. The most prevalent variant was V388M (13.2% of the alleles), followed by R261Q (10.1%) and IVS10nt-11G>A (7.9%). Three variants (R261X, R252W, and R408W) were not found. The most frequent mutation types were: missense mutation in eight alleles (18.4%) and splicing in four alleles (10.5%). The model proposed by Guldberg to determine a genotype/phenotype correlation was applied to four classical PKU patients with two identified mutations. In three of them, the predicted moderate/moderate or moderate PKU phenotype did not coincide with the actual diagnosis. The prediction coincided with the diagnosis of one classic PKU patient. The estimated incidence of PKU for Mato Grosso, Brazil, was 1:33,342 live births from 2003 to 2015. Conclusion: The only mutations found in the analyzed samples were the IVS10nt-11G>A, V388M, and R261Q. The genotype/phenotype correlation only occurred in four (5.3%) patients.

RESUMO Objetivo: Identificar mutações da fenilalanina hidroxilase (PAH) em pacientes com PKU (fenilcetonúria) do Serviço de Triagem Neonatal em Mato Grosso. Métodos: Estudo de corte transversal. Amostra composta de 19 pacientes com PKU através do exame de triagem neonatal biológica. Análise molecular: a) extração de DNA pela metodologia "salting out". B) detecção de mutações IVS10nt-11G>A, V388M, R261Q, R261X, R252W e R408W pela técnica de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Resultados: Dois alelos foram identificados em quatro pacientes (21,1%), um alelo em cinco pacientes (26,2%) e nenhum nos dez pacientes restantes (52,6%). Um total de 13/38 alelos foram identificados, correspondendo a 34,2% dos alelos PAH presentes. A variante mais prevalente foi a V388M (13,2% dos alelos), seguida de R261Q (10,1%) e IVS10nt-11G>A (7,9%). Três variantes (R261X, R252W e R408W) não foram encontradas. Os tipos de mutações mais frequentes foram: troca de sentido em oito alelos (18,4%) e emenda em quatro alelos (10,5%). O modelo proposto por Guldberg para determinar uma correlação genótipo/fenótipo foi aplicado para quatro pacientes clássicos de PKU, com duas mutações identificadas. Em três, o fenótipo previsto de PKU moderada/moderada ou moderada não coincidiu com o diagnóstico real. A predição coincidiu com o diagnóstico de um paciente PKU clássico. A incidência de PKU estimada para Mato Grosso, Brasil foi de 1:33.342 nascidos vivos para o período de 2003 a 2015. Conclusões: Foram encontradas apenas as mutações IVS10nt-11G>A, V388M, R261Q nas amostras analisadas. A correlação genótipo/fenótipo ocorreu em quatro (5,3%) pacientes.

Alternative splicing originates different domain structure organization of Lutzomyia longipalpis chitinases

BACKGROUND The insect chitinase gene family is composed by more than 10 paralogs, which can codify proteins with different domain structures. In Lutzomyia longipalpis, the main vector of visceral leishmaniasis in Brazil, a chitinase cDNA from adult female insects was previously characterized. The predicted protein contains one catalytic domain and one chitin-binding domain (CBD). The expression of this gene coincided with the end of blood digestion indicating a putative role in peritrophic matrix degradation. OBJECTIVES To determine the occurrence of alternative splicing in chitinases of L. longipalpis. METHODS We sequenced the LlChit1 gene from a genomic clone and the three spliced forms obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using larvae cDNA. FINDINGS We showed that LlChit1 from L. longipalpis immature forms undergoes alternative splicing. The spliced form corresponding to the adult cDNA was named LlChit1A and the two larvae specific transcripts were named LlChit1B and LlChit1C. The B and C forms possess stop codons interrupting the translation of the CBD. The A form is present in adult females post blood meal, L4 larvae and pre-pupae, while the other two forms are present only in L4 larvae and disappear just before pupation. Two bands of the expected size were identified by Western blot only in L4 larvae. MAIN CONCLUSIONS We show for the first time alternative splicing generating chitinases with different domain structures increasing our understanding on the finely regulated digestion physiology and shedding light on a potential target for controlling L. longipalpis larval development.

Análise Comparativa da Diversidade de Splicing Alternativo no Proteoma do Cérebro Humano e Murino / Comparative Analysis of the Diversity of Alternative Splicing in the Human and Murine Brain Proteome

Os avanços obtidos em transcriptômica, em função do desenvolvimento de sequenciadores de alta vazão, e na proteômica, por meio dos modernos espectrômetros de massas (MS), resultaram em um grande volume de dados que passou a ser integrado em diversos estudos de Bioinformática, levando ao melhor entendimento sobre a fração dos RNAs mensageiros efetivamente traduzida em proteínas. A proteogenômica é a área de pesquisa que reúne estas tecnologias, atuando na interface entre a genômica e a proteômica para interpretar eventos moleculares, tais como, por exemplo, o splicing alternativo. Este evento molecular é capaz de gerar RNAs mensageiros diferentes a partir de um mesmo gene, podendo alterar a sequência polipeptídica e, consequentemente, gerar proteoformas com funções distintas. Neste sentido, atualmente alguns projetos têm realizado esta análise integrativa com o intuito de comparar os resultados de amostras de ser humano e outros mamíferos, uma vez que alguns destes animais são utilizados como organismos modelo para o estudo dos aspectos moleculares de doenças, como as neurodegenerativas. Desta forma, este projeto teve como objetivo principal analisar o perfil de expressão de variantes de splicing alternativo em dados de espectrometria de massas de proteínas de amostras de tecidos de cérebros sadios de humano e camundongo

Para tal, foram utilizados dados de mRNAs de referência (Refseq), ESTs e sequências da base de dados Uniprot/Swiss-Prot para confecção de repositórios de sequências proteicas personalizados, utilizando uma metodologia desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa denominada matrizes ternárias. O repositório personalizado para humano continha 20.150 sequências canônicas e 204.294 peptídeos não redundantes, totalizando 224.453 sequências. O repositório de camundongo possuía 16.888 sequências canônicas e 156.889 peptídeos não redundantes, totalizando 173.777 sequências. Estes repositórios de sequências proteicas personalizados foram empregados para a análise de dados de espectrometria de massas de três regiões distintas do cérebro de humano e camundongo (corpo caloso, nervo óptico e bulbo olfatório). A partir destas análises, nós inferimos a expressão de um total de 3.289 proteínas canônicas e 23 proteoformas de genes ortólogos entre humano e camundongo. Dentre as proteoformas, seis foram inferidas a partir de peptídeos proteotípicos idênticos identificados em dados de MS de humano e camundongo (PKM, CRMP1, PRKCB, STXBP1, CADM1 e HNRNPK). Portanto, acreditamos que a identificação de peptídeos compartilhados entre humano e camundongo, pertencentes a proteoformas de genes ortólogos, realizada neste projeto, contribuiu para o melhor conhecimento da diversidade de splicing do cérebro de humano e camundongo. (AU)

Increasing evidence for the presence of alternative proteins in human tissues and cell lines

Recent findings coming from human proteome research employing mass-spectrometry and ribosomal profiling methods have provided evidence for the translation of non-annotated coding sequence (CDSs) into alternative proteins (APs). The presence of APs in many human tissues and cell lines may become an important issue in genome sciences, especially in cancer genomics where the frequency of alternative proteins seems to be 10-fold higher than normal tissues. Finding new proteins can impact medical research by filling gaps in known molecular pathways or revealing new molecular markers and therapeutic targets. Among the cellular processes possibly involved in protein diversity, alternative splicing (AS) is the most cited, and it consists of an often-regulated mechanism that generates different mRNAs from the same gene, contributing to the functional diversity of mammalian cells. In the past, evidence for AS from multi-exon genes have come mainly from expression sequence tag (EST) data; only recently has mass-spectrometry (MS) been used to investigate the translation of alternative transcripts. Exploration of human MS data has detected tens to hundreds of alternative proteins in normal tissues, and thousands in cancer cell lines, suggesting that alternative proteins may have an important role in cancer. Analysis of MS data has revealed a vastly diverse AP repertoire, with some of this diversity being exclusively detected in cancer cells. Proteomic characterization of 20 breast cancer cell lines revealed a surprising 1,860 protein variants resulting from AS. Among these, 4 AP are clearly involved in cancer. A truncated variant of the NF- kB p65 subunit, a truncated form of the focal adhesion kinase PTK2 and two CD47 transmembrane receptor protein variants. Until now, little is known about the functional differences between these variants. Another cellular mechanism that possibly creates protein diversity is the alternative usage of translation initiation site (TIS). Detection of TIS is made possible by the Ribosome Profiling (RP) method. The principle of this technique is to capture mRNA translation by freezing the actively translating ribosomes onto transcripts, and then separating them by ultracentrifugation. Recently, RP was applied to mouse embryonic fibroblast cells and human HEK293 cells. The results revealed that the majority of mRNAs contain more than one translation initiation site (TIS), with more than 50% of the detected TISs mapping to alternative ORFs. In this review, we present a list of human alternative proteins validated by small and large-scale experimental methods. We also highlight that APs are probably not a secondary product of inaccurate splicing or translational process and most likely play an important role in the tumorigenic process. Thus, APs constitutes a promising research line for basic and clinical aspects of cancer (AU)

Susceptibility weighted imaging: differentiating between calcification and hemosiderin / Imagem ponderada em suscetibilidade magnética: diferenciando calcificação de hemossiderina

Objective: To present a detailed explanation on the processing of magnetic susceptibility weighted imaging (SWI), demonstrating the effects of echo time and sensitive mask on the differentiation between calcification and hemosiderin. Materials and Methods: Computed tomography and magnetic resonance (magnitude and phase) images of six patients (age range 41– 54 years; four men) were retrospectively selected. The SWI images processing was performed using the Matlab’s own routine. Results: Four out of the six patients showed calcifications at computed tomography images and their SWI images demonstrated hyperintense signal at the calcification regions. The other patients did not show any calcifications at computed tomography, and SWI revealed the presence of hemosiderin deposits with hypointense signal. Conclusion: The selection of echo time and of the mask may change all the information on SWI images, and compromise the diagnostic reliability. Amongst the possible masks, the authors highlight that the sigmoid mask allows for contrasting calcifications and hemosiderin on a single SWI image. .

Objetivo: Expor em detalhes o processamento da imagem ponderada em suscetibilidade magnética (susceptibility weighted imaging – SWI), destacando o efeito da escolha do tempo de eco e da máscara sensível à diferenciação de calcificação e hemossiderina simultaneamente. Materiais e Métodos: Imagens de tomografia computadorizada e por ressonância magnética (magnitude e fase) foram selecionadas, retrospectivamente, de seis pacientes (idades entre 41 e 54 anos; quatro homens). O processamento das imagens SWI foi realizado em rotina própria no programa Matlab. Resultados: Dos seis pacientes estudados, quatro apresentaram calcificações nas imagens de tomografia computadorizada. Nestes, as imagens SWI mostraram sinal hiperintenso para as regiões de calcificações. Os outros dois pacientes não apresentaram calcificações nas imagens de tomografia computadorizada e apresentaram depósito de hemossiderina com sinal hipointenso na imagem SWI. Conclusão: A escolha do tempo de eco e da máscara pode alterar toda a informação da imagem SWI e comprometer a confiabilidade diagnóstica. Dentre as possíveis máscaras, destacamos que a máscara sigmoide permite contrastar calcificação e hemossiderina em uma única imagem SWI. .

Impact of the antipneumococcal conjugate vaccine on the occurrence of infectious respiratory diseases and hospitalization rates in children

INTRODUCTION: In 2010, to reduce the occurrence of serious pneumococcal disease, the Ministry of Health in Brazil incorporated the 10-valent pneumococcal vaccine in the immunization schedule of children younger than two years of age. The objective of this study was to evaluate the impact of vaccination on the incidence of infectious respiratory diseases in infants before and after the introduction of the 10-valent pneumococcal vaccine. METHODS: This cross-sectional study involved primary care and hospital networks from a city in Minas Gerais State, Brazil, between 2009 and 2012. RESULTS: A 40% reduction in the prevalence of community-acquired pneumonia (CAP) was observed after introducing the pneumococcal conjugate vaccine. Male children were 28% more likely to develop the disease. The prevalence ratio ([PR] = 1.96, 95% CI: 1.52 to 2.53, p < 0.05) suggested that not being vaccinated was associated with the occurrence of pneumonia. The prevalence of CAP was 70% lower (PR 0.30, 95% CI: 0.24 to 0.37, p<0.05) in children vaccinated as recommended compared to children with delayed vaccination, suggesting that the updated vaccine schedule improves protection. CONCLUSIONS: Immunization with the 10-valent pneumococcal vaccine appeared to reduce the number of pneumonia cases in children during the study period. Prospective studies are needed to confirm the efficacy of the vaccine against the occurrence of pneumococcal pneumonia. .

INXS, um longo RNA não codificador de proteínas mediador da apoptose / INXS, a long noncoding RNA that mediates apoptosis

O splicing alternativo do pré-mRNA de BCL-X produz duas isoformas de mRNAs com funções antagônicas, a pró-apoptótica BCL-XS e a anti-apoptótica BCL-XL, cujo balanço regula a homeostasia celular. Entretanto, o mecanismo que regula esse processamento ainda é desconhecido. Nesse trabalho, nós identificamos e caracterizamos um longo RNA não codificador de proteínas (lncRNA) nomeado INXS, que é transcrito a partir da fita oposta do locus genômico de BCL-X, sendo menos abundante em linhagens celulares tumorais e tecidos tumorais de pacientes quando comparados com os respectivos pares não tumorais. INXS é um RNA unspliced de 1903 nts, é transcrito pela RNA Polimerase II, possui cap 5', está enriquecido na fração nuclear das células e se liga à proteína Sam68 do complexo modulador de splicing. O tratamento de células tumorais 786-O com cada um de três agentes indutores de apoptose aumentou a expressão endógena do INXS, levando ao aumento expressivo da proporção entre os mRNAs de BCL-XS / BCL-XL, e ativação das caspases 3, 7 e 9. Estes efeitos foram anulados na presença do knockdown do INXS. Da mesma forma, a superexpressão ectópica do INXS causou uma mudança no splicing favorecendo a isoforma BCL-XS e ativação das caspases, aumentando os níveis da proteína BCL-XS e conduzindo as células à apoptose. Utilizando um modelo in vivo, cinco injeções intra-tumorais do INXS durante 15 dias causaram uma regressão acentuada no volume dos xenotumores. Portanto, INXS é um lncRNA que induz a apoptose, sugerindo que essa molécula seja um possível alvo a ser explorado na terapia contra o câncer

BCL-X mRNA alternative splicing generates pro-apoptotic BCL-XS or anti-apoptotic BCL-XL, whose balance regulates cell homeostasis. However, the mechanism that regulates the splice shifting is incompletely understood. Here, we identified and characterized a long noncoding RNA (lncRNA) named INXS, transcribed from the opposite genomic strand of BCL-X, that was less abundant in tumor cell lines and patient tumor tissues compared with non-tumors. INXS is an unspliced 1903 nt-long RNA, is transcribed by RNA Polymerase II, 5'-capped, nuclear enriched and binds Sam68 splicing-modulator. The treatment of tumor cell line 786-O with each of three apoptosis-inducing agents increased endogenous INXS lncRNA, increased BCL-XS / BCL-XL mRNA ratio, and activated caspases 3, 7 and 9. These effects were abrogated in the presence of INXS knockdown. Similarly, ectopic INXS overexpression caused a shift in splicing towards BCL-XS and activation of caspases, increasing the levels of BCL-XS protein and then leading the cells to apoptosis. In a mouse xenograft model, five intra-tumor injections of INXS along 15 days caused a marked regression in tumor volume. INXS is an lncRNA that induces apoptosis, suggesting that INXS is a possible target to be explored in cancer therapies

Isolamento, expressão, e caracterização de três variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK em modelo de astrocitoma humano / Isolation, expression, and characterization of three alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene in the human astrocytoma model

Glioblastoma multiforme (G BM), ou astrocitoma grau IV, é o tumor mais comum e letal do sistema nervoso central. Uma de suas características mais marcantes é seu alto potencial invasivo do tecido normal adjacente. Neste processo, o remodelamento da matriz extracelular, modulado por enzimas que degradam seus componentes e por inibidores destas enzimas, é crucial. Foi descrito que a expressão de MMP-2 e MMP-9, membros da família das metaloproteinases de matriz, aumentam conforme a progressão de astrocitomas. A variante canônica de RECK suprime a invasão tumoral e metástase através da inibição da atividade de, pelo menos, três MMPs: MMP-2, MMP-9 e MMP-14. Uma correlação positiva tem sido observada entre a abundância da expressão de RECK em amostras tumorais e um prognóstico mais favorável para pacientes com diversos tipos de tumores. Neste estudo, variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK foram identificadas através da análise de Expressed sequenced Tags (ESTs), isoladas por RT-PCR, sequenciadas e clonadas. Três novas variantes de splicing do gene RECK foram identificadas e caracterizadas. O perfil de expressão dos transcritos de RECK foi determinado através de ensaios de RT-PCR quantitativo em um painel de tecidos normais e, também, durante a progressão de astrocitomas. Foram utilizadas, para esta análise, amostras macro dissecadas de tumores de pacientes com astrocitomas grau I (n=15), II (n=15), III (n=15) e GBMs (n=30). Os resultados mostram que maior expressão de RECK canônico, acompanhada de maior razão de expressão da variante canônica em relação às variantes de splicing alternativo, correlaciona positivamente com maior sobrevida global de pacientes com GBM, sugerindo seu papel como potenciais biomarcadores para o prognóstico destes pacientes. Análise funcional das isoform as de RECK em células U87 MG revelou que as células superexpressando as isoformas não apresentam inibição do processo de invasão celular, como observado para superexpressão da proteína canônica. Dentre as isoformas analisadas, destaca-se RECK-B, isoforma potencialmente ancorada à membrana plasmática por GPI, como a proteína canônica RECK, sugerindo uma possível colocalização destas variantes. Observa-se que células superexpressando RECK-B apresentam maior capacidade tumorigênica. Os resultados indicam que as variantes de RECK e o balanço entre a expressão destas variantes, apresentam um papel importante no comportamento e na agressividade de GBMs, tendo potencial valor na clínica. Além disso, para abrir perspectivas para o estudo das variantes de RECK, o balanço de expressão dos transcritos canônico e alternativos deste gene foi explorado durante os processos de diferenciação osteogênica e adipogênica. Os resultados indicam que a expressão da variante canônica é mais abundante em relação à expressão de suas isoformas em estágios tardios da adipogênese, sendo que o perfil inverso é observado em relação à isoforma B durante a osteogênese, sugerindo que o balanço entre os níveis de expressão das isformas de RECK possui um potencial papel biológico que deve ser explorado durante esses processos. Em conjunto, os resultados demonstram a existência de, pelo menos, três variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK com envolvimento na tumorigênese e na diferenciação celular, abrindo novas perspectivas para o estudo e a aplicação do gene RECK na clínica

Glioblastoma multiforme (GBM) or grade IV astrocytoma is the most common and lethal tumor of the central nervous system. One of the most striking features of GBMs is their invasive potential of the normal surrounding brain tissue. It has been described that MMP-2 and MMP-9 expression levels increase during astrocytoma progression. Canonical RECK suppresses tumor invasion and metastasis by negatively regulating at least three matrix metalloproteinases, namely: MMP-9, MMP-2 and MT1-MMP. A positive correlation has been observed between the abundance of RECK express ion in tumor samples and a more favorable prognosis for patients with several types of tumors. In this study, splice variants of the RECK tumor suppressor gene were identified by Expressed Sequence Tag (EST) analysis, isolated by RT-PCR, sequenced and cloned. Three novel alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene were identified and characterized. The RECK transcripts expression profiles were investigated using quantitative RT-PCR assays in a normal tissue RNA panel and, also, during astrocytoma progression in macrodissected tumor samples of patients with astrocytoma grades I (n=15), II (n=15), III (n=15) and IV/GBM (n=30). The results show that higher canonical RECK expression, accompanied by a higher ratio of canonical to alternative transcript expression, positively correlated with higher overall survival rate after chemotherapeutic treatment of GBM patients. Our findings suggest that these RECK transcript variants may potentially be used as biomarkers for prognosis of GBM patients. U87 MG cells overexpressing each RECK alternative variant were generated and found to lack the supressive role of cellular invasion processes found upon overexpressing the canonical protein. Among the characterized isoforms, RECK-B stands out, since this isoform is potentially anchored to the cell membrane by a GPI anchor, exactly as the canonical RECK and, also, since cells overexpressing RECK-B display greater tumorigenic capacity. The results indicate that RECK variants and the balance between the expressions of these variants, play an important role in the behavior and aggressiviness of GBMs, therefore have a potential translational application. In addition, in order to investigate new perspectives for the analysis of these isoforms, the expression balance of RECK transcripts was assessed during osteogenesis and adipogenesis, by qRT - PCR. The results show that the expression of the canonical RECK variant is more abundant that that of its alternative isoforms in later stages of adipogenic differentiation. The opposite profile is found regarding RECK-B during osteogenesis, suggesting that the balance between the expressions of these transcripts may have a potential role during these processes. Taken together, the results show the existence of, at least, three alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene, which are involved in tumogigenesis and cellular differentiation, o pening new perspectives for studies and clinical application of the RECK gene

Desenvolvimento de uma abordagem computacional para a tradução in silico de variantes de splicing detectadas no transcriptoma humano / Development of a computational approach for in silico translation of splice variants found in the human transcriptome

Um dos mecanismos capaz de aumentar a diversidade do proteoma de eucariotos é o splicing alternativo nos pré-mRNAs. Este mecanismo celular ocorre durante a transcrição dos genes,sendo ocasionado por um ou mais dos seguintes eventos: retenção de íntrons,uso alternativo de sítio de splice 5’, uso alternativo de sítio de splice 3’ e uso alternativo de éxons. Análises recentes de Bioinformática utilizando experimentos de RNA-Seq mostram que aproximadamente 90(por cento) dos genes humanos produzem mais de um transcrito decorrente de eventos de splicing alternativo.O impacto do splicing alternativo no proteoma humano vem sendo alvo de algumas abordagens de Bioinformática, sendo esperado que uma grande porção de tais transcritos alternativos possa alterar o conteúdo da cadeia polipeptídica obtida após a sua tradução.Devido a sua importância, diversos trabalhos já foram desenvolvidos com o objetivo de facilitar a identificação de eventos de splicing alternativo a partir de dados provenientes de cDNA,bem como sua associação com a estrutura das proteínas de suas isoformas. Entretanto, são poucas as abordagens que realizaram a tradução in silico do transcriptoma humano na busca por variantes de splicing e a utilização de dados oriundos de sequenciadores de segunda geração(NGS) ainda muito pouco explorada para tratar do tema. Desta maneira,o presente projeto tem como objetivo a aplicação de uma nova abordagem para a identificação e tradução de variantes de splicing alternativo usando dados de NGS.Foram utilizadas leituras da plataforma de sequenciamento Roche/454 oriundas de estudos de câncer para um enriquecimento de nossobanco de dados original que continha previamente mRAs completos e ESTs.Após o enriquecimento, a metodologia empregada pelo nosso grupo conseguiu detectar 4.574 variantes de splicing inéditas em nosso banco.O novo banco gerado foi traduzido levando a criação de um repertório proteico contendo 159.638 sequências polipeptídicas não redundantes.Na busca por variantes inéditas utilizando dados de proteômica,foram identificadas três possíveis nos genes humanos tubulina2b, tubulina 4b e actina.Dados de sequenciamento da plataforma lllumina também foram utilizados para uma avaliação da sua contribuição em número de variantes e sequências polipeptídicas traduzidas em nosso repertório.Encontramos que a nossa abordagem foi capaz de anotar 53(por cento) mais sequências polipeptídicas quando comparada ao repertório de ENSEMBL Gene.Desta forma, acreditamos que o presente projeto pode auxiliar no melhoramento da anotação de peptídeos encontrados por técnicas de proteômica,bem como no descobrimento de novos marcadores moleculares.

Biomarcadores de prognóstico no câncer de pulmão: caracterização do perfil de expressão gênica das hialuronidades, imunoreatividade das hialuronidases e sintases do ácido hialurônico e interação dessas proteínas com a transição epitélio-mesenquimal / Prognostic biomarkers in lung vancer: characterization of gene expression profile of hialuronidades, immunoreactivity of hyaluronidases and hyaluronan synthases and the interaction of these proteins with the epithelial-mesenchymal transition

Em virtude dos pobres resultados obtidos no tratamento do Câncer de Pulmão, seja em estágios iniciais ou na doença avançada localmente, há a necessidade de se desenvolver marcadores moleculares e imunohistoquímicos que possam prever o comportamento tumoral. Ácido Hialurônico (HA) é um componente da matriz extracelular, responsável pela hidratação e manutenção do equilíbrio osmótico tecidual. Concentrações de HA estão elevadas em vários tipos de cânceres, incluindo pulmão. Hialuronidases (HAases), são uma família de enzimas relacionadas com a propagação de infecções bacterianas, toxinas de venenos e progressão tumoral. A quebra do HA em pequenos fragmentos (3-25 dissacarídeos) promovidos pela ação das HAases tipo Hyal1, Hyal2 e Hyal3, está relacionada à promoção do câncer através da indução da angiogênese e estímulo a proliferação através de ativação da via tirosina quinase. Algumas isoformas de HAases, descritas como produto de splicing alternativo, possuem atividade enzimática diversificada. A heterogeneidade de expressão das HAases foi identificada em alguns tipos de câncer e pode ser correlacionada com o comportamento diferenciado dos tumores. Em uma primeira instância, o perfil de expressão das HYAL foi avaliado em tecidos pulmonares tumorais e normais de 69 tumores ressecados de pacientes com adenocarcinomas (ADC) e carcinomas de células escamosas (CCE) oriundos do Hospital das Clinicas e Hospital do Câncer AC. Camargo. A expressão da HYAL1- selvagem (wt) e variantes 1 a 5, HYAL2-wt, HYAL3-wt e variantes 1 a 3 foi identificada por PCR e seqüenciamento direto. Diferentes proporções de HYAL3-wt e variantes foram expressas em tecidos pulmonares tumorais e controles. HYAL1-wt esteve associada com prognóstico desfavorável e HYAL3-v1 com prognóstico favorável. Diante dos resultados obtidos dos tumores de pacientes do Hospital das Clínicas e Hospital AC. Camargo, prosseguimos a investigação para estudar a imunoexpressão das Hyal 1 e 3 e HAS 1, 2 e 3 nos CCE...

Given the poor results obtained in the treatment of Lung Cancer, in early stages or locally advanced disease, there is a need to develop molecular markers and immunohistochemical studies that can predict tumor behavior. Hyaluronic Acid (HA) is a component of extracellular matrix is responsible for hydration and maintenance of tissue osmotic equilibrium. Concentrations of HA are elevated in several types of cancers, including lung. Hyaluronidases (HAases) are a family of enzymes involved in the spread of bacterial toxins, poisons and tumor progression. The breakdown of HA into small fragments (3-25 disaccharides) promoted by the action of type HAases Hyal1, Hyal 2 and Hyal 3 is related to the promotion of cancer by inducing angiogenesis and stimulate proliferation through activation of the tyrosine kinase. Some isoforms HAases, described as the product of alternative splicing, have diverse enzymatic activity. The heterogeneity of expression of HAases was identified in some cancers and can be correlated with the different behavior of tumors. In a first instance, the expression profile of Hyal spliced forms was evaluated in tumor and normal lung tissue of 69 tumors resected from patients with adenocarcinomas(ADC) and squamous cell carcinomas (SqCC) from the Hospital das Clínicas and Hospital AC. Camargo. Gene expression of HYAL1 wild-type (wt) and variants 1 to 5 HYAL2-wt, and HYAL3-wt and variants 1 to 3 was identified by PCR and direct sequencing. Different proportions of HYAL3-wt and variants were expressed in tumor and normal lung tissue. HYAL1-wt was associated with unfavorable prognosis and HYAL3-v1 with favorable prognosis. Given the genetic abnormalities found in tumors of patients from Hospital das Clinicas and Hospital AC. Camargo, we continued our research to study the expression of Hyal 1.3 and HAS 1, 2, 3 in squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. We observed that the intensity of expression of Hyal 3 was higher in tumor cells compared to...

Polymorphism of the aryl-hydrocarbon receptor gene in intron 10 of human cancers

Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and related halogenated aromatic hydrocarbons (e.g., PCDFs), often called "dioxins", are ubiquitously present environmental contaminants. Some of them, notably 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), are among the most toxic synthetic compounds known. The biological effects of dioxins are mediated via the aryl hydrocarbon receptor (AhR). Mutations in the AhR transactivation domain are linked to sensitivity to the acute lethality of TCDD. We present here a study of AhR gene polymorphism in normal and cancer human tissues affecting pre-mRNA splicing in the AhR gene-coding transactivation domain region (exon 10, intron 10, exon 11 region), previously shown to be associated with AhR dysfunction. We tested 126 pairs of normal and cancer tissue samples from liver, lung, stomach, kidney, mucous, breast, and pancreas of 49 males and 77 females (45-70 years of age). We used in vitro splicing assay, RT-PCR and sequencing methods. Our results showed that in an in vitro system it is possible to reconstitute cellular pre-mRNA splicing events. Tested cancer tissues did not contain mutations in the AhR transactivation domain region when the DNA sequences were compared with those from normal tissues. There were also no differences in AhR mRNA splice variants between normal and malignant breast tissues and no polymorphisms in the studied regions or cDNA.

Novel DMRT1 3'UTR+11insT mutation associated to XY partial gonadal dysgenesis / Nova mutação 3'UTR+11insT no gene DMRT1 associada à disgenesia gonadal parcial XY

The Y-chromosome-located SRY gene encodes a small testis-specific protein containing a DNA-binding motif known as the HMG (high mobility group) box. However, mutations in SRY are not frequent especially in cases of 46,XY partial gonadal dysgenesis. Several sex-determining genes direct the fate of the bipotential gonad to either testis or ovary. In addition, heterozygous small deletions in 9p can cause complete and partial XY gonadal dysgenesis without other symptoms. Human DMRT1 gene, which is located at 9p24.3, is expressed in testis and ovary and has been considered, among others, a candidate autosomal gene responsible for gonadal dysgenesis. In this report we describe a nucleotide insertion in DMRT1 3'UTR in a patient of XY partial gonadal dygenesis. The 3'UTR+11insT is located within a conserved motif important for mRNA stabilization.

O gene SRY, localizado no cromossomo Y, codifica uma proteína testículo-específica contendo um domínio HMG (grupo de alta mobilidade) de ligação ao DNA. No entanto, mutações no gene SRY não são frequentes, especialmente nos casos de disgenesia gonadal parcial em indivíduos 46,XY. São atualmente conhecidos vários genes que participam do processo de diferenciação gonadal, tanto para o desenvolvimento testicular quanto para o ovariano. Além disso, pequenas deleções heterozigotas em 9p podem causar disgenesia gonadal XY completa ou parcial, sem outros sintomas associados. O gene DMRT1 humano, que está localizado em 9p24.3, é expresso no testículo e ovário no período fetal e tem sido considerado um dos genes autossômicos envolvido na etiologia das disgenesias gonadais. Neste trabalho, descrevemos a inserção de um nucleotídeo em 3'UTR do gene DMRT1 em um paciente 46,XY com disgenesia gonadal parcial. A mutação 3'UTR+11insT está localizada dentro de um motivo conservado importante para a estabilização do mRNA.

Splicing variants impact in thyroid normal physiology and pathological conditions / Variantes de splicing e seu impacto em condições fisiológicas e patológicas da tireoide

RNA splicing is an essential, precisely regulated process that occurs after gene transcription and before mRNA translation, in which introns may be removed and exons, retained. Variability in splicing patterns is a major source of protein diversity from the genome and function to generate a tremendously diverse proteome from a relatively small number of genes. Changes in splice site choice can determine different effects on the encoded protein. Small changes in peptide sequence can alter ligand binding, enzymatic activity, allosteric regulation, or protein localization. Errors in splicing regulation have been implicated in a number of different disease states. This study reviewed the mechanisms of splicing and their repercussion in endocrinology, emphasizing its importance in some thyroid physiological and pathological conditions.

Após a transcrição genética e antes da tradução do mRNA, ocorre o splicing do RNA, que consiste em um processo essencial, precisamente regulado, por meio do qual podem ocorrer excisões de íntrons e retenções de éxons. A variabilidade dos padrões de splicing é a principal fonte de diversidade de proteínas geradas por um pequeno número de genes. Alterações na escolha do sítio de splicing podem determinar efeitos diferentes nas proteínas codificadas. Pequenas alterações na sequência peptídica podem alterar o seu sítio de ligação de substratos, sua atividade enzimática, a regulação alostérica ou a localização proteica. Erros na regulação do splicing têm sido implicados em grande número de doenças. Nessa revisão, foram descritos os mecanismos de splicing enfatizando sua importância em algumas condições fisiológicas e patológicas envolvendo a tireoide.

Identificação de marcadores moleculares em câncer de mama através da técnica de microarray utilizando uma plataforma de exons tumor-associados / Identification of breast cancer molecular markers through microarray technology using a tumor-associated exons platform

Análises recentes têm mostrado a ocorrência de splicing alternativo (AS) do mRNA em pelo menos 60% dos genes humanos, sendo que 80% desses eventos ocorrem dentro da região codificadora, aumentando a diversidade proteômica. ... Para identificar variantes de splicing diferencialmente reguladas em câncer de mama, 270 exons expressos em tecidos ... Esses exons foram imobilizados em membranas de nylon juntamente com controles positivos e negativos, e hibridizados contra amostras tumorais e normais de mama. ... Para validação técnica dos exons selecionados como superexpressos de acordo com os critérios estabelecidos, foi empregada a técnica de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), usando o mesmo grupo de amostras já utilizadas anteriormente. ... Os resultados mostraram que a razão do nível de expressão entre as 3 VCE e a expressão constitutiva do gene (VCE/EC) foi significativamente maior em amostras tumorais de mama quando comparadas às amostras normais (p<0,05), sugerindo que TRIM37-VCE, MK-STYX-VCE e BRRN1-VCE são, de fato, variantes de splicing superexpressas em câncer de mama. Essas variantes foram também avaliadas em um grupo independente de 40 amostras tumorais de mama para validar biologicamente a superexpressão da VCE em amostras tumorais de mama quando comparadas às amostras normais. Todos os dados foram correlacionados com características clínicas e histopatológicas das amostras.

Current analyses have shown that alternative mRNA splicing (AS) appears in at least 60% of human genes and 80% of these events occurs within the coding region, increasing the proteomic diversity. Some AS variants have been preferentially expressed in human tumors and are potential molecular markers, contributing to the development of more accurate diagnostic and prognostic factors as well as therapeutic targets. To identify differentially regulated splicing variants in breast cancer, 270 exons expressed in tumor tissues were selected by a computational analysis, of which 75 were associated with breast, because they are found to be expressed in libraries that originated from breast tumors and they were not found in the corresponding normal libraries. These exons were immobilized on nylon membranes together with positive and negative controls, and hybridized against tumor and normal breast samples. To identify the most highly expressed exons in tumor tissues, 3 comparisons were performed: 4 tumor against 2 normal breast cell lines (LTxLN), 27 tumor against 5 non-neoplasic breast tissues (TxN) and 4 matched tumor-normal samples (PTxPN). A Tstudent test was used to select for differentially expressed exons (p<0.05) in each comparison (LTxLN; TxN; PTxPN). Here, 24 were selected as over expressed exons in the LTxLN comparison, 79 exons in the TxN comparison and 195 exons in the PTxPN comparison. For technical validation, those exons having a fold change of ≥ 3 in tumor samples and being present in at least 2 comparisons were selected. Fourteen exons were identified by microarray experiments and evaluated through quantitative RT-PCR (qRTPCR), using the same sample set utilized previously. In order to test whether the exons selected by microarray experiments belonged to a prone over expressed splicing variant, 2 criteria were adopted: (1) Validation by qRTPCR of the variant that comprises the selected over expressed exon (VCE) (fold change ≥ 3); (2) For those exons confirmed in criterion (1), evaluation of whole gene expression (through the analysis of constitutive gene expression) is adopted as a secondary criterium. Three of the VCE's were confirmed through qRT-PCR as being over expressed in breast tumor, such as TRIM37-VCE, MK-STYX-VCE and BRRN1-VCE. The constitutive expression of the gene (EC) was analyzed by qRT-PCR, through the primer design within constitutive exons, that is, present in all variants of the gene. The results showed that the expression level ratio between the 3 VCE's and the constitutive expression of genes (VCE/EC) was significantly higher in tumor samples when compared to normal samples (p<0.05), suggesting that TRIM37-VCE, MK-STYX-VCE and BRRN1-VCE are indeed breast tumor associated variants. These variants were also evaluated in an independent set of 40 breast tumor samples to biologically validate the VCE over expression in tumor samples as compared to normal samples. All data were correlated with clinical and histopathological samples features, and some significative associations were found, such as the expression of estrogen (ER+) and progesterone (PgR+) receptors with TRIM37-VCE. Although an increase of the experimental data is required for the complete exploration of this study, the results suggest 3 splicing variants that are over expressed in ductal carcinoma of the breast, and are candidates for molecular markers.

Análise da expressão de RNAs intrônicos não-codificadores em carcinomas de célula renal / Expression analysis of intronic noncoding RNAs in renal cell carcinomas

O carcinoma de célula renal (CCR) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. A transformação maligna no CCR está possivelmente associada à mudanças no perfil de expressão de oncogenes e genes supressores de tumor, e acredita-se que estas alterações sejam críticas para o desenvolvimento do fenótipo maligno. Para identificar novos genes e vias moleculares associadas à transformação maligna no CCR célula clara, foram analisados perfis de expressão gênica de amostras pareadas de tumor e tecido não tumoral adjacente de 6 pacientes. Foi utilizada uma plataforma de microarrays de cDNA contendo 2.292 sondas mapeando éxons de genes codificadores e 822 sondas de RNAs não-codificadores mapeando em regiões intrônicas. A transcrição intrônica foi detectada em todos os tecidos normais e neoplásicos. Utilizando uma combinação de dois testes estatísticos e uma validação por leave-one-out, foi selecionado um subconjunto de 64 transcritos com expressão significativamente alterada em CCR célula clara em relação ao tecido não tumoral adjacente, estando a maior parte (86%) com expressão diminuída em CCR. Entre os transcritos com expressão diminuída, 49 mapearam em regiões não-traduzidas ou éxons de genes codificadores e 6 mapearam em regiões intrônicas de genes codificadores conhecidos. Os níveis de expressão diminuída de SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP e NDE1 (p<0,02), e de transcritos intrônicos derivados dos loci de SND1 e ACTN4 (p<0,05), foram confirmados em CCR célula clara por Real-time RT-PCR. Um subconjunto de 25 transcritos se mostrou alterado em 6 amostras adicionais de CCR não-célula clara, indicando alterações transcricionais comuns em CCR independentemente do subtipo histológico ou do estado de diferenciação do tumor. Além disso, foi analisado o perfil de metilação dos genes com expressão diminuída em tumor SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP e GPX3...

El splicing alternativo del exón 5 de la citocromo p450 aromatasa podría ser un mecanismo de regulación de la producción de estrógenos en humanos / Exon 5 alternative splicing of the cytochrome P450 aromatase could be a regulatory mechanism for estrogen production in humans

La enzima P450 aromatasa (P450Aro) participa en la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. La mutación c655G>A, descripta en forma heterocigota en una niña y en forma homocigota en un hombre adulto, ambos con déficit de aromatasa, genera la disrupción del sitio dador de splicing exón5-intrón5. Se ha postulado que la retención del intrón5 y la generación de una proteína truncada inactiva serían las consecuencias de esta mutación. Sorpresivamente, la paciente presentó desarrollo espontáneo de mamas y niveles puberales de estradiol, sugiriendo una actividad aromatasa (AA) residual. En principio postulamos que la mutación c655G>A generaría la pérdida del exón5 con conservación del marco de lectura, generándose una proteína con menor actividad que podría explicar el déficit parcial. La expresión del ARNm sin exón5 (ARNm- E5) en linfocitos de la paciente sugiere una asociación entre la pérdida del exón y la presencia de la mutación; posteriormente confirmada realizando ensayos de splicing en células Y1. Sin embargo, la expresión del cDNAE5 en células Y1 presentó una AA nula que no explicaría un déficit parcial. La expresión del ARNm-E5 fue detectada en placenta, testículo y adrenal humanos como una variante de splicing normal. Estos resultados indicarían la ocurrencia de splicing alternativo (SA) en la zona codificante de P450Aro como un posible mecanismo regulador de la producción de estrógenos en tejidos esteroidogénicos humanos. La mutación c655G>A podría alterar los mecanismos fisiológicos reguladores del SA del exón5 favoreciendo su exclusión. De esta forma, bajos niveles de ARNm+E5 podrían expresarse aun en presencia de la mutación explicando el fenotipo de déficit parcial observado en la paciente.

P450 aromatase (P450Aro), involved in androgen to estrogen conversion, is encoded by the CYP19 gene. P450Aro c655G>A mutation described in heterozygous form in a girl and in homozygous form in an adult male with P450Aro deficiency results in an aberrant splicing due to disruption of a donor splice site. A truncated inactive protein would be expected if intron5 is retained. Surprisingly, the girl described with this mutation showed spontaneous breast development and pubertal estradiol (E2) levels suggesting residual P450Aro activity (AA). Formerly, we postulate the in frame E5 skipping as a consequence of this mutation generating a protein with some degree of activity. When P450Aro mRNA expression was analysed from patient's lymphocytes, an aberrant spliced mRNA lacking E5 (-E5mRNA) was detected, suggesting an association between E5 skipping and the presence of the mutation. Splicing assays in Y1 cells confirmed this association. -Ex5 cDNA expression in Y1 cells resulted in an inactive protein that could not explain patient's phenotype. Exon 5 might be predicted as a poorly defined exon suggesting a susceptibility to splicing mutations and physiological alternative splicing (AS) events. Therefore, -Ex5mRNA was assessed as a natural occurring alternative transcript in normal human steroidogenic tissues. As P450Aro -E5mRNA expression was detected in human term placenta, prepubertal testis and prepubertal adrenal, we might speculate that AS of P450Aro coding region would occur in humans and would be involved in the complex AA regulation. Furthermore, tissue specific regulation of AS might suggest low expression of +E5mRNA from the c655G>A allele explaining residual AA evidenced in the affected girl.

Identificação e análise de expressão de RNAs intrônicos não codificadores humanos / Identification and expression analysis of human intronic noncoding RNAs

Nesse trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfís de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüência revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nos identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim.Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria “Regulação da transcrição...

Caracterização de um novo antígeno tumoral: CTSP-1 / Characterization of a new tumor antigen: CTSP-1

A necessidade de identificar novos antígenos tumorais que possam ser utilizados no tratamento e diagnóstico do câncer, tem levado ao desenvolvimento de técnicas cada vez mais eficientes na detecção dos mesmos. Antígenos de diferentes categorias foram identificados e caracterizados, sendo os antígenos cancer-testis (CT) e os antígenos de diferenciação (CD) os de maior importância clínica, dado seu restrito padrão de expressão. Utilizando uma estratégia de alinhamento de seqüências expressas no genoma humano, identificamos um novo transcrito localizado no cromossomo 21, denominado CTSP-1, que apresenta alta similaridade com o antígeno tumoral NY-BR-1... Além disso, avaliamos seu padrão de expressão em diferentes tecidos normais, linhagens celulares tumorais e amostras de tumores de pacientes... Através de immunoblotting foi possível a identificação de uma banda específica de 22kDa, correspondente ao peso esperado da proteína CTSP-1 em extrato total de testículo normal. Em seguida, através da imunohistoquímica, verificamos uma marcação preferencial nas espermatogônias e células de Leydig de testículo normal. Nos tecidos com amostras pareadas normal/tumor (mama e próstata), apenas as amostras tumorais foram fortemente marcadas. Posteriormente, a proteína CTSP-1 recombinante foi utilizada na investigação de anticorpos específicos em plasma de pacientes com câncer. Aproximadamente 150 amostras foram analisadas, das quais 20% apresentaram resposta imune humoral contra a proteína CTSP-1. Estes resultados revelam que o CTSP-1 é um novo antígeno tumoral da categoria dos CTs, com expressão restrita a tumor e testículo e com alta imunogenicidade em pacientes com câncer...(AU)

The need to identify new tumor antigens to be used in cancer treatment and diagnosis has lead to the development of efficient techniques for this purpose. Antigens from different categories have been identified and characterized and, among those, the cancer-testis (CT) and the cancer differentiation (CD) antigens are of the greatest clinicai interest dueto their restricted expression partem. Using alignments between expressed sequences and the Human Genome Sequence, we identified a new gene located on chromosome 21, named CTSP-1. This gene has a high similarity to the tumor antigen NY-BR-1, which encodes for a tissue specific transcription factor and is a potential target for cancer immunotherapy. In order to verify ifthe CTSP-1 gene is really a new tumor antigen, we performed its complete characterization. Using different techniques, we were able to obtain the complete sequence of the CTSP-1 gene and to identify different alternative polyadenilation and splicing forms. Moreover, we analyzed the CTSP-1 expression pattern in normal tissues, tumor cell lines and tumor samples. CTSP-1 showed a restricted expression pattern, being expressed only in testis among normal tissues, in different tumor celllines (9/22) and in different tumor types (7 4/178), which matches with the expression pattern of Cancer-Testis antigens. Afterwards, the recombinant CTSP-1 protein was expressed in a heterologous system and used for the generation of polyclonal antibody in mice. This antiboby was used in immunoblotting and immunohistochemistry experiments for the detection of CTSP-1 protein in normal testis and paired normal and tumor samples from breast and prostate. Using immunoblotting, a 22kDa specific band was identified in testis total protein extract, corresponding to the expected molecular weight of the CTSP-1 protein. Using immunohistochemistry, we verified the preferential staining of germ cells and Leydig cells in normal testis. Among tissues with paired normal/tumor samples, only tumor samples were strongly stained. The CTSP-1 recombinant protein was also used in the search for specific antibodies in plasma from cancer patients. Approximately 150 samples were analyzed, of which 20% showed a humoral immune response against the CTSP-1 protein. Taken together, these results confirm that the CTSP-1 gene is a new tumor antigen from the Cancer-Testis category, with restricted expression in testis and tumors and with high immunogenicity in cancer patients (AU)