Purificação da jararagina - C a partir do veneno de Bothrops Jararaca e avaliação da atividade biológica

RESUMO

Dentre todas as toxinas presentes na complexa mistura de um veneno botrópico, sabe-se que as SVMPs (Snake Venom Metalloproteinases) são importantes toxinas envolvidas na patogênese induzida pelo envenenamento. A jararagina-C é uma proteína derivada da autólise da jararagina (SVMP isolada a partir do veneno de Bothrops jararaca) que contém apenas os domínios tipo disintegrina/rico em cisteínas e é capaz de desencadear, em modelo experimental in vivo, os eventos iniciais da resposta inflamatória, como aumento no numero de leucócitos em rolamento na parede do endotélio e liberação local de citocinas pró-inflamatórias. Estudos realizados mais recentemente por nosso grupo com a jararagina-C, em modelo in vitro, demonstram sua ação na migração de células endoteliais e na regulação da expressão de genes envolvidos com o processo de regeneração tecidual, sugerindo um possível papel desta toxina na angiogênese. Na literatura poucas proteínas tipo-disintegrinas estão descritas por apresentar esta atividade angiogênica. O objetivo deste trabalho foi purificar a jararagina-C a partir do veneno de Bothrops jararaca, para avaliar o seu efeito na angiogênese. Para a obtenção desta proteína na sua forma nativa, foram realizados inúmeros procedimentos de purificação por cromatografias de interação hidrofóbica e por troca iônica. A ação biológica da proteína nativa foi analisada em modelos experimentais, como ensaio de ligação ao colágeno em fase sólida e inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno. A quantidade de jararagina-C obtida após o passo de purificação corresponde a aproximadamente 0,3% do veneno bruto, de modo que é necessário realizar várias vezes este processo de purificação para obtenção de uma quantidade significativa desta proteína para conduzir os futuros experimentos de estudo da angiogênese.

ABSTRACT

Among all the toxins present in a complex mixture of Bothrops jararaca venom, it is known that SVMPs (snake venom metalloproteinases) are important toxins involved in the envenoming pathogenesis. Jararhagin-c is the object of our study and it is a protein derived from autolysis of SVMP jararhagin. It contains only the domains disintegrin-like / cysteine-rich and is able to trigger in in vivo experimental model, the initial events of inflammatory responses, such as increasing the number of leukocytes rolling on the endothelial wall and the local release of pro-inflammatory cytokines. Studies in vitro performed more recently by our group with jararhagin-c demonstrated its action inducing the migration of endothelial cells under collagen surface and regulation of genes involved in the tissue healing process, suggesting a possible role of this toxin in angiogenesis. in a few kind-disintegrins proteins literature are described by presenting this angiogenic activity. There are limited studies in the literature with proteins disintegrin-like from snake venoms showing angiogenic activity. The objective of this study was to purify jararhagin-c from the venom of Bothrops jararaca, to isolate a significant amount of this protein to assess their effect on angiogenesis in future experiments. For obtaining this protein in its native form, we performed numerous procedures for purification by hydrophobic interaction chromatography and ion exchange. The biological activity of the native protein was analyzed in experimental models such as the collagen binding in solid phase assay and inhibition of platelet aggregation induced by collagen type I. The amount of jararhagin-c obtained after the purification step corresponds to approximately 0.3% of crude venom, so that it was necessary to repeatedly perform this purification process for obtaining a significant amount of this protein to conduct future angiogenesis experiments.