Desenvolvimento e validação de ferramentas moleculares para análise da resposta imune de primatas Aotus e Saimiri / Development and validation of molecular tools to analyse the immune response in the Aotus and Saimiri neotropical primates monkeys

RESUMO

Os primatas neotropicais Aotus e Saimiri são os modelos recomendados pela OMS para estudos experimentais usando parasitas da malária humana. No entanto, existe uma carência de ferramentas específicas para estudar a resposta imune desses primatas durante o curso de infecção. A PCR quantitativa em tempo real (PCR-TRq) permite avaliar a expressão gênica nesses modelos e, assim, auxiliar no entendimento dos mecanismos imunológicos e geradores de patogenia nessa endemia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenhar, amplificar, sequenciar e analisar fragmentos de genes relacionados à resposta imune de A. infulatus e S. sciureus, para desenhar iniciadores moleculares para PCR-TRq visando à avaliação da expressão desses genes durante imunizações e infecção por P. falciparum. Para esse fim, sequências de DNA humano de 31 moléculas foram obtidas do GenBank para servir como molde para o desenho dos iniciadores usados na PCR convencional e na PCR-TRq e para o sequenciamento de DNA genômico de Aotus e Saimiri. As sequências foram analisadas no aplicativo BioEdit e usadas como molde para desenhar iniciadores específicos para o estudo de expressão gênica por PCR-TRq. Uma cinética de expressão gênica foi realizada estimulando-se células mononucleares do sangue periférico de Saimiri e Aotus com mitógenos por 2, 4, 6, 8, 12 e 18 horas. Depois, os iniciadores específicos foram usados na avaliação de resposta imune em células de baço de macacos Saimiri infectados por P. falciparum cultivadas sob diferentes condições antigênicas. Desse modo, 17 (IFNgama, TNF, LTA, IL2, IL6, IL10, IL12, IL3, IL4, IL5, IL13, TGFbeta2, CD40, CSF2, CCR5, CCR8 , e BAX) dos 31 genes analisados foram amplificados, purificados e sequenciados. Graus de identidade, que variaram de 87% a 100%, foram observados entre as sequências nucleotídicas de Aotus, Saimiri, outros primatas e do homem. As sete moléculas (IFNgama, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF) analisadas nas reações de PCR-TRq mostraram pico de expressão que variou entre seis e 12 horas; constatamos que as hemácias parasitadas corresponderam ao melhor estímulo antigênico. A análise da expressão dessas moléculas em esplenócitos de Saimiri infectados evidenciou uma forte reação inflamatória com sete dias de infecção, quando já se observava uma desestruturação da arquitetura normal nesse órgão. Com 28 dias de infecção, notou-se uma diminuição da expressão desses genes que coincidiu com uma reestruturação da arquitetura do baço, que se apresentava ainda com regiões de congestão da microcirculação e forte deposição de hemozoína. Concluímos que variações de sequência existentes entre espécies correlatas, mesmo que pequenas, podem interferir no reconhecimento de transcritos durante os ensaios de expressão gênica, reforçando a necessidade de se desenvolver ferramentas moleculares específicas para Aotus e Saimiri para avaliação de resposta imune. Finalmente, nossos dados de expressão gênica de citocinas corroboraram aqueles obtidos em estudos com humanos, nos quais uma forte reação inflamatória durante os estágios iniciais de infecção foi seguida por uma inibição dessa resposta, o que corresponde ao padrão de resposta imune importante para o controle do crescimento do parasita e consequente redução das complicações associadas à imunopatogenia.