RESUMO
The gene corresponding to mature PsaA from Streptococcus pneumoniae serotype 14 was cloned into a plasmid with kanamycin resistance and without a purification tag in Escherichia coli to express high levels of the recombinant protein for large-scale production as a potential vaccine candidate or as a carrier for polysaccharide conjugation at Bio-Manguinhos/Fiocruz. The evaluation of induction conditions (IPTG concentration, temperature and time) in E. coli was accomplished by experimental design techniques to enhance the expression level of mature recombinant PsaA (rPsaA). The optimization of induction process conditions led us to perform the recombinant protein induction at 25°C for 16 h, with 0.1mM IPTG in Terrific Broth medium. At these conditions, the level of mature rPsaA expression obtained in E. coli BL21 (DE3) Star by pET28a induction with IPTG was in the range of 0.8 g/L of culture medium, with a 10-fold lower concentration of inducer than usually employed, which contributes to a less expensive process. Mature rPsaA expressed in E. coli BL21 (DE3) Star accounted for approximately 30-35% of the total protein. rPsaA purification by ion exchange allowed the production of high-purity recombinant protein without fusion tags. The results presented in this work confirm that the purified recombinant protein maintains its stability and integrity for long periods of time in various storage conditions (temperatures of 4 or -70°C using different cryoprotectors) and for at least 3 years at 4 or -70°C in PBS. The conformation of the stored protein was confirmed using circular dichroism. Mature rPsaA antigenicity was proven by anti-rPsaA mouse serum recognition through western blot analysis, and no protein degradation was detected after long periods of storage.
Assuntos
Adesinas Bacterianas/biossíntese , Clonagem Molecular/métodos , Lipoproteínas/biossíntese , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Adesinas Bacterianas/química , Adesinas Bacterianas/genética , Western Blotting , Cromatografia por Troca Iônica , Armazenamento de Medicamentos , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Glucose , Isopropiltiogalactosídeo , Lipoproteínas/química , Lipoproteínas/genética , Estabilidade Proteica , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Reprodutibilidade dos Testes , TemperaturaRESUMO
BACKGROUND: Leptospirosis is a zoonose that is increasingly endemic in built-up areas, especially where there are communities living in precarious housing with poor or non-existent sanitation infrastructure. Leptospirosis can kill, for its symptoms are easily confused with those of other diseases. As such, a rapid diagnosis is required so it can be treated effectively. A test for leptospirosis diagnosis using Leptospira Immunoglobulin-like (Lig) proteins is currently at final validation at Fiocruz. RESULTS: In this work, the process for expression of LigB (131-645aa) in E. coli BL21 (DE3)Star™/pAE was evaluated. No significant difference was found for the experiments at two different pre-induction temperatures (28 °C and 37 °C). Then, the strain was cultivated at 37 °C until IPTG addition, followed by induction at 28°C, thereby reducing the overall process time. Under this condition, expression was assessed using central composite design for two variables: cell growth at which LigB (131-645aa) was induced (absorbance at 600 nm between 0.75 and 2.0) and inducer concentration (0.1 mM to 1 mM IPTG). Both variables influenced cell growth and protein expression. Induction at the final exponential growth phase in shaking flasks with Abs(ind) = 2.0 yielded higher cell concentrations and LigB (131-645aa) productivities. IPTG concentration had a negative effect and could be ten-fold lower than the concentration commonly used in molecular biology (1 mM), while keeping expression at similar levels and inducing less damage to cell growth. The expression of LigB (131-645aa) was associated with cell growth. The induction at the end of the exponential phase using 0.1 mM IPTG at 28 °C for 4 h was also performed in microbioreactors, reaching higher cell densities and 970 mg/L protein. LigB (131-645aa) was purified by nickel affinity chromatography with 91% homogeneity. CONCLUSIONS: It was possible to assess the effects and interactions of the induction variables on the expression of soluble LigB (131-645aa) using experimental design, with a view to improving process productivity and reducing the production costs of a rapid test for leptospirosis diagnosis.
Assuntos
Proteínas de Bactérias/genética , Reatores Biológicos , Divisão Celular , Escherichia coli/genética , Leptospira/metabolismo , Temperatura , Cromatografia de AfinidadeRESUMO
A leptospirose é uma das zoonoses mais difundidas pelo mundo de acordo com a OMS. No Brasil, nos últimos 10 anos foram notificados 42.891 casos e 3.762 foram a óbito. Os casos de leptospirose vêm aumentando ao longo dos anos e nesse sentido, nosso grupo vem trabalhando com as proteínas da família Lig (Leptospiral immunoglobulin-like) visando sua utilização como ferramenta para diagnóstico e como candidatas ao desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante. Em 2007, nosso grupo demonstrou o potencial da região não idêntica de LigA (LigANI) como candidata vacinal, já que foi capaz de proteger 67-100% dos animais contra desafio letal. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi otimizar a expressão em cultivo de alta densidade e estabelecer as metodologias para obtenção da proteína recombinante LigANI com alto grau de pureza e homogeneidade e além disso, determinar as características físico-químicas e biológicas da proteína LigANI, uma vez que estas informações são fundamentais para o desenvolvimento de um produto com aplicação bioterapêutica Para tal, realizamos o aumento de escala em biorreator de 80 mL para 2 litros de cultivo e obtivemos 1058 mg de LigANI/L de cultivo. A proteína foi purificada utilizando três passos de cromatografia: afinidade por íons metálicos (IMAC), gel filtração (GF) e troca iônica (IEX) e o rendimento total do processo foi de 219,52 mg de LigANI/litro de cultivo com uma pureza de 99,70 ± 0,24%. Os dados experimentais confirmaram a massa molecular de 66,9 kDa, ponto isoelétrico de 6,94 e estrutura secundária composta predominante por folha \03B2. A proteína LigANI demonstrou a capacidade de aderir a diferentes proteínas de matriz extracelular e ser antigênica frente a soros de pacientes com leptospirose. Além disso, foi demonstrada a reatividade cruzada entre a proteína LigANI de Leptospiras patogênicas de diferentes sorovares a partir de soro hiperimune anti-LigANI de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. Os dados de estabilidade demonstraram que a proteína se manteve estável por 120 dias quando armazenada a -80ºC e liofilizada por 120 dias. Diante do conjunto de dados, demonstramos a viabilidade técnica do uso da proteína LigANI como uma candidata no desenvolvimento de uma vacina contra Leptospirose humana e veterinária.
RESUMO
O gene correspondente à PsaA madura do serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae foi clonado em um plasmídeo com resistência à canamicina e sem um marcador de purificação em Escherichia coli para expressar altos níveis da proteína recombinante para produção em larga escala como potencial candidato a vacina ou como transportador para conjugação de polissacarídeos em Bio-Manguinhos / Fiocruz. A avaliação das condições de indução (concentração de IPTG, temperatura e tempo) em E. coli foi realizada por técnicas de planejamento experimental para aumentar o nível de expressão de PsaA recombinante madura (rPsaA). A otimização das condições do processo de indução nos levou a realizar a indução da proteína recombinante a 25 ° C por 16 h, com 0,1 mM IPTG em meio de caldo Terrific. Nestas condições, o nível de expressão de rPsaA madura obtido em E. coli BL21 (DE3) Star por indução pET28a com IPTG estava na faixa de 0,8 g / L de meio de cultura, com uma concentração 10 vezes menor de indutor do que usualmente empregado , o que contribui para um processo menos dispendioso. O rPsaA maduro expresso em E. coli BL21 (DE3) Star representou aproximadamente 30-35% da proteína total. A purificao de rPsaA por troca iica permitiu a produo de protea recombinante de alta pureza sem etiquetas de fus. Os resultados apresentados neste trabalho confirmam que a proteína recombinante purificada mantém sua estabilidade e integridade por longos períodos de tempo em várias condições de armazenamento (temperaturas de 4 ou -70 ° C usando diferentes crioprotetores) e por pelo menos 3 anos a 4 ou −70 ° C em PBS. A conformação da proteína armazenada foi confirmada usando dicroísmo circular. A antigenicidade rPsaA madura foi comprovada pelo reconhecimento de soro de ratinho anti-rPsaA através de análise de western blot, e não foi detectada degradação de proteína após longos períodos de armazenamento.