RESUMO
The gene corresponding to mature PsaA from Streptococcus pneumoniae serotype 14 was cloned into a plasmid with kanamycin resistance and without a purification tag in Escherichia coli to express high levels of the recombinant protein for large-scale production as a potential vaccine candidate or as a carrier for polysaccharide conjugation at Bio-Manguinhos/Fiocruz. The evaluation of induction conditions (IPTG concentration, temperature and time) in E. coli was accomplished by experimental design techniques to enhance the expression level of mature recombinant PsaA (rPsaA). The optimization of induction process conditions led us to perform the recombinant protein induction at 25°C for 16 h, with 0.1mM IPTG in Terrific Broth medium. At these conditions, the level of mature rPsaA expression obtained in E. coli BL21 (DE3) Star by pET28a induction with IPTG was in the range of 0.8 g/L of culture medium, with a 10-fold lower concentration of inducer than usually employed, which contributes to a less expensive process. Mature rPsaA expressed in E. coli BL21 (DE3) Star accounted for approximately 30-35% of the total protein. rPsaA purification by ion exchange allowed the production of high-purity recombinant protein without fusion tags. The results presented in this work confirm that the purified recombinant protein maintains its stability and integrity for long periods of time in various storage conditions (temperatures of 4 or -70°C using different cryoprotectors) and for at least 3 years at 4 or -70°C in PBS. The conformation of the stored protein was confirmed using circular dichroism. Mature rPsaA antigenicity was proven by anti-rPsaA mouse serum recognition through western blot analysis, and no protein degradation was detected after long periods of storage.
Assuntos
Adesinas Bacterianas/biossíntese , Clonagem Molecular/métodos , Lipoproteínas/biossíntese , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Adesinas Bacterianas/química , Adesinas Bacterianas/genética , Western Blotting , Cromatografia por Troca Iônica , Armazenamento de Medicamentos , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Glucose , Isopropiltiogalactosídeo , Lipoproteínas/química , Lipoproteínas/genética , Estabilidade Proteica , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Reprodutibilidade dos Testes , TemperaturaRESUMO
O gene correspondente à PsaA madura do serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae foi clonado em um plasmídeo com resistência à canamicina e sem um marcador de purificação em Escherichia coli para expressar altos níveis da proteína recombinante para produção em larga escala como potencial candidato a vacina ou como transportador para conjugação de polissacarídeos em Bio-Manguinhos / Fiocruz. A avaliação das condições de indução (concentração de IPTG, temperatura e tempo) em E. coli foi realizada por técnicas de planejamento experimental para aumentar o nível de expressão de PsaA recombinante madura (rPsaA). A otimização das condições do processo de indução nos levou a realizar a indução da proteína recombinante a 25 ° C por 16 h, com 0,1 mM IPTG em meio de caldo Terrific. Nestas condições, o nível de expressão de rPsaA madura obtido em E. coli BL21 (DE3) Star por indução pET28a com IPTG estava na faixa de 0,8 g / L de meio de cultura, com uma concentração 10 vezes menor de indutor do que usualmente empregado , o que contribui para um processo menos dispendioso. O rPsaA maduro expresso em E. coli BL21 (DE3) Star representou aproximadamente 30-35% da proteína total. A purificao de rPsaA por troca iica permitiu a produo de protea recombinante de alta pureza sem etiquetas de fus. Os resultados apresentados neste trabalho confirmam que a proteína recombinante purificada mantém sua estabilidade e integridade por longos períodos de tempo em várias condições de armazenamento (temperaturas de 4 ou -70 ° C usando diferentes crioprotetores) e por pelo menos 3 anos a 4 ou −70 ° C em PBS. A conformação da proteína armazenada foi confirmada usando dicroísmo circular. A antigenicidade rPsaA madura foi comprovada pelo reconhecimento de soro de ratinho anti-rPsaA através de análise de western blot, e não foi detectada degradação de proteína após longos períodos de armazenamento.
Assuntos
Projetos de Pesquisa , Estabilidade ProteicaRESUMO
Apresenta-se neste trabalho a situaçäo da vacinaçäo, produçäo e desenvolvimento tecnológico de vacinas no mundo e no Brasil; também säo feitas algumas reflexöes sobre a complexidade da inovaçäo tecnológica de vacinas e as diversas etapas do processo de desenvolvimento tecnológico requeridas para esse completo desenvolvimento. Descrevem-se várias etapas envolvidas, com análise dos parâmetros e fatores integrantes em cada etapa, os requisitos técnicos de instalaçöes e equipamentos, as normas de boas práticas de fabricaçäo(BPF_), a necessidade organizacional, de infra-estrutura e de gestäo, o longo período e o alto custo demandados para essa atividade.