Aflagellar Epimastigote of Trypanosoma caninum: Biological and Ultrastructural Study of this Atypical Evolutionary Form.

PURPOSE: Trypanosoma caninum exhibits atypical epimastigote forms under axenic conditions. This study aimed to analyze this evolutionary form under different cultivation conditions and provide more information about this evolutionary form. METHODS: We selected a T. caninum isolate with a high percentage of aflagellar epimastigote forms in axenic cultures. Two separate growth curves were generated for T. caninum cultured in Schneider axenic medium and co-cultured with the DH82 cell line, followed by analysis and quantification of evolutionary forms using bright field microscopy. In addition, ultrastructural analysis of T. caninum was performed under both cultivation conditions. RESULTS: The growth curves of T. caninum under axenic and co-cultivation conditions exhibited similar profiles. However, in the axenic culture, the number of parasites was three times higher at the peak of the exponential phase than in the co-culture. In contrast to that in the axenic culture, in which only the epimastigote forms were observed along the entire curve, during co-cultivation with the DH82 cell line, differentiation was observed for the trypomastigote and spheromastigote forms in low proportions. These results demonstrated that when cultured alone, the T. caninum isolate preserved the aflagellar epimastigote form, but in the presence of DH82 canine macrophages, they differentiated into evolutionary forms, particularly trypomastigote forms. Moreover, this study is the first to describe the presence of lipid bodies, structure described as the parasite's nutritional reserve, throughout the body of T. caninum. CONCLUSIONS: These findings describe biological and ultrastructural aspects of epimastigote aflagellar and suggest that this evolutionary form may be involved in the biological cycle of T. caninum, still unknown.

Biological and Genetic Heterogeneity in Trypanosoma dionisii Isolates from Hematophagous and Insectivorous Bats.

This study describes the morphological, biochemical, and molecular differences among Trypanosoma dionisii isolates from hemocultures of hematophagous (Desmodus rotundus; n = 2) and insectivorous (Lonchorhina aurita; n = 1) bats from the Atlantic Rainforest of Rio de Janeiro, Brazil. Fusiform epimastigotes from the hematophagous isolates were elongated, whereas those of the insectivorous isolate were stumpy, reflected in statistically evident differences in the cell body and flagellum lengths. In the hemocultures, a higher percentage of trypomastigote forms (60%) was observed in the hematophagous bat isolates than that in the isolate from the insectivorous bat (4%), which demonstrated globular morphology. Three molecular DNA regions were analyzed: V7V8 (18S rDNA), glycosomal glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene, and mitochondrial cytochrome b gene. The samples were also subjected to multilocus enzyme electrophoresis and random amplified polymorphic DNA analysis. All isolates were identified as T. dionisii by phylogenetic analysis. These sequences were clustered into two separate subgroups with high bootstrap values according to the feeding habits of the bats from which the parasites were isolated. However, other T. dionisii samples from bats with different feeding habits were found in the same branch. These results support the separation of the three isolates into two subgroups, demonstrating that different subpopulations of T. dionisii circulate among bats.

Estudo da interação entre Trypanosoma caninum e células macrofágicas: aspectos morfológicos, biológicos e ultraestruturais

Trypanosoma caninum é um tripanosomatídeo até então isolado apenas da cultura de pele íntegra de cães. No cultivo axênico apresenta as formas evolutivas: epimastigota aflagelar e flagelar, tripomastigota e esferomastigota. Inúmeros aspectos sobre T. caninum ainda precisam ser investigados, dentre eles em relação ao potencial infectivo das formas evolutivas. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar aspectos morfológicos, biológicos e utraestruturais da interação de T. caninum com células macrofágicas in vitro. Inicialmente, foi realizada curva de crescimento, análise e quantificação das formas evolutivas de T. caninum em meio axênico e em cocultivo com a linhagem celular DH82. Em seguida, foi realizada análise ultraestrutural das formas de T. caninum cultivadas em meio axênico e cocultivo com linhagem celular DH82. Com intenção de conhecer o potencial infectivo da forma epimastigota aflagelar foi realizado estudo de interação T. caninum com a linhagem de macrófago canino DH82 e macrófago peritoneal (M\0278) de camundongos BALB/c, em duas condições: em meio DMEM F12 suplementado com SFB e a outra com meio suplementado com BSA. Toda cinética ocorreu em 7 tempos: 15, 30 e 45 minutos e 2, 6 ,24 e 48 horas. A análise da interação foi realizada por microscopia óptica de campo claro (MCC), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET). Para análise quantitativa e estatística foram contabilizados total de células infectadas, com parasitos aderidos e parasitos interiorizados por células infectadas. A curva de crescimento de T. caninum em meio axênico e em cocultivo apresentaram o mesmo perfil, porém no meio axênico foi observada no pico da fase exponencial quase quatro vezes mais parasitos que no cocultivo. Diferente do cultivo axênico, no qual foi observada apenas as formas epimastigotas, durante o cocultivo com a linhagem celular DH82 foi observada diferenciação para forma tripomastigota e esferomastigota. A análise ultraestrutural demonstrou que T. caninum possui estruturas descritas para as espécies de tripanosomatídeos, com destaque para inúmeros corpúsculos lipídicos ao longo do corpo. Em relação a interação T. caninum-macrófagos foram obtidos resultados inéditos: T. caninum é capaz de infectar células, a forma epimastigota aflagelar é infectiva para macrófagos e foi verificada a existência de formas amastigotas de T. caninum. Já no tempo de 15 minutos, a forma epimastigota aflagelar de T. caninum adere e entra nas células, rapidamente, modifica-se para a forma amastigota dentro do vacúolo parasitóforo. Dentro deste vacúolo ocorre divisão de amastigotas. Algumas amastigotas são digeridas pelas células e outras viáveis são liberadas, como observado por MET nos tempos de 45 minutos em interação com M\0278 e no tempo de 6 horas na interação com a linhagem DH82. No meio extracelular, em algumas amastigotas ocorre mudança para epimastigota aflagelar e outras interagem com a célula para reinfecção. Foi observada diferença significativa em relação a infecção entre as duas células e em relação a células nas quais ocorriam adesão e infecção simultaneamente na condição com SFB. Esta dissertação apresenta resultados inéditos sobre o conhecimento dos eventos ocorridos durante a interação T. caninum-células que são úteis no entendimento sobre aspectos biológicos e da relação parasito-hospedeiro.