Avaliação de infecção natural de Flebotomíneos (Díptera: Psychodidae) por Leishmania SPP. empregando ensaios de PCR multiplex e PCR em tempo real

No presente estudo, a metodologia de PCR multiplex seguida de hibridização não radioativa direcionada para a região conservada dos minicículos do kDNA (gênero Leishmania) e para o gene constitutivo cacophony de flebotomíneo (gênero Lutzomyia) foi inicialmente empregada para a avaliação da taxa de infecção natural em flebotomíneos provenientes de diferentes áreas endêmicas de LT e LV do Brasil, as quais apresentam diferentes graus de endemicidade e transmissão para uma ou outra forma da doença. Para a determinação do índice de infecção natural, considerou-se o mínimo de 1 (um) inseto infectado em cada pool positivo. Em Saquarema, foram constituídos polls de Lu. Intermédia (13\2642 / 30\2640) e Lu. Migonei (0\2642 / 3\2640), sendo que nehum grupo de fêmea foi positivo para infecção por Leishmania spp. O mesmo ocorreu em Além Paraíba e Rio Bonito, onde foram coletados exemplares apenas de Lu. Intermédia, totalizando a formação de pools consistindo de 11\2642 / 30\2640 e 8\2642 / 27\2640, respectivamente. No município do Rio de Janeiro foram constituídos polls de Lu. intermedia (27\2642 / 32\2640 ), onde 5/32 (15,6%) grupos de fêmeas forampositivos (dois da localidade Pau da Fome e três de Colônia Juliano Moreira), e Lu. Migonei (8\2642 / 5\2640) com 3/5 (60%) polls de fêmeas positivos (um de Colônia Jmoreira e 2 de Pau da Fome). Os ensaios de hibridização confirmaminfecção por L. (V.) braziliensis nos 8/37 pools positivos, indicando un índice mínimo de infecção natural de cerca de 2% nos flebótomos avaliados. Em Porto Alegre também foram obtidos resultados positivos para infecção por L. (V.) braziliensis em 3/98 (3,1%) grupos de fêmeas de Lu. Neivai e 2/52 correspondentes à Lu. Fischerii (3,8%), representando um índice mínimo de infecção natural de cerca de 0,3% para as duas espécies de flebótomos. Não foram obtidos resultados positivos para os pools de fêmeas de Lu. Migonei (n=28) e Lu. Lanei (n=2) coletados na região. Os resultados de Porto Alegre permitiram confirmar estudos prévios que sugeriram Lu. Neivai como principal vetor de LTA no municipio. Em Corumbá foram formados polls para as espécies Lu. Cruzi (12\2642 / 13\2640) e Lu. Foratinii (6\2642 / 14\2640). Nesse município identificamos infecção por L. Infantum chagasi em 2/13 (15,4%) amostras de fêmeas de Lu. Cruzi e em 1/14 (7,1%) de Lu. Forattinii, representando um índice total de infecção natural de 1,1% (3/27). Os dados obtidos em Corumbá reafirmaram a importância de Lu. Cruzi como principal espécie vetora de LV no município, além de sugerir o papel de Lu. Forattinii como segunda espécie transmissora da doença nesta região. Visando o estudo da estimativa da carga parasitária nos pools de fêmeas que foram positivos pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização, padronizamos a metodologia de PRC em tempo real, utilizando o sistema de detecção SYBR Green (para os dois alvos separadamente \2013 cacophony e kDNA), o qual nos permitiu detectar, quantificar e também diferenciar os parasitos no nível de subgênero, através da curva de dissociação dos produtos amplificados dos kDNA. Em relação às amostras provenientes de Corumbá, os polls positivosapresentaram uma quantificação de cerca de 100 parasitos/pool (2 de Lu. Cruzi e 1 de Lu. Foratinii). Além desses, dois novos polls de Lu. Foratinii foram positivos, com cerca de 10 e 1 parasitos cada. Em Porto Alegra, dos 5 pools positivos pela PCR multiplex, 3 foram quantificados com cerca de 100 parasitos (2 Lu. Neivai e 1 Lu fischerii), os outros 2 apresentaram uma média de 10 parasitos (1 lu. Neivai e 1 Lu. Fischeri). As amostras coletadas no Rio de Janeiro apresentaram uma quantidade média de 10 parasitos cada (4 de Lu. Intermedia e 3 de Lu. Migonei), sendo que um polls de Lu. Intermedia positivo pelo diagnóstico qualitativo não pôde ser avaliado quantitativamente. A análise das curvas de dissociação para a determinação dos valores de Tm dos produtos amplificados do kDNA de promastigotas de L. (V.) braziliensis e L. (L.)chagasi, corroboraram os resultados prévios de diagnóstico pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização. Investigações diagnósticasque possibilitem a detecção, correta identificação e quantificação de carga parasitária por Leishmania spp na fauna flebotomínea em áreas com notificações de LTA e/ou LVA em humanos ou reservatórios animais, certamente contribuem para uma maior visão do quadro de veiculação das espécies de parasitos nas distintas áreas, fornecendo dados importantes para a compreensão da eco-epidemiologia dessas doenças nas respectivas áreas

Avaliação de infecção natural de flebotomíneos (Díptera: Psychodidae) por Leishmania spp. empregando ensaios de PCR multiplex e PCR em tempo real / Evaluation of natural infection of sandflies (Diptera: Psychodidae) with Leishmania spp. using multiplex PCR assays and real time PCR

No presente estudo, a metodologia de PCR multiplex seguida de hibridização não radioativa direcionada para a região conservada dos minicículos do kDNA (gênero Leishmania) e para o gene constitutivo cacophony de flebotomíneo (gênero Lutzomyia) foi inicialmente empregada para a avaliação da taxa de infecção natural em flebotomíneos provenientes de diferentes áreas endêmicas de LT e LV do Brasil, as quais apresentam diferentes graus de endemicidade e transmissão para uma ou outra forma da doença. Para a determinação do índice de infecção natural, considerou-se o mínimo de 1 (um) inseto infectado em cada pool positivo. Em Saquarema, foram constituídos pools de Lu. Intermédia (13/ 30) e Lu. Migonei (0 / 3), sendo que nehum grupo de fêmea foi positivo para infecção por Leishmania spp. O mesmo ocorreu em Além Paraíba e Rio Bonito, onde foram coletados exemplares apenas de Lu. Intermédia, totalizando a formação de pools consistindo de 11 / 30 e 8 / 27 respectivamente. No município do Rio de Janeiro foram constituídos polls de Lu. intermedia (27 / 32 ), onde 5/32 (15,6por cento) grupos de fêmeas foram positivos (dois da localidade Pau da Fome e três de Colônia Juliano Moreira), e Lu. Migonei (8 / 5) com 3/5 (60por cento) polls de fêmeas positivos (um de Colônia Jmoreira e 2 de Pau da Fome). Os ensaios de hibridização confirmam infecção por L. (V.) braziliensis nos 8/37 pools positivos, indicando um índice mínimo de infecção natural de cerca de 2por cento nos flebótomos avaliados. Em Porto Alegre também foram obtidos resultados positivos para infecção por L. (V.) braziliensis em 3/98 (3,1por cento) grupos de fêmeas de Lu. Neivai e 2/52 correspondentes à Lu. Fischerii (3,8por cento), representando um índice mínimo de infecção natural de cerca de 0,3por cento para as duas espécies de flebótomos. Não foram obtidos resultados positivos para os pools de fêmeas de Lu. Migonei (n=28) e Lu. Lanei (n=2) coletados na região. Os resultados de Porto Alegre permitiram confirmar estudos prévios que sugeriram Lu. Neivai como principal vetor de LTA no municipio. Em Corumbá foram formados polls para as espécies Lu. Cruzi (12 / 13) e Lu. Foratinii (6 / 14). Nesse município identificamos infecção por L. Infantum chagasi em 2/13 (15,4por cento) amostras de fêmeas de Lu. Cruzi e em 1/14 (7,1por cento) de Lu. Forattinii, representando um índice total de infecção natural de 1,1por cento (3/27). Os dados obtidos em Corumbá reafirmaram a importância de Lu. Cruzi como principal espécie vetora de LV no município, além de sugerir o papel de Lu. Forattinii como segunda espécie transmissora da doença nesta região. Visando o estudo da estimativa da carga parasitária nos pools de fêmeas que foram positivos pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização, padronizamos a metodologia de PRC em tempo real, utilizando o sistema de detecção SYBR Green (para os dois alvos separadamente – cacophony e kDNA), o qual nos permitiu detectar, quantificar e também diferenciar os parasitos no nível de subgênero, através da curva de dissociação dos produtos amplificados dos kDNA. Em relação às amostras provenientes de Corumbá, os polls positivos apresentaram uma quantificação de cerca de 100 parasitos/pool (2 de Lu. Cruzi e 1 de Lu. Foratinii). Além desses, dois novos polls de Lu. Foratinii foram positivos, com cerca de 10 e 1 parasitos cada. Em Porto Alegre, dos 5 pools positivos pela PCR multiplex, 3 foram quantificados com cerca de 100 parasitos (2 Lu. Neivai e 1 Lu fischerii), os outros 2 apresentaram uma média de 10 parasitos (1 Lu. Neivai e 1 Lu. Fischeri). As amostras coletadas no Rio de Janeiro apresentaram uma quantidade média de 10 parasitos cada (4 de Lu. Intermedia e 3 de Lu. Migonei), sendo que um polls de Lu. Intermedia positivo pelo diagnóstico qualitativo não pôde ser avaliado quantitativamente. A análise das curvas de dissociação para a determinação dos valores de Tm dos produtos amplificados do kDNA de promastigotas de L. (V.) braziliensis e L. (L.)chagasi, corroboraram os resultados prévios de diagnóstico pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização. Investigações diagnósticas que possibilitem a detecção, correta identificação e quantificação de carga parasitária por Leishmania spp na fauna flebotomínea em áreas com notificações de LTA e/ou LVA em humanos ou reservatórios animais, certamente contribuem para uma maior visão do quadro de veiculação das espécies de parasitos nas distintas áreas, fornecendo dados importantes para a compreensão da eco-epidemiologia dessas doenças nas respectivas áreas.

Implementação da PCR multiplex associada à hibridização não-radioativa na detecção de DNA de Leishmania subgênero Viannia em flebótomos vetores das leishmanioses / Implementation of the PCR multiplex associated with the non-radioactive hybridization in the detention of DNA the Viannia subgenus of Leishmania in vectors phlebotomus of leishmaniasis

Entre as Leishmania do subgênero Viannia a L.braziliensis é a única incriminada como agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana(LTA)no Rio de Janeiro, cuja transmissão é veiculada por flebótomos do gênero Lutzomyia,principalmente a L.intermedia.A avaliação da taxa...desta doença.Neste trabalho foi proposta uma metodologia molecular para a detecção de DNA de Leishmania do subgênero Viannia em flebótomos através de um ensaio de PCR multiplex associado à hibridização não radioativa,para o qual foram empregados 2 pares de primes,sendo um específico para o gênero Leishmania e o outro para o gênero Lutzomyia,funcionando este como controle interno da reação.Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose corado com brometo de etídeo,e submetidos a uma etapa posterior de hibridização com sonda biotinilada específica para o subgênero Viannia,revelada por ensaio enzimático.Os resultados obtidos a partir de amostras reconstituídas em 2 tipos de formulações(1–diferentes concentrações de DNA do parasito + 10 flebótomos;2–quantidades crescentes de promastigotas + 10 flebótomos)foram adequados para inferir sobre a sensibilidade da técnica.O passo seguinte foi o de validar o método proposto,inicialmente através da utilização de fêmeas de flebótomos alimentadas com sangue reconstituído contendo promastigotas de L.(V.)braziliensis.Posteriormente,avaliamos amostras de flebótomos do campo provenientes de 5 localidades do Município do Rio de Janeiro com casos recentes de leishmaniose canina e humana:Pau da Fome,Colônia Juliano Moreira,Lameirão Pequeno,Cabuçu e Cachamorra.Das espécies coletadas no período de março a dezembro de 2003,L. intermedia(78,34por cento)predominou sobre L.migonei (12,9por cento)seguida de L.longipalpis(8,29por cento)e L.cortelezzi(0,69por cento).Uma amostragem de fêmeas (n=400)foi separada em grupos de 10 exemplares(n=40)da mesma espécie e avaliada pela técnica proposta,sendo estes constituídos por L.intermedia(n=32);L.migonei (n=5);L.longipalpis(n=2);L.cortellezzii(n=1).As espécies de flebótomos positivas foram apenas L.intermedia(5/32) e L migonei(3/5),coletadas nas localidades de Pau da Fome e Colônia Juliano Moreira,cujos índices de infecção por espécie não apresentaram diferença significativa nas 2 áreas(p=0,8379).Considerando a totalidade de 8 grupos infectados(8/40)e que pelo menos um inseto estava positivo em cada grupo,foi possível inferir que o índice de infecção dos espécimes avaliados foi de 2por cento (8/400).