Estudo do papel do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I (IGF-I) na modulação funcional de macrófagos infectados pelo Mycobacterium leprae

Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOS O bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-\F067 medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro. Finalmente, a análise imuno-histoquímica de lesões cutâneas de pacientes lepromatosos (LL) revelou uma expressão abundante de IGF-I por macrófagos espumosos altamente infectados Além disso, uma alta expressão da proteína Supressora de sinalização de viii citocinas 3 (SOCS3) e diminuição a ativação STAT1 foi observada em lesões LL, em comparação com lesões tuberculóide BT. Esses resultados sugerem que o IGF-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente s mecanismos microbicidas do hospedeiro durante a infecção

Estudo do papel do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I (IGF-I) na modulação funcional de macrófagos infectados pelo Mycobacterium leprae / Study of the role of growth factor insulin-like (IGF-I) in the functional modulation of macrophages infected with Mycobacterium leprae

Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOSO bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-gama medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro.

Finalmente, a análise imuno-histoquímica de lesões cutâneas de pacientes lepromatosos (LL) revelou uma expressão abundante de IGF-I por macrófagos espumosos altamente infectadosAlém disso, uma alta expressão da proteína Supressora de sinalização de viii citocinas 3 (SOCS3) e diminuição a ativação STAT1 foi observada em lesões LL, em comparação com lesões tuberculóide BT. Esses resultados sugerem que o IGF-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente s mecanismos microbicidas do hospedeiro durante a infecção. (AU)

Mononuclear phagocytes are targeted cells for pathogenic mycobacteria thatgenerally require afavorable intracellular environment in wich they survive and replicate. Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy, is able to subvert macrophage microbicidal mechanisms and survive and replicate within these cells. However, the molecular mechanism involved in pathogen driven host cellmodulation is not fully understood. The present study investigated the potential role of insulin-like growth factor-I (IGF-I) in M. leprae pathogenesis. We showed that M.leprae induces IGF-I expression in RAW 264.7 macrophages in a dose-dependent manner. Notably, only when cells were treated with a neutralizing antibody to IGFtype 1 receptor (IGF-1R), M. leprae infection was able to upregulate inducible nitricoxide sintase (iNOS) expression in RAW cells or to activate the iNOS promoter incells transfected with the iNOS-luciferase reporter construct. . The blockage ofIGF-I signaling also decreased the intracellular M. leprae viability as measured byqPCR. Moreover, RAW cells pre-treated with IGF-I showed a significant reduction in iNOS promoter activity in response to Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis with subsequent increase in bacterial intracellular survival as accessed by colony-forming unit counts (CFU). Of note, IGF-I was able to attenuate interferon gamma (IFN-gama ) activating effects on macrophages asacessed by iNOS expression and quantification of phosphorylated SignalTransducers and Activators of Transcription 1 (p-STAT1). Additionally, IGF-I was able to induce PGE2 secretion in murine macrophages, an eicosanoid previously implicated in mycobacterial persistence in the host. Finally, immunohistochemicalanalysis of skin lesions of lepromatous leprosy (LL) patients revealed an abundantexpression of IGF-I by highly infected foamy macrophages.

Moreover, LL lesions revealed higher expression of Suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3), as well as decreased levels of p-STAT1 when compared to borderline tuberculoid (BT)lesions. Altogether, our data suggest that IGF-I produced by macrophages inresponse to M. leprae infection constitutes a critical regulator in subverting the immune response in leprosy. (AU)

Estudo do papel do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I (IGF-I) na modulação funcional de macrófagos infectados pelo Mycobacterium leprae / Study of the role of growth factor insulin-like (IGF-I) in the functional modulation of macrophages infected with Mycobacterium leprae

Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOSO bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-gama medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro...

Mononuclear phagocytes are targeted cells for pathogenic mycobacteria thatgenerally require afavorable intracellular environment in wich they survive and replicate. Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy, is able to subvert macrophage microbicidal mechanisms and survive and replicate within these cells. However, the molecular mechanism involved in pathogen driven host cellmodulation is not fully understood. The present study investigated the potential role of insulin-like growth factor-I (IGF-I) in M. leprae pathogenesis. We showed that M.leprae induces IGF-I expression in RAW 264.7 macrophages in a dose-dependent manner. Notably, only when cells were treated with a neutralizing antibody to IGFtype 1 receptor (IGF-1R), M. leprae infection was able to upregulate inducible nitricoxide sintase (iNOS) expression in RAW cells or to activate the iNOS promoter incells transfected with the iNOS-luciferase reporter construct. . The blockage ofIGF-I signaling also decreased the intracellular M. leprae viability as measured byqPCR. Moreover, RAW cells pre-treated with IGF-I showed a significant reduction in iNOS promoter activity in response to Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis with subsequent increase in bacterial intracellular survival as accessed by colony-forming unit counts (CFU). Of note, IGF-I was able to attenuate interferon gamma (IFN-gama ) activating effects on macrophages asacessed by iNOS expression and quantification of phosphorylated SignalTransducers and Activators of Transcription 1 (p-STAT1). Additionally, IGF-I was able to induce PGE2 secretion in murine macrophages, an eicosanoid previously implicated in mycobacterial persistence in the host. Finally, immunohistochemicalanalysis of skin lesions of lepromatous leprosy (LL) patients revealed an abundantexpression of IGF-I by highly infected foamy macrophages...

Análise da produção do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I (IGF-I) e seu efeito na geração de óxido nítrico em macrófagos estimulados com micobactérias

Fagócitos mononucleares são células alvo para micobactérias patogênicas como M. tuberculosise M. leprae. Essas micobactérias têm a capacidade de modular os mecanismos microbicidas dos macrófagos, sobreviver e replicar nessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido nesta desativação não é totalmente compreendido. Dados do nosso laboratório têm demonstrado que o M. lepraeé capaz de induzir a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina I um hormônio com efeito anti-apoptotico ecom atividade de proliferação ­ em Células de Schwann humanas. Recentemente, foi relatado que IGF-I é capaz de inibir a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e conseqüentemente a produção de óxido nítrico em macrófagos induzido por Leshimania amazonensis. Baseado nestes dados, nós temos investigado o envolvimento do IGF-I na desativação dos macrófagosobservada na infecção micobacteriana. Com este propósito, macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 foram estimulados ou não com M. lepraee a expressão de IGF-I foi monitorada através de RT-PCR quantitativo e ensaio imunoenzimático específico, ELISA. Duas outras espécies de micobactérias, M. bovisBCG e M. smegmatis, respectivamente, uma cepa atenuada de M. bovise uma micobactéria não-patogênica, foram testadas para comparação. O estímulo com M. lepraeou BCG, em contraste com M. smegmatis, regulou positivamente a expressão de RNAm para IGF-I e aumento significantemente os níveis daproteína quando comparado com a cultura controle. Além disso, nós também investigamos o efeito do IGF-I na produção de NO e na expressão de iNOS induzida por micobactérias em macrófagos RAW 264.7. A produção de NO foi monitorada pela determinação da concentração de nitrito no sobrenadante em meio de cultura, utilizando reagente de Griess e a expressão de iNOS monitorada por Western Blot. M. lepraefoi um fraco estimulo para indução de iNOS. Em contraste, BCG e M. smegmatis induziram a expressão e, como conseqüência, uma significantiva produção de NO em macrófagos RAW. Interessantemente, células pré-tratadas com IGF-I mostraram uma significantiva redução na produção denitrito após a estímulo com micobactérias, o que correlacionou com uma regulação negativa da expressão de iNOS. Além disso, IGF-I foi capaz de reduzir parcialmente a produção de NO induzida por IFN-γrecombinante. Esses resultados sugerem que o IGF-Ipode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente a resposta imune inata durante a infecção.

Análise da expressão do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I (IGF-I) e seu efeito na produção de óxido nítrico em macrófagos estimulados com micobactérias / Expression Analysis of Growth Factor Insulin-like-I (IGF-I) and its effect on nitric oxide production in macrophages stimulated with mycobacterial

Fagócitos mononucleares são células alvo para micobactérias patogênicas como M. tuberculosis e M. leprae. Essas micobactérias têm a capacidade de modular os mecanismos microbicidas dos macrófagos, sobreviver e replicar nessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido nesta desativação não é totalmente compreendido. Dados do nosso laboratório têm demonstrado que o M. leprae é capaz de induzir a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina I um hormônio com efeito anti-apoptotico e com atividade de proliferação – em Células de Schwann humanas. Recentemente, foi relatado que IGF-I é capaz de inibir a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e consequentemente a produção de óxido nítrico em macrófagos induzido por Leishimania amazonensis. Baseado nestes dados, nós temos investigado o envolvimento do IGF-I na desativação dos macrófagos observada na infecção micobacteriana. Com este propósito, macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 foram estimulados ou não com M. leprae e a expressão de IGF-I foi monitorada através de RT-PCR quantitativo e ensaio imunoenzimático específico, ELISA. Duas outras espécies de micobactérias, M bovis BCG e M. smegmatis, respectivamente, uma cepa atenuada de M. bovis e uma micobactéria não-patogênica, foram testadas para comparação. O estímulo com M. leprae ou BCG, em contraste com M. smegmatis, regulou positivamente a expressão de RNAm para IGF-I e aumento significantemente os níveis da proteína quando comparado com a cultura controle. Além disso, nós também investigamos o efeito do IGF-I na produção de NO e na expressão de iNOS induzida por micobactérias em macrófagos RAW 264.7. A produção de NO foi monitorada pela determinação da concentração de nitrito no sobrenadante em meio de cultura, utilizando reagente de Griess e a expressão de iNOS monitorada por Western Blot. M. leprae foi um fraco estimulo para indução de iNOS. Em contraste, BCG e M. smegmatis induziram a expressão e, como consequência, uma significativa produção de NO em macrófagos RAW. Interessantemente, células pré-tratadas com IGF-I mostraram uma significativa redução na produção de nitrito após a estímulo com micobactérias, o que correlacionou com uma regulação negativa da expressão de iNOS. Além disso, IGF-I foi capaz de reduzir parcialmente a produção de NO induzida por IFN-gama recombinantes. Esses resultados sugerem que o IFG-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente a resposta imune inata duração a infecção.