Estudo do efeito da autofagia sobre a endocitose e a adesão celular em macrófago murino in vitro / Study of autophagy the effect on endocytosis and cell adhesion in a murine macrophage in vitro

INTRODUÇÃO: A influência da autofagia em processos celulares que participam da homeostase celular, como a endocitose e a adesão celular, até o momento, foi pouco estudada. A endocitose consiste na internalização de material extracelular,quando as vesículas endocíticas são menores que 500nm é chamada de endocitose em microescala e quando as vesículas formadas são maiores que essa medida trata-se de endocitose em macroescala. Foi demonstrado que a conexão da via endocítica com a via autofágica é fundamental para a degradação de material citosólico e, subsequente, produção de energia e disponibilização de substrato para o metabolismo celular. Estudos controversos da literatura mostraram que a autofagia pode favorecer ou não interferir com a endocitose em macroescala. Além disso, alguns trabalhos demonstraram que o processo autofágico foi capaz de reduzir a reciclagem de integrinas para a membrana plasmática por alterar a endocitose em microescala envolvida na internalização desse tipo de proteína, reduzindo a capacidade de adesão e, consequentemente, a migração celular. Assim, em conjunto, esses achados evidenciam que a autofagia pode interagir e interferir com eventos celulares dependentes da participação da membrana plasmática como a endocitose e a adesão celular.OBJETIVO: No presente estudo, hipotetizamos que a prévia indução de autofagia em macrófagos é capaz de reduzir a endocitose em micro e macroescala, além de reduzir a capacidade de adesão celular. Desta forma, o objetivo desse estudo foi determinar o efeito da indução de autofagia, in vitro, sobre a endocitose e a adesão de macrófagos murino. MATERIAL E MÉTODOS: Macrófagos foram induzidos à autofagia por privação de nutrientes (starvation) ou pelo tratamento com um indutor farmacológico, a rapamicina, seguida da exposição a macromoléculas ou grandes partículas de diferentes naturezas. Além disso, após indução de autofagia, macrófagos em suspensão foram incubados em superfícies como o vidro ou uma matriz de colágeno e fibronectina para avaliação da capacidade de adesão.Os percentuais de endocitose em microescala, em macroescala e de adesão foram estimados. RESULTADOS: Mostramos que a indução de autofagia promoveu redução da capacidade fagocítica em cerca de 60% no percentual de macrófagos que internalizam grandes partículas, como levedo, sendo um mecanismo precoce e reversível. Ao passo que a indução de autofagia por privação de aminoácidos ou farmacológica não interferiu na endocitose em microescala. A indução de autofagia não alterou a endocitose de transferrina (endocitose mediada por receptores) e endocitose de BSA (endocitose de fase fluida). Em contraste, a indução de autofagia promoveu redução em aproximadamente 70% da quantidade de macrófagos que aderem a matriz de colágeno e fibronectina. Uma possível explicação para a redução da endocitose em macroescala pode estar relacionada à autofagia diminuir a disponibilidade de grandes extensões de membrana necessárias à internalização de partículas ma iores que 500nm. Alternativamente, a indução de autofagia pode estar levando a célula a uma indisponibilidade de receptores na membrana plasmática que justificaria a redução da capacidade fagocítica e de adesão do 11 macrófago murino. CONCLUSÕES: A indução de autofagia diminui a capacidade fagocítica e a capacidade de adesão do macrófago murino.

INTRODUCTION: The influence of autophagy on cellular processes that participate in cellular homeostasis, such as endocytosis and cell adhesion has been poorly evaluated. Endocytosis consists in the internalization of extracellular material and includes microscale endocytosis, when endocytic vesicles are smaller than 500nm, and macroscale endocytosis, when the formed vesicles are larger than this measure. It has been shown that the connection between the endocytic and the autophagic pathways is essential for degradation of cytosolic material and, subsequently, power generation and provision of substrate for cellular metabolism. Controversial studies showed that autophagy can improve or do not interfere with macroscale endocytosis. Furthermore, some studies demonstrated that the autophagic process reduced integrin recycling to the plasma membrane through the modulation of microscale endocytosis involved in the internalization of this protein, reducing cell adhesion and migration. Taken together, these findings show that autophagy can interact and interfere with cellular events that depend on plasma membrane participation, such as endocytosis and cell adhesion. OBJECTIVES: In the present study, we hypothesized that prior autophagy induction in macrophage reduces micro and macroscale endocytosis, as well as cell adhesion. Thus, the aim of this study was to determine the effect of autophagy induction, in vitro, on endocytosis and adhesion of murine macrophages. MATERIAL AND METHODS: Autophagy by nutrient deprivation (starvation) or by treatment with an inducer drug, rapamycin, was induced in macrophages, followed by exposure to macromolecules or large particles of different natures. Furthermore, after autophagic induction, macrophages were plated on different surfaces like glass or collagen-fibronectin matrix to evaluate cell adhesiveness. After that, the percentage of endocytosis in micro and macroscale and adhesion were determined...

17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.

BACKGROUND: Leishmaniasis is a neglected endemic disease with a broad spectrum of clinical manifestations. Pentavalent antimonials have been the treatment of choice for the past 70 years and, due to the emergence of resistant cases, the efficacy of these drugs has come under scrutiny. Second-line drugs are less efficacious, cause a range of side effects and can be costly. The formulation of new generations of drugs, especially in developing countries, has become mandatory. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: We investigated the anti-leishmanial effect of 17-(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), an HSP90 inhibitor, in vitro. This inhibitor is currently in clinical trials for cancer treatment; however, its effects against intracellular Leishmania remain untested. Macrophages infected with L. amazonensis were treated with 17-AAG (25-500 nM) and parasite load was quantified using optical microscopy. Parasite load declined in 17-AAG-treated macrophages in a dose- and time-dependent manner. Intracellular parasite death became irreversible after 4 h of treatment with 17-AAG, and occurred independent of nitric oxide (NO) and superoxide (O(2) (-)) production. Additionally, intracellular parasite viability was severely reduced after 48 h of treatment. Interestingly, treatment with 17-AAG reduced pro-inflammatory mediator production, including TNF-α, IL-6 and MCP-1, yet IL-12 remained unaffected. Electron microscopy revealed morphological alterations, such as double-membrane vacuoles and myelin figures at 24 and 48 h after 17-AAG treatment. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: The HSP90 inhibitor, 17-AAG, possesses high potency under low dosage and reduces both pro-inflammatory and oxidative molecule production. Therefore, further studies are warranted to investigate this inhibitor's potential in the development of new generations of anti-leishmanials.

Phagocytosis is inhibited by autophagic induction in murine macrophages.

Recent studies have demonstrated that communication takes place between the autophagic and phagocytic pathways, indicating that the convergence of these two pathways plays an important role in the innate immune response against intracellular microbes. The present study investigated the effect of autophagic induction on the phagocytic capacity of murine macrophages. Autophagy induced by physiological and pharmacological means was shown to reduce the phagocytic capacity of murine macrophages, regardless of cell origin or the nature of the phagocytosed particles themselves. This autophagic inhibitory effect on phagocytosis was shown to be an early and reversible event that results in no loss of cell viability. Furthermore, the data presented herein demonstrate that the induction of autophagy does not affect a macrophage's capacity to recognize and bind to particles, indicating that autophagy does not inhibit the particle recognition process, even though particle internalization is suppressed. The findings herein support the notion that phagocytosis and autophagy may be interdependent and complementary processes.

Efeito da autofagia sobre a capacidade fagocítica e sobre a infecção de macrófagos de camundongos CBA/J por Leishmania amazonensis / Effect of autophagy on phagocytic capacity and the infection of macrophages from CBA /J mice by Leishmania amazonensis

A autofagia vem sendo alvo de estudos que demonstram sua participação em infecções por diversos patógenos intracelulares. A depender do patógeno, a autofagia pode facilitar a sobrevivência intracelular do patógeno ou pode funcionar como controle da infecção pela célula hospedeira. Pouco se sabe sobre a participação da autofagia na infecção por Leishmanía. Foi demonstrado que o vacúolo parasitóforo induzido por L. mexícana adquire nutrientes citosólicos por microautofagia. Além disso, recentemente foi demonstrado que a indução de autofagia promove aumento da carga parasitária de L. amazonensís em macrófagos infectados. Esses dados sugerem a participação do processo autofágico no estabelecimento da infecção por Leishmanía, como um mecanismo que favorece a sobrevivência intracelular do parasito. Assim, o objetivo desse estudo foi determinar a influência da autofagia na infecção, in vitro, de macrófagos de camundongos CBA/J por L. amazonensís. Macrófagos foram induzidos à autofagia por duas formas, fisiológica ou farmacológica, após ou antes da infecção por L. amazonensís ou exposição a partículas de levedo ou zimosan. O percentual de infecção e de fagocitose foi estimado. Os resultados mostram que a indução de autofagia, após a infecção, não altera o percentual de macrófagos infectados, mas promove o aumento na carga parasitária de macrófagos infectados por L. amazonensís. Além disso, a prévia indução de autofagia promove a inibição da capacidade fagocítica do macrófago murino. Estudos adicionais serão realizados no intuito de esclarecer os mecanismos pelos quais a indução de autofagia favorece a infecção por L. amazonensís e altera a capacidade fagocítica do macrófago murino.