Mapping Genetic Markers Associated with Antigenicity and Host Range in H9N2 Influenza A Viruses Infecting Poultry in Pakistan.

The aim of the current study was to map the genetic diversity in the haemagglutinin (HA) glycoprotein of influenza A viruses (IAVs) of the H9N2 subtype. Twenty-five H9N2 IAVs were isolated from broiler chickens from March to July 2019. The HA gene was amplified, and phylogenetic analysis was performed to determine the evolutionary relationship. Important antigenic amino acid residues of HA attributed to immune escape and zoonotic potential were compared among H9N2 IAVs. Phylogenetic analysis revealed that sublineage B2 under the G1 lineage in Pakistan was found to be diversified, and newly sequenced H9N2 isolates were nested into two clades (A and B). Mutations linked to the antigenic variation and potential immune escape were observed as G72E (1/25, 4%), A180T (3/25, 12%), and A180V (1/25, 4%). A twofold significant reduction (P < 0.01) in log2 hemagglutination inhibition titers was observed with H9N2 IAV naturally harboring amino acid V180 instead of A180 in HA protein. Moreover, in the last 20 years, complete substitution at residues (T127D, D135N, and L150N) and partial substitution at residues (72, 74, 131, 148, 180, 183, 188, 216, 217, and 249, mature H9 HA numbering) associated with changes in antigenicity were observed. The presence of L216 in all H9N2 IAV isolates and T/V180 in four isolates in the receptor-binding site reveals the potential of these viruses to cross the species barrier to infect human or mammals. The current study observed the circulation of antigenically diverse H9N2 IAV variants that possess potential mutations that can escape the host immune system.

Nota de investigación- Mapeo de marcadores genéticos asociados con la antigenicidad y el rango de huéspedes en los virus de la influenza tipo A subtipo H9N2 que infectan a la avicultura en Pakistán. El objetivo del presente estudio fue mapear la diversidad genética en la glicoproteína hemaglutinina (HA) de los virus de la influenza A (IAV) del subtipo H9N2. Se aislaron veinticinco virus de influenza H9N2 de pollos de engorde de marzo a julio del 2019. Se amplificó el gene HA y se realizó un análisis filogenético para determinar la relación evolutiva. Se compararon importantes residuos de aminoácidos antigénicos de la hemaglutinina atribuidos al escape inmunológico y al potencial zoonótico entre los virus de la influenza aviar H9N2. El análisis filogenético reveló que el sublinaje B2 bajo el linaje G1 en Pakistán estaba diversificado, y los aislados de H9N2 recién secuenciados se agruparon en dos clados (A y B). Se observaron mutaciones relacionadas con la variación antigénica y el posible escape inmunológico como los residuos de aminoácidos G72E (1/25, 4%), A180T (3/25, 12%) y A180V (1/25, 4%). Se observó una reducción significativa al doble (P < 0.01) en los títulos de inhibición de la hemaglutinación log2 cuando el virus de la influenza aviar H9N2 albergaba naturalmente el aminoácido V180 en lugar del A180 en la proteína HA. Además, en los últimos 20 años, sustitución completa en los residuos (T127D, D135N y L150N) y sustitución parcial en los residuos (72, 74, 131, 148, 180, 183, 188, 216, 217 y 249, de acuerdo con la numeración de la HA subtipo madura) asociados con cambios en la antigenicidad. La presencia del residuo L216 en todos los aislados de influenza aviar H9N2 y T/V180 en cuatro aislados en el sitio de unión al receptor revela el potencial de estos virus para cruzar la barrera de las especies para infectar a humanos o mamíferos. El estudio actual observó la circulación de variantes antigénicamente diversas del virus de influenza aviar H9N2 que poseen mutaciones potenciales que pueden escapar del sistema inmunológico del huésped.

Rate of Multiple Viral and Bacterial CoInfection(s) in Influenza A/H9N2-Infected Broiler Flocks.

Repeated cases of low pathogenic influenza A/H9N2 virus (IAV/H9N2) have been reported in commercial chickens since its emergence in 1998 in Pakistan. However, recently increased mortality and severe respiratory complications under field conditions have been noticed, suggesting concomitant influenza infections with respiratory viral and/or bacterial pathogens. Therefore, the present study aimed to investigate the presence of IAV/H9N2 coinfecting with multiple viral and bacterial pathogens in broiler chicken flocks. We surveyed 60 broiler flocks with respiratory signs from March through July 2019 in Punjab, Pakistan. Suspected flocks were screened for the presence of IAV using a lateral-flow device. Tracheal, cloacal, and bone marrow samples were collected and further tested for seven viral agents (chicken anemia; Newcastle disease; infectious bronchitis; infectious laryngeotracheitis [ILT]; and IAV subtypes H9, H7, and H5) and three bacterial agents (Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma synovae; Ornithobacterium rhinotracheale [ORT]) using PCR assays. Upon initial screening for IAV, 35/60 (58.3%) flocks tested positive. The coinfection of IAV/H9N2 with other pathogens was detected in 25 (71.4%) flocks and only IAV/H9N2 was detected in 10 (28.6%) flocks out of total positive IAV flocks (n = 35). IAV subtypes H5 and H7, ILT, and ORT were not detected throughout the study period. The detection rate of double, triple, and quadruple combinations of coinfections with IAV/H9N2 were 37% (13 flocks), 26% (9 flocks), 9% (3 flocks), respectively. Higher average mortality (28.5%) was found in broiler chicken flocks coinfected with viral and/or bacterial pathogens than in flocks where only H9 low pathogenic IAV/H9N2 was detected (20.8%). In conclusion, higher circulation of IAV/H9N2 with other viral and bacterial pathogens may contribute to higher production and economic losses at the farm level.

Nota de investigación- Tasa de coinfecciones virales y bacterianas múltiples en parvadas de pollos de engorde infectadas con virus influenza A/H9N2. Se han reportado varios casos del virus de influenza A de baja patogenicidad H9N2 (IAV/H9N2) en pollos comerciales desde su aparición en 1998 en Pakistán. Sin embargo, recientemente se ha observado un aumento de la mortalidad y complicaciones respiratorias graves en condiciones de campo, lo que sugiere infecciones concomitantes de influenza con patógenos respiratorios virales y/o bacterianos. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo investigar la presencia del virus de influenza aviar H9N2 coinfectando con múltiples patógenos virales y bacterianos en parvadas de pollos de engorde. Se evaluaron 60 parvadas de pollos de engorde con signos respiratorios desde marzo hasta julio del año 2019 en Punjab, Pakistán. Las parvadas sospechosas fueron analizadas para detectar la presencia del virus de influenza aviar utilizando un dispositivo de flujo lateral. Se recolectaron muestras traqueales, cloacales y de médula ósea y se analizaron para detectar siete agentes virales (anemia infecciosa aviar, enfermedad de Newcastle, bronquitis infecciosa, laringeotraqueítis infecciosa [ILT] y subtipos H9, H7 y H5 de influenza aviar) y tres agentes bacterianos (Mycoplasma gallisepticum ; Mycoplasma sinovae; Ornithobacterium rhinotracheale [ORT]) utilizando ensayos de PCR. Tras la detección inicial del virus de la influenza aviar, 35/60 (58.3 %) parvadas resultaron positivas. La coinfección del virus de la influenza H9N2 con otros patógenos se detectó en 25 (71.4 %) parvadas y el virus de influenza aviar H9N2 fue detectado solo en 10 (28.6 %) parvadas del total de parvadas positivas (n = 35). Los subtipos H5 y H7 del virus de influenza, ILT y ORT no se detectaron durante el período de estudio. La tasa de detección de combinaciones dobles, triples y cuádruples de coinfecciones con el virus de influenza H9N2 fue del 37 % (13 parvadas), del 26% (9 parvadas), del 9 % (3 parvadas), respectivamente. Se encontró una mortalidad promedio más alta (28.5 %) en lotes de pollos de engorde coinfectados con patógenos virales y/o bacterianos que en lotes donde solo se detectó al virus de influenza H9 de baja patogenicidad (20.8%). En conclusión, una mayor circulación del virus de influenza aviar H9N2 con otros patógenos virales y bacterianos puede contribuir a mayores pérdidas en la producción y económicas a nivel de granja.