Busca por alvos de regulação pelo segundo mensageiro c-diGMP em Pseudomonas aeruginosa / Search for c-di-GMP regulation targets in Pseudomonas aeruginosa

RESUMO

Recentemente, o bis-(3',5')-di-guanosina monofosfato cíclico (c-di-GMP) surgiu como uma importante molécula sinalizadora nas bactérias. Essa molécula foi identificada como uma das responsáveis pelo controle do comportamento bacteriano e está relacionada com a patogenicidade e a adaptação de diversas bactérias, coordenando a expressão de genes envolvidos com virulência, motilidade e formação de biofilme. O mecanismo pelo qual c-diGMP atua vem sendo motivo de estudo de vários grupos de pesquisa nos últimos anos. Já foi demonstrado o papel dessa molécula em diferentes etapas do controle da expressão gênica. Acredita-se que a manipulação dos níveis de c-di-GMP pode ser uma nova abordagem terapêutica contra bactérias patogênicas. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que atua como um patógeno oportunista, causando infecções em pacientes imunocomprometidos, sendo o maior causador de infecções crônicas em pacientes portadores de fibrose cística. O genoma de P. aeruginosa PA14 apresenta vários genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo e/ou ligação de c-di-GMP, o que pode indicar um amplo papel regulatório deste nucleotídeo nessa bactéria. Uma associação infundada entre níveis elevados de c-di-GMP e a resistência aos antibióticos é geralmente assumida, já que altos níveis de c-di-GMP levam à formação de biofilme, que é comprovadamente um modo de crescimento mais resistente. Nesse trabalho, utilizando uma abordagem proteômica, mostramos que Pseudomonas aeruginosa PA14 regula a expressão de cinco porinas em resposta a variações nos níveis de c-di-GMP, independentemente dos níveis de mRNA. Uma dessas porinas, OprD, é responsável pela entrada do antibiótico ß-lactâmico imipenem na célula e é menos abundante em condições de alto c-di-GMP. Também demonstramos que linhagens com altos níveis de c-di-GMP apresentam uma vantagem competitiva de crescimento em relação a linhagens com níveis mais baixo de c-di-GMP quando crescidas em meio contendo imipenem. Em contraste, observamos que células planctônicas com elevados níveis c-di-GMP são mais sensíveis a tobramicina. Em conjunto, estes resultados mostram que c-di-GMP pode regular a resistência a antibióticos em sentidos opostos, e independentemente do crescimento em biofilme

ABSTRACT

Following the genomic era, a large number of genes coding for enzymes predicted to synthesize and degrade 3'-5'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) was found in most bacterial genomes and this dinucleotide emerged as an important intracellular signal molecule controlling bacterial behavior. Diverse molecular mechanisms have been described as targets for c-di-GMP, but several questions remain to be addressed. An association between high c-di-GMP levels and antibiotic resistance is largely assumed, since high c-di-GMP upregulates biofilm formation and the biofilm mode of growth leads to enhanced antibiotic resistance; however, a clear understanding of this correlation is missing. Pseudomonas aeruginosa is a versatile gamma-proteobacterium that behaves as an opportunistic pathogen to a broad range of hosts. The ability of P. aeruginosa to form biofilms contributes to its virulence and adaptation to different environments. The P. aeruginosa PA14 genome presents several genes encoding proteins involved in metabolism or binding to c-di-GMP, which may indicate a wide regulatory role of this nucleotide in this bacterium. Here, using a proteomic approach, we show that Pseudomonas aeruginosa PA14 regulates the amount of five porins in response to c-di-GMP levels, irrespective of their mRNA levels. One of these porins is OprD, decreased in high c-di-GMP conditions, which is responsible for the uptake of the ß-lactam antibiotic imipenem. We also demonstrate that this difference leads strains with high c-di-GMP to be more resistant to imipenem even when growing as planktonic cells, giving them a competitive advantage over cells with low c-di-GMP. Contrastingly, we found that planktonic cells with high c-di-GMP levels are more sensitive to aminoglycosides antibiotics. Together, these findings show that c-di-GMP levels can regulate the antibiotic resistance to different drugs in opposite ways and irrespective of a biofilm mode of growth