RESUMO
American tegumentary leishmaniasis (ATL) samples obtained from the lesions of patients with typical (n = 25, 29%), atypical (n = 60, 69%) or both (n = 2%) clinical manifestations were analysed by multilocus enzyme electrophoresis, hsp70 restriction-fragment length polymorphism (PCR-RFLP), hsp70 sequencing and phylogenetics methods. The hsp70 PCR-RFLP analysis revealed two different profiles whose the most samples differed from those expected for Leishmania braziliensis and the other Leishmania species tested: of 39 samples evaluated, two (5%) had a restriction profile corresponding to L. braziliensis, and 37 (95%) had a restriction profile corresponding to a variant pattern. A 1300-bp hsp70 gene fragment was sequenced to aid in parasite identification and a phylogenetic analysis was performed including 26 consensus sequences from the ATL patient's samples and comparing to other Leishmania and trypanosomatids species. The dendrogram allowed to observe a potential population structure of L. braziliensis complex in the studied region, emphasizing that the majority of clinical samples presented a variant genetic profile. Of interest, the L. braziliensis diversity was associated with different clinical manifestations whose parasites with hsp70 variant profile were associated with atypical lesions. The results may be helpful to improve the diagnosis, treatment and control measures of the ATL in endemic areas.
Assuntos
Variação Genética , Leishmania braziliensis/genética , Leishmaniose Cutânea/epidemiologia , Pele/parasitologia , Brasil/epidemiologia , DNA de Protozoário/genética , Doenças Endêmicas , Proteínas de Choque Térmico HSP70/genética , Humanos , Filogenia , Reação em Cadeia da Polimerase , Polimorfismo de Fragmento de Restrição , Pele/patologiaRESUMO
Infecções causadas por Leishmania (Viannia) braziliensis apresentam manifestações clínicas diversas e a leishmaniose cutânea localizada (LCL) é a forma clínica mais comum. Na Terra Indígena Xakriabá, localizada no norte de Minas Gerais, 212 casos autóctones de LCL foram registrados no período de 2001 a 2007. O grande número de casos e as particularidades da área reforçam o interesse de investigar aspectos da resposta imune do hospedeiro em relação à infecção. O óxido nítrico (NO) é um potente agente citotóxico presente na resposta imune anti-Leishmania. Na LCL, um dos mecanismos de produção de NO envolve a ligação de IgE ao receptor CD23 de macrófagos num microambiente de citocinas IFN-γ ou IL-4. Apesar do papel crucial do NO no curso da infecção, tem sido relatada a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação dessa molécula. Assim, os objetivos do presente trabalho foram avaliar por citometria de fluxo, o perfil de expressão do marcador de ativação CD23 e de produção de NO intracelular por monócitos e o perfil de expressão das citocinas IFN-γ e IL-4 por linfócitos T do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI, n=10), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+, n=13) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL, n=17), considerando o tempo de evolução da lesão (LCL60 dias, n=10). Foi feita também a dosagem dos níveis séricos de IgE dos indivíduos participantes. Além disso, investigou se a possível presença de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao NO em isolados de pacientes responsivos (C, n=5) e refratários ao tratamento (FT, n=5) com Glucantime®.
Para o estudo imunológico foram realizadas culturas de leucócitos do sangue periférico na ausência (CC) ou presença de formas promastigotas vivas de L.(V.) braziliensis (LEISH) ou na presença de antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis. A dosagem dos níveis séricos de IgE foi feita utilizando-se kit específico baseado na técnica ELISA sanduíche. Para identificação do perfil de resistência dos isolados foram feitos ensaios de viabilidade utilizando-se a técnica do MTT. Os resultados obtidos como estudo imunológico mostram que o grupo LCL apresentou maior expressão de CD23 e maior produção de NO por monócitos em relação aos grupos TM+ e NI, além de menor expressão de IFN-g e IL-4 por linfócitos T CD4+ em relação ao grupo TM+. Por outro lado, o grupo TM+ apresentou aumento relevante no percentual de alto produtores das citocinas avaliadas, NO e CD23 quando comparado ao grupo NI. Ao dividirmos o grupo LCL por tempo de lesão, observamos no grupo LCL<60 grande frequência de alto produtores de IL-4, NO e CD23, indicando um perfil misto de ativação/modulação da imunidade inata. Os níveis séricos de IgE total foram menores no grupo LCL quando comparado aos grupos NI e TM+, havendo redução do grupo TM+ em relação ao grupo NI. Além disso, dos 10 isolados testados, 8 foram resistentes à ação do NO, sendo que, os 2 sensíveis foram provenientes de indivíduos responsivos ao tratamento com Glucantime®. Diante disso, foi possível inferir que outras fontes celulares, além dos linfócitos T, podem estar envolvidas na produção de citocinas no grupo LCL e que no grupo TM+ há forte indício da participação do mecanismo de ativação de monócitos e indução de NO investigado neste estudo, favorecendo o controle da infecção, impedindo assim, o aparecimento de lesões. Além disso, a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação do NO corrobora com achados de outros autores e pode estar diretamente relacionada com a resistência à ação do Glucantime®
Assuntos
Humanos , Animais , Cães , Cobaias , Camundongos , Leishmania braziliensis/parasitologia , Leishmaniose Cutânea/imunologia , Óxido Nítrico/análiseRESUMO
Infecções causadas por Leishmania (Viannia) braziliensis apresentam manifestações clínicas diversas e a leishmaniose cutânea localizada (LCL) é a forma clínica mais comum. Na Terra Indígena Xakriabá, localizada no norte de Minas Gerais, 212 casos autóctones de LCL foram registrados no período de 2001 a 2007. O grande número de casos e as particularidades da área reforçam o interesse de investigar aspectos da resposta imune do hospedeiro em relação à infecção. O óxido nítrico (NO) é um potente agente citotóxico presente na resposta imune anti-Leishmania. Na LCL, um dos mecanismos de produção de NO envolve a ligação de IgE ao receptor CD23 de macrófagos num microambiente de citocinas IFN-γ ou IL-4. Apesar do papel crucial do NO no curso da infecção, tem sido relatada a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação dessa molécula. Assim, os objetivos do presente trabalho foram avaliar por citometria de fluxo, o perfil de expressão do marcador de ativação CD23 e de produção de NO intracelular por monócitos e o perfil de expressão das citocinas IFN-γ e IL-4 por linfócitos T do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI, n=10), Teste de Montenegro positivo sem lesão (TM+, n=13) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL, n=17), considerando o tempo de evolução da lesão (LCL<60 dias, n=7; LCL>60 dias, n=10). Foi feita também a dosagem dos níveis séricos de IgE dos indivíduos participantes. Além disso, investigou se a possível presença de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao NO em isolados de pacientes responsivos (C, n=5) e refratários ao tratamento (FT, n=5) com Glucantime®. Para o estudo imunológico foram realizadas culturas de leucócitos do sangue periférico na ausência (CC) ou presença de formas promastigotas vivas de L.(V.) braziliensis (LEISH) ou na presença de antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis. A dosagem dos níveis séricos de IgE foi feita utilizando-se kit específico baseado na técnica ELISA sanduíche. Para identificação do perfil de resistência dos isolados foram feitos ensaios de viabilidade utilizando-se a técnica do MTT. Os resultados obtidos como estudo imunológico mostram que o grupo LCL apresentou maior expressão de CD23 e maior produção de NO por monócitos em relação aos grupos TM+ e NI, além de menor expressão de IFN-g e IL-4 por linfócitos T CD4+ em relação ao grupo TM+. Por outro lado, o grupo TM+ apresentou aumento relevante no percentual de alto produtores das citocinas avaliadas, NO e CD23 quando comparado ao grupo NI. Ao dividirmos o grupo LCL por tempo de lesão, observamos no grupo LCL<60 grande frequência de alto produtores de IL-4, NO e CD23, indicando um perfil misto de ativação/modulação da imunidade inata. Os níveis séricos de IgE total foram menores no grupo LCL quando comparado aos grupos NI e TM+, havendo redução do grupo TM+ em relação ao grupo NI. Além disso, dos 10 isolados testados, 8 foram resistentes à ação do NO, sendo que, os 2 sensíveis foram provenientes de indivíduos responsivos ao tratamento com Glucantime®. Diante disso, foi possível inferir que outras fontes celulares, além dos linfócitos T, podem estar envolvidas na produção de citocinas no grupo LCL e que no grupo TM+ há forte indício da participação do mecanismo de ativação de monócitos e indução de NO investigado neste estudo, favorecendo o controle da infecção, impedindo assim, o aparecimento de lesões. Além disso, a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação do NO corrobora com achados de outros autores e pode estar diretamente relacionada com a resistência à ação do Glucantime®.
