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Prep Biochem Biotechnol ; 37(4): 309-21, 2007.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-17849286

RESUMO

The steroid 9alpha-hydroxylase gene has been cloned from Mycobacterium smegmatis into Escherichia coli BL21. Progesterone added to bioreactors was subjected to in vivo transformation into 9alpha-hydroxyprogesterone. In 7 days, 43.6 mg 9alpha-hydroxyprogesterone was formed from 53.8 mg/L progesterone. The enzyme also has shown evidence of processing 4-androstene-3,17-dione in vivo. An extensive analytical method development, including LLE, HPLC-DAD, MS, and NMR was performed to verify the product and to enable a quantitative analysis. Protocols for analytical and preparative separation have been developed, using binaphtol as internal standard. Both the growth pattern and the bioconversion rate were unaffected by the presence of binaphtol in the bioreactor. The enzyme was purified by immobilised metal affinity and ion exchange chromatography, resulting in low in vitro activity.


Assuntos
Androstenodiona/biossíntese , Biotecnologia , Técnicas de Química Analítica/métodos , Hidroxiprogesteronas/metabolismo , Sequência de Aminoácidos , Androstenodiona/química , Androstenodiona/isolamento & purificação , Reatores Biológicos/microbiologia , Cromatografia de Afinidade , Cromatografia Líquida de Alta Pressão , Cromatografia por Troca Iônica , Clonagem Molecular , Escherichia coli/enzimologia , Escherichia coli/genética , Genes Bacterianos , Histidina/química , Hidroxilação , Espectrometria de Massas , Oxigenases de Função Mista/química , Oxigenases de Função Mista/genética , Oxigenases de Função Mista/metabolismo , Dados de Sequência Molecular , Estrutura Molecular , Peso Molecular , Mycobacterium smegmatis/enzimologia , Mycobacterium smegmatis/genética , Naftóis/química , Ressonância Magnética Nuclear Biomolecular , Progesterona/química , Progesterona/metabolismo , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Padrões de Referência , Homologia de Sequência de Aminoácidos , Espectrofotometria Ultravioleta , Fatores de Tempo , Transformação Bacteriana
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