Caracterización de cepas de Leishmania, por medio de la técnica de PCR-RFLP de la región del Spliced Leader Miniexon (SLME), aisladas de humanos y caninos en Paraguay / Characterization of Leishmania strains using PCR-RFLP of Spliced Leader Miniexon (SLME) in human and canine isolates in Paraguay

La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria con varias formas clínicas, desde lesiones cutáneas leves hasta enfermedades fatales con comprometimiento visceral. Existen varias técnicas moleculares como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica diferentes secuencias blanco, una de ellas es la región SLME (spliced leader miniexon), el producto se corta con enzimas de restricción (PCR-RFLP), permitiendo la identificación de las especies de Leishmania. Este trabajo fue realizado con el objetivo de caracterizar las cepas de Leishmania, empleando una PCR-RFLP de la región SLME, aisladas de humanos y caninos, provenientes de distintas zonas del país. Se analizaron 12 aislados de humanos y 40 de caninos debidamente codificados. Se empleó un par de cebadores para la región SLME, los productos amplificados fueron cortados con las enzimas Hae III y Nco I (RFLP) y los patrones de bandas analizados. Se detectó en un primer paso la presencia de parásitos del subgénero Viannia en 7 aislados de humanos y correspondientes al subgénero Leishmania en 5 aislados de humanos y 40 de caninos. La RFLP según los patrones de bandas permitió identificar a L. braziliensis en aislados de leishmaniosis tegumentaria y L. chagasi en los casos de leishmaniosis visceral. Es importante resaltar que este trabajo es el primero en el país en realizar la caracterización molecular a nivel de especies de Leishmania y los hallazgos descritos tienen una implicación a nivel epidemiológico, contribuyendo con las estrategias de vigilancia y control de la enfermedad. Adicionalmente, se sugiere el uso de otros marcadores genéticos para identificar genotipos o perfiles genéticos diferentes, entre cepas de estas especies

Seguimiento clínico y serológico de pacientes tratados de leishmaniosis cutánea / Clinical and serological follow-up of patients treated from cutaneous

La inmunofluorescencia indirecta con antígeno crudo de Leishmania constituye una técnicaserológica convencional que para el diagnóstico de leishmaniosis presenta una sensibilidadmoderada, entre el 70 y el 80%. Son muy raros los trabajos que en la literatura reportan su usopara el seguimiento serológico post-tratamiento de los pacientes, aunque la experiencia que engeneral se tiene en áreas endémicas consiste en que la mayoría de los casos clínicamente curadospresentan una disminución importante de los títulos serológicos con el avance del tiempo. Estetrabajo tiene por objetivo describir el cuadro clínico y los valores de la reacción serológica enpacientes con leishmaniosis cutánea antes y después de su tratamiento. Para este trabajo ha sidoestudiado el comportamiento clínico y serológico de un grupo de 32 pacientes con leishmaniosiscutánea, en un brote de la enfermedad producido en 1998 en el distrito de Capiibary,Departamento de San Pedro. De los pacientes evaluados hasta 18 o 24 meses post-tratamientotodos excepto uno manifestaron curación de sus lesiones. La gran mayoría de los sujetos hanmostrado disminución de los títulos serológicos, hasta la negativización. Se concluye que elseguimiento serológico arroja valores que coinciden con la clínica de los pacientes, por lo tantoamerita que sea llevado a cabo complementariamente con la inspección clínica. Al no contar en esteestudio con casos de reactivación cutánea o mucosa, no se puede concluir acerca del valorpredictivo de la serología para estos casos

Leishmaniasis tegumentaria: sensibilidad de la inmunofluorescencia indirecta en pacientes con diagnótico parasitológico / Tegumentary leishmaniasis: sensitivity of the indirect immunofluorescent assay in patients with parasitológical diagnosis

La leishmaniasis tegumentaria es una zoonosis endémica de zonas tropicales y subtropicales del mundo, de difícil diagnóstico laboratorial. En áreas endémicas se realiza el diagnóstico de presunción basado en la presentación clínica y la reactividad a la prueba cutánea de la leishmanina. Sin embargo, un diagnóstico definitivo de la enfermedad requiere la combinación de diferentes métodos, entre los cuales la inmunofluorescencia indirecta (IFI) es uno de los más utilizados. Para determinar la sensibilidad de la IFI, se sometió un total de 95 pacientes con lesiones comprobadas de leishmaniasis a las pruebas de leishmanina, biopsia histopatológica, cultivo e IFI. En 80 pacientes se logró el diagnóstico parasitológico a través de la histopatología y/o el cultivo. De ellos, 58 muestras (72,5%) dieron reacción positiva en la IFI para Leishmania, aunque 12 de ellas (21%) también mostraron serología positiva para enfermedad de Chagas. La sensibilidad de la IFI para los casos de leishmaniasis mucosa solamente fue 81,3% (n=16). Se concluye que la IFI es un método de moderada sensibilidad para el diagnóstico de leishmaniasis tegumentaria.

Tegumentary leishmaniasis is an endemic zoonosis of tropical and subtropical areas of the world. Diagnosis of this illness is difficult even using laboratorial methods. In endemics areas a presumptive diagnosis is carried out based on the clinical presentation and reactivity to the skin test. However, a definitive diagnosis of the illness requires the combination of different methods, such as the indirect immunofluorescence assay (IIF), one of the most used methods. In order to determine the sensitivity of the IIF, a total of 95 patients with proven lesions of leishmaniasis were subjected to skin test, histopathology, culture and IIF. Parasitological diagnosis was achieved in 80 patients through histopathology and/or culture. Fifty­eight samples of them (72.5%) gave positive reaction by the IIF although 12 of them (21%) also showed positive serology for Chagas disease. The sensitivity of the IIF for mucosal leishmaniasis only was 81.3% (n=16). We concluded that IIF has moderate sensitivity for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis.

trans-sialidase inhibition assay, a highly sensitive and specific diagnostic test for Chagas' disease.

For the diagnosis of Chagas' disease, the trans-sialidase inhibition assay was able to resolve the results for samples with borderline results, to detect as positive 60% of samples that were negative by conventional serology, and to discriminate idiopathic from chagasic megaviscera or cardiopathy. No cross-reaction with sera from patients with other diseases was observed.

Carbohydrate and LPG expression in Leishmania viannia subgenus.

Glycosylated molecules expressed on the cell surface of Leishmania promastigotes contribute to the outcome of contact between the parasite and its invertebrate and vertebrate hosts. The expression of several such molecules is growth phase dependent. Information on the expression of carbohydrates by Leishmania of the Viannia subgenus (braziliensis complex), a widespread cause of morbidity in the Americas, is fragmentary. We have examined the relationship between growth phase and the expression of glycosylated surface structures in WHO reference strains of 3 species of the Viannia subgenus, i.e., L. panamensis, L. guyanensis, and L. braziliensis. Agglutination with lectins and the monoclonal antibody specific for the repeat unit of L. donovani lipophosphoglycan, CA7AE, distinguished logarithmic and stationary-phase promastigotes of all 3 species. Flow cytometry revealed increased heterogeneity and disparity in the expression of the repeat unit epitope in stationary-as compared to logarithmic-phase promastigotes. Biochemical analyses showed the LPG repeat unit of all 3 species reference strains to be constituted by mannose and galactose with little or no substitution and, hence, to be similar to the LPG of L. donovani. Initial quantitative analyses of L. braziliensis LPG indicated a 10-fold lower quantity of LPG in this species than L. donovani and an increase in the size of LPG in the stationary phase. These findings provide bases for isolating and biologically characterizing phenotypically distinct populations of promastigotes and for identifying molecular determinants of the host parasite-relationship among Leishmania Viannia.

Binding of native and [homoserine lactone-52]-52,53-seco-bovine basic pancreatic trypsin inhibitor (Kunitz inhibitor) to porcine pancreatic beta-kallikrein-B and bovine alpha-chymotrypsin: thermodynamic study.

Values of the association equilibrium constant (Ka) for the binding of the native and of the cyanogen bromide-cleaved bovine basic pancreatic trypsin inhibitor (native BPTI and [Hse lactone-52]-52,53-seco-BPTI, respectively) to neuraminidase-treated porcine pancreatic beta-kallikrein-B (kallikrein) and bovine alpha-chymotrypsin (chymotrypsin) have been determined between pH 4.0 and 9.0, at 20.0 degrees C. Over the whole pH range explored, native BPTI and [Hse lactone-52]-52,53-seco-BPTI show the same affinity for kallikrein. On the other hand, the affinity of [Hse lactone-52]-52,53-seco-BPTI for chymotrypsin is higher, around neutrality, than that found for native BPTI by about one order of magnitude, converging in the acidic pH limb. The simplest mechanism accounting for the observed data implies that, on lowering the pH from 9.0 to 4.0, (i) the decrease in affinity for the binding of native BPTI to kallikrein and chymotrypsin, as well as for the association of [Hse lactone-52]-52,53-seco-BPTI to kallikrein, reflects the acidic pK shift, upon inhibitor association, of a single ionizing group; and (ii) the decrease of Ka values for [Hse lactone-52]-52,53-seco-BPTI binding to chymotrypsin appears to be modulated by the acidic pK shift, upon inhibitor association, of two non-equivalent proton-binding residues. On the basis of the stereochemistry of the serine proteinase/inhibitor contact region(s), these data indicate that long-range structural changes in [Hse lactone-52]-52,53-seco-BPTI are energetically linked to the chymotrypsin:inhibitor complex formation. This observation represents an important aspect for the mechanism of molecular recognition and regulation in BPTI.