Estabelecimento de ensaios in vitro para avaliação da resposta imune de cães a Leishmania chagasi / Establishment of in vitro tests to evaluate the immune response of dogs to Leishmania chagasi

A leishmaniose visceral (LV) é apontada como doença re-emergente e sua ascensão se relaciona com a ineficácia dos métodos de controle. Há evidências de que o cão é o principal reservatório da forma zoonótica da LV e que L. infantum/L. chagasi seja mantida em comunidades urbanas e peri-urbanas através de um ciclo cão-inseto-cão. Cães com leishmaniose visceral canina (LVC) exibem doença progressiva e geralmente fatal (cão susceptível ou sintomático) ou uma aparente resistência (cão assintomático). Animais doentes apresentam depressão das funções mediadas pelas células T. Em contraste, cães infectados e assintomáticos apresentam resistência ao parasito associada com uma resposta imune celular efetiva. A elucidação dos mecanismos que vão mediar a resposta imune na LVC pode auxiliar o desenvolvimento de vacinas ou estratégias de imunoterapia. O objetivo desta tese foi estabelecer dois ensaios in vitro. O primeiro ensaio foi estabelecido para avaliar se a resposta protetora à infecção por L. infantum/L. chagasi de cães imunizados e assintomáticos se reproduz num sistema de re-estimulação in vitro de PBMC. O segundo ensaio teve como objetivo estabelecer um sistema de estimulação primária in vitro (PIV), que consistiu em utilizar co-culturas de PBMC de cães sadios, previamente estimulados com promastigotas de L. infantum/L. chagasi, e macrófagos autólogos infectados. O primeiro ensaio mostrou que sobrenadantes de PBMC de cães assintomáticos são capazes de estimular macrófagos de cães normais a reduzir a infecção por L. chagasi. A detecção de IFN-y no sobrenadante de PBMC desses cães imunizados e re-estimulados in vitro com antígeno de L. infantum/L. chagasi foi associada à produção de NO pelos macrófagos caninos estimulados com sobrenadantes desses PBMC. O segundo ensaio estabelecido, um sistema de PIV, mostrou que a expressão de IFN-y e IL-4 pelos PBMC estimulados primariamente in vitro com L. infantum/L. chagasi apresenta uma correlação negativa com a infecção. O aumento da expressão dessas citocinas pelos PBMC estimulados primariamente com L. infantum/L. chagasi durante seis dias e co-cultivadas com macrófagos está correlacionado a uma diminuição do percentual de macrófagos infectados. A expressão de IL-1O desses PBMC foi variável e não pôde ser correlacionada à infecção. Esse é o primeiro relato de um sistema de PIV com PBMC e macrófagos caninos infectados por L. infantum/1. chagasi. Esse ensaio, utilizando cães não expostos ao parasito, permitiu discriminar in vitro a resposta de macrófagos a L. infantum/L. chagasi. Os dois ensaios estabelecidos poderão ser utilizados como testes para predizer a resposta do cão à infecção ou na avaliação de candidatos vacinais contra a LVC.

Peripheral blood mononuclear cell supernatants from asymptomatic dogs immunized and experimentally challenged with Leishmania chagasi can stimulate canine macrophages to reduce infection in vitro.

Leishmania chagasi is the causative agent of visceral leishmaniasis in both humans and dogs in the New World. The dog is the main domestic reservoir and its infection displays different clinical presentations, from asymptomatic to severe disease. Macrophages play an important role in the control of Leishmania infection. Although it is not an area of intense study, some data suggest a role for canine macrophages in parasite killing by a NO-dependent mechanism. It has been proposed that control of human disease could be possible with the development of an effective vaccine against canine visceral leishmaniasis. Development of a rapid in vitro test to predict animal responses to Leishmania infection or vaccination should be helpful. In this study, an in vitro model was established to test whether peripheral blood mononuclear cell (PBMC) supernatants from dogs immunized with promastigote lysates and infected with L. chagasi promastigotes could stimulate macrophages from healthy dogs in order to control parasite infection. PBMC from a majority of the immunized and experimentally infected dogs expressed IFN-gamma mRNA and secreted IFN-gamma when stimulated with soluble L. chagasi antigen (SLA) in vitro. Additionally, the supernatants from stimulated PBMC were able to reduce the percentage of infected donor macrophages. The results also indicate that parasite killing in this system is dependent on NO, since aminoguanidine (AMG) reversed this effect. This in vitro test appears to be useful for screening animal responses to parasite inoculation as well as studying the lymphocyte effector mechanisms involved in pathogen killing by canine macrophages.