Venenos de serpentes do gênero Bothrops: impacto da glicosilação na complexidade dos proteomas e função de toxinas / Bothrops snake venoms: impact of glycosylation on the complexity of proteomes and toxins function

A variabilidade estrutural é uma característica das proteínas de venenos de serpentes, e a glicosilação é uma das principais modificações pós-traducionais que contribui para a diversificação de seus proteomas. Recentes estudos de nosso grupo demonstraram que venenos do gênero Bothrops são marcadamente definidos pelo seu conteúdo de glicoproteínas, e que a maioria das estruturas de N-glicanos dos tipos híbrido e complexo identificados em oito venenos deste gênero contêm unidades de ácido siálico. Em paralelo, em glicoproteínas do veneno de B. cotiara foi identificada a presença de uma estrutura de N-acetilglicosamina bissecada. Assim, com o objetivo de investigar a variação do conteúdo de glicoproteínas, assim como os mecanismos envolvidos na geração dos diferentes venenos de Bothrops, neste estudo foram analisados comparativamente os glicoproteomas de nove venenos do gênero Bothrops (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi). As abordagens glicoproteômicas envolveram cromatografia de afinidade e ensaio de pull-down utilizando, respectivamente, as lectinas SNA (aglutinina de Sambucus nigra) e MAL I (lectina de Maackia amurensis), que mostram afinidade por unidades de ácido siálico nas posições, respectivamente, α2,6 e α2,3; e cromatografia de afinidade com a lectina PHA-E (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), que reconhece N-acetilglicosamina bissecada. Ainda, eletroforese de proteínas, blot de lectina, e identificação de proteínas por espectrometria de massas foram empregadas para caracterizar os glicoproteomas. As lectinas geraram frações dos venenos enriquecidas de diferentes componentes, onde as principais classes de glicoproteínas identificadas foram metaloprotease, serinoprotease, e L-amino ácido oxidase, além de outras enzimas pouco abundantes nos venenos. Os diferentes conteúdos de proteínas reconhecidas por essas lectinas, com especificidades distintas, ressaltaram novos aspectos da variabilidade dos subproteomas de glicoproteínas desses venenos, dependendo da espécie. Ainda, considerando que metaloproteases e serinoproteases são componentes abundantes nesses venenos e fundamentais no quadro de envenenamento botrópico, e que estas enzimas contêm diversos sítios de glicosilação, o papel das unidades de ácido siálico na atividade proteolítica das mesmas foi avaliado. Assim, a remoção enzimática de ácido siálico (i) alterou o padrão de gelatinólise em zimografia da maioria dos venenos, (ii) diminuiu a atividade proteolítica de alguns venenos sobre o fibrinogênio e a atividade coagulante do plasma humano de todos os venenos, e (iii) alterou o perfil de hidrólise de proteínas plasmáticas pelo veneno de B. jararaca, indicando que este carboidrato pode desempenhar um papel na interação das proteases com seus substratos proteicos. Em contraste, o perfil da atividade amidolítica dos venenos não se alterou após a remoção de ácido siálico e incubação com o substrato Bz-Arg-pNA, indicando que ácido siálico não é essencial em N-glicanos de serinoproteases atuando sobre substratos não proteicos. Em conjunto, esses resultados expandem o conhecimento sobre a variabilidade de proteomas de venenos do gênero Bothrops e apontam a importância das cadeias de carboidratos contendo ácido siálico nas atividades enzimáticas das proteases desses venenos

Structural variability is a feature of snake venom proteins, and glycosylation is one of the main post-translational modifications that contributes to the diversification of venom proteomes. Recent studies by our group have shown that Bothrops venoms are markedly defined by their glycoprotein content, and that most hybrid and complex N-glycan structures identified in eight venoms of this genus contain sialic acid units. In parallel, the presence of a bisected N-acetylglucosamine structure was identified in B. cotiara venom glycoproteins. Thus, with the aim of investigating the variation in the content of glycoproteins, as well as the mechanisms involved in the generation of different Bothrops venoms, in this study the glycoproteomes of nine Bothrops venoms (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi) were comparatively analyzed. The glycoproteomic approaches involved affinity chromatography and pulldown using, respectively, the lectins SNA (Sambucus nigra agglutinin) and MAL I (Maackia amurensis lectin), which show affinity for sialic acid units at positions, respectively, α2,6 and α2,3, and affinity chromatography with PHA-E (Phaseolus vulgaris erythroagglutinin), which recognizes bisected N-acetylglucosamine. In addition, protein electrophoresis, lectin blot, and protein identification by mass spectrometry were employed for glycoproteome characterization. The lectins generated venom fractions enriched with different components, where the main classes of glycoproteins identified were metalloprotease, serine protease, and L-amino acid oxidase, in addition to other low abundant enzymes. The different contents of proteins recognized by these lectins of distinct specificities highlighted new aspects of the variability of the glycoprotein subproteomes of these venoms, depending on the species. Furthermore, considering that metalloproteases and serine proteases are abundant components of these venoms and essential in Bothrops envenomation, and that these enzymes contain several glycosylation sites, the role of sialic acid units in their proteolytic activities was evaluated. Thus, enzymatic removal of sialic acid (i) altered the pattern of gelatinolysis in zymography of most venoms, (ii) decreased the proteolytic activity of some venoms on fibrinogen and the clotting activity of human plasma of all venoms, and (iii) altered the hydrolysis profile of plasma proteins by B. jararaca venom, indicating that this carbohydrate may play a role in the interaction of proteases with their protein substrates. In contrast, the profile of amidolytic activity of the venoms did not change after removal of sialic acid and incubation with the substrate Bz-Arg-pNA, indicating that sialic acid is not essential in N-glycans of serine proteases acting on small substrates. Together, these results expand the knowledge about the variability of proteomes of Bothrops venoms and point to the importance of carbohydrate chains containing sialic acid in the enzymatic activities of venom proteases

Pseudomonas spp. and other psychrotrophic microorganisms in inspected and non-inspected Brazilian Minas Frescal cheese: proteolytic, lipolytic and AprX production potential / Pseudomonas spp. e outros micro-organismos psicrotróficos em queijos Minas Frescal inspecionados e não inspecionados: potencial proteolítico, lipolítico e produção de AprX

The most consumed cheese in Brazil, Minas Frescal cheese (MFC) is highly susceptible to microbial contamination and clandestine production and commercialization can pose a risk to consumer health. The storage of this fresh product under refrigeration, although more appropriate, may favor the growth of spoilage psychrotrophic bacteria. The objective of this study was to quantify and compare Pseudomonas spp. and other psychrotrophic bacteria in inspected and non-inspected MFC samples, evaluate their lipolytic and proteolytic activities and their metalloprotease production potentials. Twenty MFC samples were evaluated: 10 inspected and 10 non-inspected. Counts of psychrotrophic bacteria and Pseudomonas spp., evaluation of the proteolytic and lipolytic potential of the isolates, and identification of potential producers of alkaline metalloprotease (AprX) were assessed. The mean total psychrotrophic counts were 1.07 (±2.18) × 109CFU/g in the inspected samples and 4.5 (±5.86) × 108CFU/g in the non-inspected, with no significant difference (p=0.37). The average score of Pseudomonas spp. was 6.86 (±18.6) × 105 and 2.08 (±3.65) × 106 CFU/g for the inspected and non-inspected MFC samples, respectively, with no significant difference (p=0.1). Pseudomonas spp. represented 0.06% and 0.004% of psychrotrophic bacteria found in inspected and non-inspected MFC samples, respectively. Collectively, 694 psychrotrophic strains and 47Pseudomonas spp. were isolated, of which 59.9% and 68.1% were simultaneously proteolytic and lipolytic, respectively. Of the 470 psychrotrophs isolated from inspected and 224 from non-inspected cheese samples, 5.74% and 2.23% contained aprX, respectively, while 100 and 86.96% of the Pseudomonas spp. isolates in inspected and non-inspected cheese samples contained the gene. The production potential of AprX did not, however, determine the proteolytic activity on plates of these isolates under the conditions evaluated in this study. Of total, 65.63% of the psychrotrophs that contained aprX gene were confirmed as Pseudomonas spp., using genus-specific PCR. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene of the other psychrotrophs that were potential producers of AprX identified them as Serratia spp. (n=7), Raoultella ornithinolytica (n=1), and Acinetobacter schindleri (n=1) in the inspected samples and Psychrobacter sanguinis (n=1) and Leuconostoc mesenteroides (n=1) in the non-inspected samples. The production conditions of Brazilian MFC of these samples, while meeting the legal determinations, are not sufficient to control Pseudomonas and other spoilage-related psychrotrophs. Thus, stricter hygienic measures are required during the formal production of this type of cheese.(AU)

O mais consumido no Brasil, o queijo Minas Frescal (QMF) é altamente suscetível à contaminação microbiana e a produção e comercialização clandestina podem representar um risco para a saúde do consumidor. O armazenamento deste produto fresco sob refrigeração, embora mais apropriado, pode favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas deteriorantes. O objetivo deste estudo foi quantificar e comparar Pseudomonas spp. e outras bactérias psicrotróficas em amostras de QMF inspecionadas e não inspecionadas, avaliar o potencial lipolítico, proteolítico e de produção de metaloprotease alcalina. Vinte amostras de QMF foram avaliadas: 10 inspecionadas e 10 não inspecionadas. Foram avaliadas as contagens de bactérias psicrotróficas e Pseudomonas spp., o potencial proteolítico e lipolítico dos isolados e a identificação de potenciais produtores de metaloprotease alcalina (AprX). A média total das contagens de bactérias psicrotróficas foi de 1,07 (±2,18) × 109UFC/g nas amostras inspecionadas e 4,5 (±5,86) × 108UFC/g nas não inspecionadas, sem diferença significativa (p=0,37). A média de Pseudomonasspp. foi de 6,86 (±18,6) × 105 e 2,08 (±3,65) × 106UFC/g para as amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente, sem diferença significativa (p=0,1). Pseudomonas spp. representaram 0,06% e 0,004% de bactérias psicrotróficas encontradas em amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente. Das amostras inspecionadas e não inspecionadas, foram isoladas 694 colônias psicrotróficas e 47 Pseudomonasspp., dos quais 59,9% e 68,1% foram simultaneamente proteolíticos e lipolíticos, respectivamente. Dos 470 isolados de psicrotróficos das amostras de queijo inspecionados e dos 224 isolados das não inspecionadas, 5,74% e 2,23% continham o gene aprX, respectivamente, enquanto 100 e 86,96% das Pseudomonasspp. isoladas em amostras de queijo inspecionadas e não inspecionadas continham o potencial de expressão de AprX. Esse potencial, no entanto, não determinou a atividade proteolítica em placas desses isolados nas condições avaliadas neste estudo. Do total, 65,63% dos psicrotróficos que continham o gene aprX foram confirmados como Pseudomonasspp., utilizando PCR gênero-específico. A análise filogenética do gene 16S rRNA dos outros psicrotróficos que foram produtores potenciais de AprX os identificou como Serratia spp. (n=7), Raoultella ornithinolytica (n=1) e Acinetobacter schindleri (n=1) nas amostras inspecionadas e Psychrobacter sanguinis (n=1) e Leuconostoc mesenteroides (n=1) nas amostras não inspecionadas. As condições de produção do QMF dessas amostras, atendendo às determinações legais, não são suficientes para controlar a Pseudomonas e outros psicrotróficos relacionados à deterioração. Assim, medidas higiênicas mais rígidas são necessárias durante a produção formal deste tipo de queijo.(AU)

Quantification of psychrotrophic bacteria and molecular identification of Pseudomonas fluorescens in refrigerated raw milk / Quantificação de bactérias psicrotróficas e identificação molecular de Pseudomonas fluorescens em leite cru refrigerado

In this study, we investigated the contamination of refrigerated raw milk produced in the western region of Paraná, southern Brazil, with psychrotrophic microorganisms, aiming to assay the proteolytic activity of the isolates and to identify Pseudomonas fluorescens, the main proteolytic species associated with the spoilage of milk products. Raw milk samples from 50 dairy farms were submitted to the counting of psychrotrophic microorganisms, being the microbiota characterized by its mesophilic behavior and proteolytic capacity, besides molecular identification of P. fluorescens. Of the samples evaluated, 94% had psychrotrophic counts ranging from 3 to 7.1 log CFU mL-1, and 48.5% of these showed mesophilic behavior. Of the isolates, 48.0% had proteolytic activity in at least one evaluated temperature (21 and 30°C), and 39.3% had proteolytic activity in both temperatures. Among the 61 isolates submitted to molecular identification by polymerase chain reaction (PCR), 86.8% contained the expression of the 16S gene characteristic for P. fluorescens. In this study, we demonstrated that P. fluorescens is the most prevalent psychrotrophic bacteria species in raw refrigerated milk and their proteolytic ability poses high risks to the dairy industry.(AU)

No presente estudo, investigamos a contaminação do leite cru refrigerado produzido na região oeste do Paraná, sul do Brasil, com micro-organismos psicrotróficos, visando testar a atividade proteolítica dos isolados e identificar Pseudomonas fluorescens, a principal espécie proteolítica associada à deterioração de produtos lácteos. Amostras de leite cru de 50 fazendas leiteiras foram submetidas à contagem de micro-organismos psicrotróficos, caracterizando-se a microbiota por seu comportamento mesofílico e sua capacidade proteolítica, além de identificação molecular de P. fluorescens. Entre as amostras avaliadas, 94% apresentaram contagem psicrotrófica variando de 3 a 7,1 log UFC mL-1 e 48,5% destas apresentaram comportamento mesofílico. Entre os isolados, 48,0% apresentaram atividade proteolítica em pelo menos uma das temperaturas testadas (21 e 30°C) e 39,3% apresentaram atividade proteolítica em ambas as temperaturas. Entre os 61 isolados sub-metidos à identificação molecular por reação em cadeia da polimerase (PCR), 86,8% continham expressão do gene 16S característico de P. fluorescens. Neste estudo, demonstramos que P. fluorescens é a espécie de bactérias psicrotróficas mais prevalente em leite refrigerado cru e sua capacidade proteolítica promove elevados riscos de deterioração para a indústria de laticínios.(AU)

Desenvolvimento de um modelo preditivo para identificação de perda de estabilidade e ocorrência de proteólise em leite UAT / Development of a predicative model for identification of loss of stability and proteolysis occurrence in UHT milk

Este trabalho se propôs a desenvolver um modelo preditivo para identificação de perda de estabilidade e de sedimentação em leite UAT por determinação da atividade enzimática de aminopeptidase no leite por espectrofotometria. Foram analisadas amostras de leite cru, pasteurizado e UAT após envase durante seis meses, na região Sul do Brasil. Acidez, crioscopia, gordura, extrato seco total, extrato seco desengordurado e densidade foram analisados nos leites cru e pasteurizado. Amostras de leite cru foram ainda submetidas à análise de contagem de psicrotróficos e à atividade de aminopeptidase, e amostras de leite UAT estocadas foram analisadas quanto ao grau de proteólise mediante análises sensoriais e atividade de aminopeptidase. Alterações sensoriais foram observadas em tempos de estocagem menores para amostras originadas de leite cru com contagem de psicrotróficos acima de 107 UFC mL-1. Não houve correlação entre a atividade de aminopeptidase e proteólise e também não foi observada correlação significativa entre os parâmetros físico-químicos e a ocorrência de proteólise no leite estocado. O modelo estudado não foi apto para predizer perda de estabilidade e ocorrência de proteólise no leite UAT.(AU)

The aim of this work was to develop a predictive model for identifying loss of stability and sedimentation in UHT milk by determining the enzymatic activity of aminopeptidasis in milk by spectrophotometry. Samples of raw milk, pasteurized and UHT after filling for 6 months in Southern Brazil were analyzed. Acidity, freezing point, fat, total solids, nonfat solids and density were analyzed in raw and pasteurized milk. Raw milk samples were also subjected to psychrotrophic count analysis and aminopeptidasis activity and UAT samples of stored milk were analyzed for degree of proteolysis through sensory analysis and aminopeptidasis activity. Sensory changes were observed in smaller storage time for samples of raw milk originated with psychrotrophic count above 107 CFU ml-1. There was no correlation between aminopeptidasis activity and proteolysis and there was also no significant correlation between physicochemical parameters and the occurrence of proteolysis in stored milk. The model was unable to predict loss of stability and occurrence of proteolysis in UHT milk.(AU)

Relação entre psicrotróficos e frações de caseína do leite longa vida durante o armazenamento / Relationship between psychrotrophic and casein fractions of long life milk during storage

As bactérias psicrotróficas podem afetar a qualidade de diversos produtos lácteos. A relação entre a contagem de psicrotróficos no leite pasteurizado e as frações de caseína do leite longa vida foi avaliada. O processo ultra alta temperatura foi conduzido de acordo com a seguinte sequência: pasteurização a 72-75 ºC por 15 s, pré-aquecimento a 85º C, esterilização a 142-145 ºC por 2 s por injeção direta de vapor ao leite, remoção da água condensada, resfriamento a 70 ºC, homogeneização, resfriamento a 20 ºC, envase asséptico em embalagens cartonadas de 1L e armazenamento à temperatura ambiente por 120 dias. As contagens de psicrotróficos foram determinadas no leite pasteurizado por contagem padrão em placas. As frações de caseína (as1, as2, beta e k) foram avaliadas no leite longa vida nos dias 8 e 120 de armazenamento por cromatografia líquida de alta eficiência. Foi observado aumento na quantidade de as2-caseína e redução da as2-caseína como porcentagem da caseína total ao final do armazenamento (P<0,05). Houve correlação positiva (P<0,05) no dia 120 de armazenamento entre psicrotróficos e a fração k-caseína.

Psycrothrophic bacteria can affect the quality of several dairy products. The relationship between psycrothrophic counts in pasteurized milk and casein fractions of ultra-high-temperature (UHT) milk was evaluated. The UHT process was performed according to the following sequence: pasteurization at 72-75 oC for 15 s, pre-heating at 85 oC, sterilization at 142-145 ºC for 2 s by direct steam injection into milk, removing of the condensed water, cooling to 70 ºC, homogenization, cooling to 20 ºC, bottling aseptically in 1-L sterile carton boxes and storage at room temperature for 120 days. Psycrothrophic counts were determined in pasteurized milk by standard plate count. Casein fractions (as1, as2, beta and k) were analyzed in UHT milk on days 8 and 120 by high performance liquid chromatography. It was observed increase in quantity of as2-casein and reduction of as2-casein as a percentage of total casein at the end of storage period (P<0,05). There was a positive correlation (P<0,05) on day 120 of storage between psychrotrophic and the k-casein fraction (P<0.05).

El mecanismo de muerte celular programada y su importancia en el proceso de maduración de la carne bovina / The mechanism of programmed cell death and its importance in the process of beef ripening

El objetivo de este artículo es presentar el mecanismo de muerte celular programada y las evidencias que apoyan su relación con el proceso de maduración de la carne bovina. La terneza de la carne bovina es quizá una de las características más importantes para los consumidores, pues hace de la carne un producto deseable en los mercados mundiales e influye en su precio y calidad. Estas características dependen de factores genéticos, nutricionales y ambientales. Aunque en Colombia aún no existe la cultura de la trazabilidad de los productos cárnicos en los supermercados, se prevée que en un futuro cercano aumente el número de consumidores en América Latina y que ellos tendrán también la posibilidad de exigir las mejores carnes. Descifrar los factores bioquímicos y moleculares que influyen en la maduración de la carnebovina es una tarea amplia que está en sus primeras etapas. Se han descifrado algunas vías implicadas, como la de la calpaína-calpastatina, la proteosómica y la de las catepsinas, proteínas que han sido reconocidas como de influencia positiva en el proceso de degradación dela fibra muscular durante su proceso de maduración. La conversión del músculo en carne es un proceso que comienza una vez que el animal ha sido sacrificado y, por lo tanto, está asociado a los procesos de necrosis y muerte celular. En los últimos años muchos estudios se han orientado hacia la importancia y el aporte del mecanismo de muerte celular programada o apoptosis sobre la terneza de la carne...

The purpose of this paper is to present the mechanism of programmed cell death and theevidence supporting its relation to the ripening of beef. The tenderness of beef is perhapsone of the most important features for consumers, because it makes meat a desirable productin global markets and influences their price and quality. These features depend on genetic,nutritional and environmental factors. Although in Colombia there is still no culture of traceabilityof meat products in supermarkets, an increase in the number of consumers in LatinAmerica is expected in the near future and they will also have the option of demanding thebest meat. Deciphering the biochemical and molecular factors that influence the ripeningof beef is a large task that is still in its early stages. Some pathways involved have been deciphered,such as the calpain-calpastatin, the proteasomal and that off cathepsins, proteins that have been recognized as a positive influence in the process of muscle fiber degradation duringthe ripening process. The conversion of muscle onto flesh is a process that begins oncethe animal has been sacrificed and, therefore, it is associated with the processes of cell deathand necrosis. In recent years, many studies have focused on the importance and contributionof the programmed cell death mechanism or apoptosis on meat tenderness...

O objetivo deste artigo é apresentar o mecanismo de morte celular programada e as evidênciasque apoiam sua relação com o processo de maturação da carne bovina. A maciez da carneé talvez uma das características mais importantes para os consumidores, pois faz da carneum produto desejável nos mercados mundiais e influi no seu preço e qualidade. Estas característicasdependem de fatores genéticos, nutricionais e ambientais. Embora na Colômbiaainda não exista uma cultura da rastreabilidade dos produtos de carne nos supermercados,espera-se que no futuro próximo aumente o número de consumidores na América Latinae eles também terão também a possibilidade de exigir melhores carnes. Decifrar os fatoresbioquímicos e moleculares que influem na maturação da carne bovina é uma tarefa amplaque está em seus estágios iniciais. Foram decifradas algumas vias envolvidas, tais como asdas calpaína-calpastatina, a proteassômica e a das catepsinas, proteínas que foram reconhecidascomo de influência positiva no processo de degradação da fibra muscular duranteseu processo de maturação. A conversão do músculo em carne é um processo que começaquando o animal é sacrificado e, portanto, está associado com os processos de necrose emorte celular. Nestes últimos anos muitos estudos se concentraram na importância e na contribuiçãodo mecanismo de morte celular programada ou apoptose sobre a maciez da carne...

Psicrotróficos em leite pasteurizado / Psychrotrophic in pasteurized milk

Problemas atuais em leite pasteurizado tem causado perdas constantes, sobretudo por características de desenvolvimento microbiano à temperatura de estocagem no mercado (±20ºC) causando proteólise, acidificação, por vezes produção gasógena. Os psicrotróficos em leite pasteurizado resultaram da adaptabilidade microrgânica a baixas temperaturas devido principalmente ao reaproveitamento do leite de retorno do mercado reincorporado ao leite destinado à pasteurização e envase. Como a pasteurização não elimina todos os microrganismos do leite, esse fator foi decisivo para adaptabilidade e desenvolvimento dos psicrotróficos no leite pasteurizado. Em algumas regiões brasileiras, as águas duras ou caucáreas empregadas na higienização, conjuntamente aos óxidos dos produtos de limpeza tornam maior o problema por causar as chamadas pedras de leite e biofilmes, derivados das precipitações dos nutrientes do leite durante a termização do produto ou na higienização dos equipamentos.

Atividade de plasmina e plasminogênio no leite longa vida com alta e baixa contagem de células somáticas durante o armazenamento / Activity of plasmin and plasminogen in ultra high temperature milk with high and low somatic cell counts during storage

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da contagem de células somáticas (CCS) do leite na atividade de plasmina e plasminogênio durante o período de armazenamento do leite longa vida integral. Os leites crus foram categorizados em grupos de CCS de baixa (342.000-487.000 células mL-1) e alta contagem (603.000-808.000 células mL-1). Dois lotes de leite longa vida em cada categoria de CCS foram analisados para determinação de plasmina e plasminogênio após 10, 30, 60, 90 e 120 dias de armazenamento em temperatura ambiente. Para a fabricação do leite longa vida, o leite cru foi submetido à pasteurização rápida seguida da esterilização industrial do leite por injeção de vapor pelo método direto e embalagem asséptica do produto. A CCS não apresentou efeitos sobre as características físico-químicas do leite cru, e nem sobre a atividade de plasmina e plasminogênio nos leites cru e longa vida, armazenados por 120 dias. Entretanto, independentemente da CCS, a atividade de plasmina e plasminogênio aumentou no leite longa vida ao longo do armazenamento, indicando a possibilidade de aumento da proteólise no produto durante sua vida de prateleira.

This study aimed to evaluate the effect of somatic cell counts (SCC) in milk on plasmin and plasminogen activities of ultra high temperature (UHT) milk during storage. Raw milks were categorized in SCC groups of low (342,000-487,000 cells mL-1) and high cells (603,000-808,000 cells mL-1). Two replicates of UHT milks within each SCC category were analyzed for plasmin and plasminogen activities after 10, 30, 60, 90 and 120 days of storage at room temperature. For manufacture of UHT milk, raw milk was pasteurized and sterilized by direct vapor injection process, followed by aseptic packaging. SCC had no effect on physical-chemical characteristics of raw milk, and on plasmin or plasminogen activities in raw and UHT milks during 120 days of storage. However, independently of the SCC in raw milk, the activity of plasmin and plasminogen increased in UHT milk during storage, hence indicating a possible increase in proteolysis in the product during its shelf-life.

Estudo e caracterização do processo de glutatiolação e desglutatiolação da unidade 20S do proteassomo da levedura Saccharomyces cerevisiae: Implicações na regulação do metabolismo redox intracelular e na geração de peptídeos / Study and characterization of the S-glutathiolation and deglutathiolation of the 20S proteasome core from the yeast Saccharomyces cerevisiae: Implications on the intracellular redox metabolism and peptide generation

O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal...

The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses...

Alterações promovidas pelo treinamento físico no edema pulmonar e perda de massa muscular em ratos portadores de tumor Walker-256 / Alterations caused by physical training in pulmonary edema and loss of muscle mass in rats with Walker-256 tumor

O tumor Walker-256 é um carcinoma de crescimento rápido e tem sido estudado sob vários aspectos metabólicos, associados ou não, à caquexia. Foi observado, em nosso laboratório, que em animais portadores de tumor Walker-256 após morte espontânea (geralmente em torno do décimo quinto dia) apresentavam edema pulmonar significativo com presença de líquido na cavidade pleural. Alguns trabalhos têm sugerido que o treinamento físico melhora a sobrevida de animais com tumor e minimiza os efeitos da caquexia. O objetivo de nosso trabalho foi o de avaliar o índice de edema pulmonar e massa muscular esquelética e cardíaca, além da sobrevida de ratos portadores de tumor Walker-256 submetidos previamente a treinamento físico por natação (N). Para este estudo, foram usados ratos Wistar machos (200 a 220g), submetidos ao treinamento físico por natação (1 hora; 5 dias/semana,4 semanas). Um dia após o treinamento, ratos sedentários (C) ou treinados (N) foram submetidos à inoculação no flanco direito de 8 x 107 células de tumor de Walker 256 (T). Imediatamente após a morte espontânea desses animais, foram avaliados o índice de edema pulmonar (IEP), a massa musculares esquelética (gastrocnêmio e soleus) e cardíaca. O edema pulmonar foi avaliado pelo índice calculado pela relação entre os pesos pulmonar e corporal de cada animal, e multiplicada por 100 (PP/PC x 100) (LEEet al., 2001). O índice de massa muscular (IMM) foi calculado de forma similar. Em animais normais,o IEP é igual a 0,53±0,02 (n=20). Em ratos portadores de tumor após a morte espontânea apresentaramIEP significativamente maior (2,62±0,31, n=18). Após o treinamento físico em animais sem tumor, oIEP foi de 0,55±0,03 (n=5). Já em animais portadores de tumor previamente treinados obteve-se umíndice de edema inferior ao grupo controle com tumor (1,46±0,16, n=5; p<0,05)...

Walker-256 tumor is a fast-growing tumor and has been studied under several metabolic aspects associated or not to cachexia. It was observed in our laboratory that animals with Walker-256 tumor,after spontaneous death (usually around the fifteenth day), showed significant pulmonary edema withfluid in the pleural cavity. Some studies have suggested that physical training improves the survival of animals with tumor and minimizes the effects of cachexia. The purpose of our work was to assess the pulmonary edema index as well as the cardiac and skeletal muscle mass, besides the survival of rats with Walker-256 tumor submitted previously to physical training through swimming (N). For this studymale Wistar rats (200 to 220 g) were used, submitted to physical training through swimming (1 hour;5 days a week, four weeks). One day after the training, sedentary rats (C) or trained ones (N) weresubmitted to inoculation on the right flank of 8 x 107 Walker-256 tumor cells (T). Immediately after spontaneous death of these animals, the pulmonary edema index (PEI), cardiac and skeletal musclemass (gastrocnemius and soleus) were evaluated. Pulmonary edema was evaluated through the indexcalculated by the relation between lung and body weights of each animal, and multiplied by 100 (PP/PCx 100) (LEE et al., 2001). Muscle mass (MM) index was calculated similarly. In normal animals the PEIis equal to 0,53±0,02 (n=20). In tumor-bearing rats after spontaneous death the PEI was significantly higher (2,62±0,31, n=18). After the physical training in rats without tumor, the PEI was 0,55±0,03 (n=5).Whereas in tumor-bearing rats previously trained, it was obtained a pulmonary edema index lower thanthat of the control group with tumor (1,46±0,16, n=5; p<0,05).