Drought stress enhances the efficiency of floral dip method of Agrobacterium-mediated transformation in Arabidopsis thaliana / Estresse hídrico aumenta a eficiência do método de imersão floral de transformação mediado por Agrobacterium em Arabidopsis thaliana

ABSTRACT

The Agrobacterium-mediated floral dip protocol is the most extensively used transformation method for a model plant Arabidopsis thaliana. Several useful methods for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformations of Arabidopsis are existing, but they are time consuming and with low transformation efficiency. Here, we developed a transgenic Arabidopsis lines TET12pTET12-RFP in a short period of time and enhanced transformation efficiency by using a modified transformation method by applying drought stress after floral dip. In this protocol, Agrobacterium cells carrying TET12pTET12-RFP recombinant vectors were resuspended in a solution of 5% sucrose, 0.05% (v/v) silwet L-77 to transform female gametes of developing Arabidopsis inflorescences. Treated Arabidopsis were then applied with different levels of drought stresses to stimulate plants for the utilization of maximum plant energy in seed maturation process. The applied stresses achieved the fast maturation of already treated inflorescences while stopped the growing of newly arising untreated inflorescence, thus decreased the chances of wrong collection of untransformed seeds. Consequently, the collected seeds were mostly transgenic with a transformation frequency of at least 10%, thus the screening for positive transformants selection was more advantageous on a selective medium as compared to a classical floral dip method. Within 2-3 months, two hundred of individual transgenic plants were produced from just 10 infiltrated plants. This study concludes that application of drought stresses in a specific stage of plant is a beneficial strategy for achieving the transgenic Arabidopsis in a short period of time with high transformation efficiency.

RESUMO

O protocolo de imersão floral mediado por Agrobacterium é o método de transformação mais amplamente utilizado para uma planta-modelo Arabidopsis thaliana. Existem vários métodos úteis para transformações de Arabidopsis mediados por Agrobacterium tumefaciens, mas são demorados e com baixa eficiência de transformação. Aqui, desenvolvemos uma linha transgênica de Arabidopsis TET12pTET12-RFP em um curto período de tempo e eficiência de transformação aprimorada usando um método de transformação modificado por meio da aplicação de estresse hídrico após o mergulho floral. Neste protocolo, células de Agrobacterium transportando vetores recombinantes TET12pTET12-RFP foram ressuspensas em uma solução de 5% de sacarose, 0,05% (v/v) silwet L-77 para transformar gametas femininos de inflorescências de Arabidopsis em desenvolvimento. Arabidopsis tratadas foram então aplicadas com diferentes níveis de estresse hídrico para estimular as plantas a utilizar o máximo de energia da planta no processo de maturação das sementes. Os estresses aplicados alcançaram a rápida maturação das inflorescências já tratadas enquanto paravam o crescimento de inflorescências não tratadas recém-surgidas, diminuindo, assim, as chances de coleta errada de sementes não transformadas. Consequentemente, as sementes coletadas eram principalmente transgênicas, com uma frequência de transformação de pelo menos 10%; portanto, a triagem para seleção dos transformantes positivos foi mais vantajosa em um meio seletivo em comparação com um método clássico de imersão floral. Dentro de 2-3 meses, 200 plantas transgênicas individuais foram produzidas a partir de apenas 10 plantas infiltradas. Este estudo conclui que a aplicação de estresse hídrico em um estágio específico da planta é uma estratégia benéfica para alcançar a Arabidopsis transgênica em um curto período de tempo com alta eficiência de transformação.