Atividade de novos derivados de tiazolidinodionas sobre a diferenciação de pré-osteoblastos e pré-adipócitos / Activity of new derivatives of thiazolidinediones on differentiation of preosteoblasts and preadipocytes

RESUMO

As tiazolidinodionas (TZDs) são sensibilizadores de insulina utilizados no tratamento do diabetes mellitus tipo 2. Contudo, apesar dos efeitos benéficos sobre a glicemia, importantes efeitos adversos incluindo perda óssea e aumento de adiposidade são relatados com o uso clínico das TZDs. Assim, é necessário o desenvolvimento de novos derivados de TZDs com potenciais efeitos benéficos sobre a hiperglicemia e menos efeitos adversos. Neste estudo, investigamos os efeitos de 5 novos derivados de TZDs (LYSO-7, GQ-89, GQ-150, GQ-177 e SF-3) sobre a diferenciação celular de pré-osteoblastos murinos MC3T3-E1, pré-adipócitos murinos 3T3-L1 e pré-adipócitos SGBS de linhagem humana. Seus potenciais efeitos sobre a utilização de glicose, a produção de adipocinas e mediadores pró-inflamatórios também foram avaliados, utilizando linhagens murinas e humanas de adipócitos, e macrófagos THP-1 de linhagem humana. O principal achado de nosso estudo foi que os novos derivados de TZDs estimulam a utilização celular de glicose, porém não alteram o processo de diferenciação celular de pré-osteoblastos e pré-adipócitos, quando comparados com a TZD clássica Rosiglitazona. Conforme esperado, o tratamento com Rosiglitazona na concentração de 5 µM inibiu a osteogênese de pré-osteoblastos murinos MC3T3-E1. No entanto, o tratamento com 2 novos derivados de TZDs (GQ-89 e GQ-177) na mesma concentração não afetou a diferenciação celular, sendo possível observar níveis de mineralização de matriz extracelular similares aos do grupo controle. Além disso, enquanto a GQ-89 estimulou a atividade da fosfatase alcalina, a GQ-177 não modulou sua atividade enzimática e induziu a expressão gênica de osteocalcina. Contudo, ambos inibiram a expressão de Runx2 e colágeno. Por sua vez, quando os efeitos foram avaliados sobre a diferenciação de adipócitos, foi possível observar que ao contrário do efeito pró-adipogênico constatado com a Rosiglitazona na concentração de 1 µM, as TZDs GQ-150, GQ-177, LYSO-7 e SF-3 foram incapazes de induzir o acúmulo lipídico em pré-adipócitos murinos e humanos. Além disso, a GQ-150 inibiu a expressão gênica de C/EBPα, assim como a expressão gênica e os níveis protéicos de CD36, enquanto que a SF-3 estimulou a expressão gênica de C/EBPα e de FABP4 e diminuiu a expressão gênica e os níveis protéicos de CD36, os quais não foram modificados pela LYSO-7 em pré-adipócitos murinos 3T3-L1. No entanto, em pré-adipócitos SGBS de linhagem humana, nenhum efeito sobre os marcadores de fenótipo adipogênico C/EBPα e FABP4 foi observado com os novos derivados de TZDs. Ademais, os novos derivados de TZDs não interferiram na via de sinalização de Wnt, não apresentaram qualquer efeito sobre a expressão de adipocinas (adiponectina, resistina e leptina) e mediadores pró-inflamatórios (IL-6, CCL2/MCP-1, TNF-α e JNK), bem como não ativaram o fator de transcrição PPARγ no ensaio de gene repórter. Por sua vez, a LYSO-7, GQ-150 e SF-3 aumentaram o consumo de glicose em presença de insulina em adipócitos 3T3-L1 e modificaram a atividade de enzimas mitocondriais em adipócitos SGBS e macrófagos THP-1. Entretanto, o efeito sensibilizador de insulina foi confirmado somente com a GQ-177 pelo aumento da captação de glicose e somente a LYSO-7 e a SF-3 foram capazes de inibir o consumo de oxigênio e modificar a taxa de glicólise em macrófagos, sugerindo que também poderiam alterar os níveis de ATP/ADP. Considerando que baixos níveis de ATP estimulam a via de sinalização de AMPK, essa via também foi investigada em nosso estudo. Entretanto, os resultados sobre a ativação de AMPK foram inconclusivos. Desse modo, nossos resultados apontam que os novos derivados de TZDs não atuam como ligantes de PPARγ, apresentam atividade sensibilizadora de insulina in vitro, e que exercem menores efeitos antiosteoblásticos e adipogênicos quando comparados com a Rosiglitazona. Mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos responsáveis por esses efeitos, bem como para estabelecer se os novos derivados de TZDs são mais seguros in vivo, com relação ao risco de fraturas ósseas e ganho de massa adiposa

ABSTRACT

Thiazolidinediones (TZDs) are insulin sensitizers used in the treatment of type 2 diabetes mellitus. However, despite the beneficial effects on blood glucose, significant adverse effects including bone loss and increased adiposity are reported with the clinical use of TZDs. Thus, it is necessary to develop new derivatives of TZDs with potential beneficial effects on hyperglycemia and fewer adverse effects. In this study, we investigated the effects of 5 new derivatives of TZDs (LYSO-7, GQ-89, GQ-150, GQ-177 e SF-3) on cellular differentiation in murine MC3T3-E1 preosteoblasts, murine 3T3-L1 preadipocytes, and SGBS preadipocytes from human lineage. Potential effects on glucose consumption, adipokines, and pro-inflammatory mediators were also assessed using murine and human strains of adipocytes, and macrophages from human THP-1 lineage. The main finding of this study was that new derivatives of TZDs stimulate glucose consumption, but do not change the cell differentiation process of preosteoblasts and preadipocytes compared to classical TZD Rosiglitazone. As expected, the treatmet with Rosiglitazone, at 5µM, inhibited the osteogenesis in murine MC3T3-E1 preosteoblasts. However, the treatment with 2 new derivatives of TZDs (GQ-89 and GQ-177) at the same concentration did not affect cell differentiation, and levels of mineralization of the extracellular matrix similar to the control group were observed. In addition, whereas the GQ-89 stimulated the activity of alkaline phosphatase, GQ-177 does not modulate its enzymatic activity and induced gene expression of osteocalcin. However, both of them inhibit the expression of Runx2 and collagen. In turn, when the effects were assessed on the adipocyte differentiation, unlike the proadipogenic effect observed with Rosiglitazone at a concentration of 1 µM, the new TZDs GQ-150, GQ-177, LYSO-7 and SF-3 were unable to induce lipid accumulation in human and murine preadipocytes. In addition, GQ-150 inhibited the gene expression of C/EBPα , as well as the gene expression and protein levels of CD36, whereas SF-3 stimulated the gene expression of C/EBPα and FABP4 and decreased gene expression and protein levels of CD36, which was not modified by LYSO-7 on murine 3T3- L1 preadipocytes. However, no effect on markers of adipogenic phenotype C/EBPα and FABP4 has been observed with the novel derivatives of TZDs in human SGBS preadipocytes. Furthermore, the new derivatives of TZDs do not interfere with the Wnt signaling pathway, showed no effect on the adipokines expression (adiponectin, resistin and leptin) and proinflammatory mediators (IL-6, CCL2 / MCP-1, TNF α and JNK) and did not activate the transcription factor PPARγ in the gene reporter assay. In turn, LYSO-7, GQ-150, and SF-3 increased glucose consumption in the presence of insulin in 3T3-L1 adipocytes and modified the activity of mitochondrial enzymes in SGBS adipocytes and THP-1 macrophages. However, the effect on insulin sensitization was confirmed only to GQ-177 that increased glucose uptake and just LYSO-7 and SF-3 were able to inhibit oxygen consumption and modify the rate of glycolysis in macrophages, suggesting that they could also alter the levels of ATP/ADP. Since low levels of ATP could stimulate AMPK pathway, this signaling pathway was also investigated in our study. However, the results on the AMPK activation were inconclusive. Thus, our results demonstrate that the new derivatives of TZDs do not act as PPARγ ligands, present insulin sensitizing activity in vitro, and display minor antiosteoblastic and adipogenic effects when compared to Rosiglitazone. More studies are needed to elucidate the exact mechanisms responsible for these effects, as well as to establish whether the safety of the new TZDs with respect to the risk of bone fractures and body mass gain using in vivo models