Ações da β-micrustoxina, uma fosfolipase A2 do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, sobre a proliferação celular e a apoptose de astrócitos em cultura e os mecanismos envolvidos. / Actions of β-micrustoxin, a phospholipase A2 of the venom of the snake Micrurus lemniscatus, on cell proliferation and apoptosis of astrocytes in culture and the mechanisms involved.

ABSTRACT

Toxins that exhibit phospholipase A2 (PLA2) activity are present in snake venoms from Elapidae and Viperidae families. They are neurotoxic and act by impairing synaptic transmission from the neuromuscular junction. Although the principal target of these toxins is the neuromuscular junction, there are several studies that have used neuronal cells from central structures in order to characterize their mechanism of action and this model has proved to be very useful. In relation to glial cells, however, there are few studies showing some effect of PLA2 from animal venoms. Glial cells, astrocytes in particular, have important roles in the central and peripheral nervous system, being part of the synapses. The objective of this study was to characterize the action of the PLA2 toxin, β-micrustoxin, isolated from Micrurus lemniscatus snake venom, on cultured astrocytes, addressing cell viability, cell proliferation, cell cycle phases distribution, protein expression of p53, p27 and p21, cell senescence and mitochondrial membrane potential. Gene and protein expression of the phospholipase A2 receptor (PLA2R) was evaluated, as well as the internalization process in cultured astrocytes and hippocampal neurons. The partial toxin primary sequence was also characterized by proteolytic digestion and by comparison of the peptides acquired with data bases. Astrocytes and neurons were obtained from Wistar rats (CEUAIB – Protocolo n°1223/14) and maintained in culture in DMEM medium + 10% SFB or Neurobasal medium + B27, respectively, at 37°C, 5% CO2. Astrocytes were incubated with β–micrustoxin for several times. Cell viability was evaluated by MTT test; cell proliferation, cell cycle phases and p53, p21 and p27 proteins were evaluated by flow cytometry. Cell senescence was analyzed by β-galactosidase assay and mitochondrial potential was also analyzed by using the TMRE probe. In order to investigate the internalization process, β-micrustoxin was conjugated to Alexa 488 fluorophore and the cells observed in confocal microscopy, in normal medium and with the PLA2 activity inhibited. β-micrustoxin reduced cell viability and cell proliferation of astrocytes. The G2/M phase was augmented and does not was verified DNA fragmentation nor mitochondrial potential alteration. β-micrustoxin induced increase in the cell cycle regulatory proteins, p53, p21 and p27. β-micrustoxin conjugated with Alexa 488 internalized in astrocytes and neurons. This process is dependent on PLA2 activity in neurons, but not in astrocytes. PLA2R is expressed very acutely in astrocytes but it is also expressed in hippocampal neurons, even though in minor quantities. The data allowed to conclude that β-micrustoxin interferes in astrocytes cell proliferation, by inducing a cell cycle arrest in G2/M phase and this effect is mediated by p53, p21 and p27, without evidence of cell death. Moreover, there are evidences that β-micrustoxin would induce its effects throughout its internalization in the cell cytosol. This study contributes to a better understanding of the cell events involved in the toxicity induced by the PLA2 β-micrustoxin, isolated from the venom of the snake Micrurus lemniscatus. Besides, it opens a perspective of developing new drugs that could have inhibitory actions on cell proliferation.

RESUMO

Toxinas com atividade de fosfolipase A2 (FLA2) são encontradas em venenos de serpentes das famílias Elapidae e Viperidae e são caracterizadas por sua atividade neurotóxica, ocasionando o bloqueio da junção neuromuscular. Apesar de o alvo dessas toxinas ser a junção neuromuscular, vários estudos utilizaram células neuronais centrais para caracterizar seus mecanismos de ação e estas se mostraram um bom modelo. Pouco se conhece, no entanto, sobre as atividades desempenhadas por essas enzimas em células da glia, como os astrócitos, sendo que este tipo celular desempenha funções importantes tanto no sistema nervoso central quanto periférico. O objetivo deste estudo foi caracterizar as ações da toxina FLA2 β-micrustoxina, isolada do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, em astrócitos em cultura, quanto à viabilidade celular, proliferação celular, distribuição das fases do ciclo celular, expressão de proteínas regulatórias p53, p27 e p21, senescência celular e potencial da membrana mitocondrial. Ainda, avaliou-se a expressão proteica e gênica do receptor para FLA2 (FLA2R) e a ocorrência do processo de internalização da toxina em astrócitos e neurônios hipocampais em cultura. A sequência primária parcial da toxina foi identificada pela obtenção de fragmentos peptídicos por digestão proteolítica e comparação com base de dados. Astrócitos e neurônios hipocampais de ratos Wistar (CEUAIB – Protocolo n°1223/14) foram mantidos em cultura em meio DMEM + 10% SFB e meio Neurobasal + B27, respectivamente, a 37°C, 5% CO2. Os astrócitos foram tratados com a β–micrustoxina por diferentes períodos de tempo. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT e a proliferação celular, as fases do ciclo celular e as proteínas p53, p21 e p27 foram avaliadas por citometria de fluxo. A senescência celular foi avaliada pelo ensaio de β- galactosidase e o potencial da membrana mitocondrial foram avaliados utilizando a sonda TMRE. Para a análise da internalização celular, a β-micrustoxina foi conjugada ao fluoróforo Alexa 488 e observado o processo de internalização em microscópio confocal, em condições normais ou com a inibição da atividade FLA2. A β-micrustoxina reduziu a viabilidade e a proliferação celular de astrócitos e houve um predomínio da fase G2/M. Não houve fragmentação do DNA nem alteração do potencial mitocondrial. A β-micrustoxina induziu o aumento das proteínas regulatórias do ciclo celular p53, p21 e p27. Observou-se a internalização da β-micrustoxina tanto em astrócitos como em neurônios. Esse processo é dependente da atividade FLA2 em neurônios, mas não em astrócitos. O FLA2R está expresso em astrócitos com muita intensidade, mas também em neurônios hipocampais. Os dados obtidos permitem concluir que a β-micrustoxina interfere na proliferação celular de astrócitos, induzindo a parada do ciclo celular na fase G2/M, mediada pelas proteínas p53, p21 e p27, sem evidências de indução de morte celular. Além disso, os dados evidenciam que a β-micrustoxina pode induzir os seus efeitos através de sua internalização na célula. Este estudo contribui para o melhor entendimento dos eventos celulares que levam à toxicidade induzida pela FLA2 β-micrustoxina isolada do veneno da serpente Micrurus leminiscatus e abre perspectivas de desenvolvimento de novos fármacos com ações inibitórias sobre a proliferação celular.