Efeito da crotoxina sobre a reprogramação fenotípica dos macrófagos estimulados pelo microambiente tumoral / Crotoxin effect on the phenotypic reprogramming of tumor microenvironment-stimulated macrophages

ABSTRACT

Several studies have shown that Crotoxin (CTX), the major toxin of the Crotalus durissus terrificus snake venom, has an antitumor effect both in experimental models and in clinical trials. Our group has been demonstrating that the antitumor activity of the toxin is also associated with the CTX modulatory actions on the secretory activity of inflammatory mediators (cytokines, reactive oxygen and nitrogen species) and on the energetic metabolism (glycolytic and glutaminolytic pathways) of macrophages. Despite this evidence, it has not been demonstrated to date whether the metabolic alterations induced by CTX establish a phenotypic profile of the resident macrophages and influence the reprogramming of macrophages induced by the tumor microenvironment. Therefore, the present study investigated the effect of CTX on the phenotypic reprogramming of macrophages in the tumor microenvironment. Balb/c mice received administration of different CTX concentrations (0.9 or 5 μg/animal subcutaneously in sterile saline) at the 1st, 6th or 1st and 6th day of inoculation of tumor cells (1x107 /0.5 mL, injected intraperitoneally) of Ehrlich Ascitic Tumor (EAT). After 6 or 13 days of EAT induction, we analyzed a) immunophenotyping of macrophages; b) total volume of ascitic fluid; total and differential count of cells (tumor and leukocytes) in the ascitic fluid; determination of nitric oxide (NO) production and secretion of cytokines IL-1β, IL-10 and release of TNF-. Functional and phenotypic parameters were also established in macrophages obtained from the peritoneal cavity of healthy animals to evaluate the action per se of the toxin. The different doses of CTX, administered on day 1, modulated the macrophages phenotype (M1), accompanied by increased NO production. In healthy animals, the phenotypic profile of macrophages was dependent on the administered dose (0.9 μg/animal M1 and 5 μg/animal M2), accompanied by increased NO production when administered at a dose of 0.9 μg/animal. When the parameters were evaluated on the 6th day after the treatment concomitant to the induction of EAT, there was a significant decrease in ascitic volume, accompanied by the decrease of tumor cells and inhibition of IL-10 production. In healthy animals, both doses induced increased leukocytes in the peritoneal cavity. When the animals were treated with CTX (particularly at the dose of 0.9 μg/animal), on the 6th day of EAT induction, a decrease in the number of tumor cells and inhibition of TNF-α release was again observed. In addition, treatment with CTX induced an increase in the number of leukocytes in the peritoneal cavity of healthy animals. In another treatment protocol, where the animals were treated with two doses given on the 1st and 6th days of EAT induction, the ascitic volume decreased again, accompanied by a significant increase in TNF-α release. Therefore, the data obtained in the present study indicate that CTX interferes with the phenotypic reprogramming of macrophages, as well as with the secretory state of these cells, influencing events involved with tumor progression.

RESUMO

Diferentes estudos demonstraram que a Crotoxina (CTX), toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus apresenta efeito antitumoral, tanto em modelos experimentais como em ensaios clínicos. Nosso grupo vem demonstrando que a atividade antitumoral da toxina também está associada às ações moduladoras da CTX sobre a atividade secretória de mediadores inflamatórios (citocinas, espécies reativas intermediárias do oxigênio e do nitrogênio e lipoxinas) e sobre o metabolismo energético (vias glicolítica e glutaminolítica) de macrófagos. Apesar dessas evidências, não foi demonstrado até o momento se as alterações metabólicas induzidas pela CTX estabelecem um perfil fenotípico dos macrófagos residentes e se influenciam a reprogramação de macrófagos induzida pelo microambiente tumoral. Portanto, o presente estudo investigou o efeito da CTX sobre a reprogramação fenotípica de macrófagos no microambiente tumoral. Camundongos Balb/c receberam a administração de diferentes concentrações CTX (0,9 ou 5 μg/animal, via subcutânea, em salina estéril), no 1o, 6o ou 1o e 6o dias da inoculação de células tumorais (1x107 /0,5 mL, i.p) de Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE). Após 6 ou 13 dias da indução do TAE, foram analisados a) imunofenotipagem dos macrófagos; b) volume total do líquido ascítico; contagem total e diferencial de células (tumorais e leucócitos) presentes no líquido ascítico; determinação da produção de óxido nítrico (NO) e secreção das citocinas IL-1β, IL-10 e liberação de TNF-. Os parâmetros funcionais e fenotípicos também foram estabelecidos em macrófagos obtidos da cavidade peritoneal de animais saudáveis, para avaliar a ação per se da toxina. As diferentes doses de CTX, administrada no 1o dia, modularam o fenótipo dos macrófagos (M1), acompanhado pelo aumento da produção de NO. Em animais saudáveis, o perfil fenotípico dos macrófagos foi dependente da dose administrada (0,9 μg/animal M1 e 5 μg/animal M2), acompanhado pelo aumento da produção de NO, quando administrada a dose de 0,9 μg/animal. Quando os parâmetros foram avaliados no 6o dia após o tratamento concomitante à indução da TAE, houve diminuição significativa do volume ascítico, acompanhado pela diminuição de células tumorais e inibição da produção de IL-10. Em animais saudáveis, ambas as doses induziram aumento de leucócitos na cavidade peritoneal. Quando os animais foram tratados com CTX (particularmente na dose de 0,9 μg/animal) no 6o dia da indução da TAE, observou-se novamente diminuição do número de células tumorais e inibição da liberação de TNF-. Ainda, o tratamento com a CTX induziu aumento do número de leucócitos na cavidade peritoneal de animais saudáveis. Em outro protocolo de tratamento, onde os animais foram tratados com duas doses, administradas no 1o e no 6o dia da indução da TAE, observou-se novamente a diminuição do volume ascítico, acompanhado por significativo aumento da liberação de TNF-. Portanto, os dados obtidos no presente estudo indicam que a CTX interfere com a reprogramação fenotípica de macrófagos, bem como com o estado secretório dessas células, influenciando eventos envolvidos com a progressão tumoral.