Estudos alternativos: redução do uso de animais para manutenção e análises da virulência de Leptospira usando cultura celular tridimensional (3D)

RESUMO

A leptospirose é uma doença causada por bactérias do gênero Leptospira e ocorre principalmente em países da zona tropical, afetando todos os mamíferos além de aves, anfíbios e répteis. A contaminação ocorre através do contato direto da pele ou mucosas com água ou solos infectados com urina de animais portadores. Quando patogênicas, essas bactérias podem afetar diversos órgãos, causando doença crônica e aguda. Aproximadamente um milhão de casos, e sessenta mil mortes são registrados no mundo. No Brasil, os casos registrados em 2018 ultrapassaram três mil com letalidade próxima a 10%. Para se compreender melhor a patogenicidade e manutenção da virulência, diversos modelos animais, susceptíveis são utilizados, entre eles, hamsters, porquinhos da índia e gerbils. O uso desses animais continua sendo fundamental nos estudos de leptospirose, porem, são testes dispendiosos e de difícil manutenção. Com o intuito de diminuir a utilização de animais, estabelecemos um novo modelo que contribua na manutenção e nos estudos de virulência de Leptospira. Para isso, foi proposto o modelo celular tridimensional por se aproximar do padrão in vivo e auxiliar nos estudos de interação patógeno – hospedeiro. O modelo foi estabelecido com células epiteliais de pulmão humano, linhagem A549, cultivadas em meio DMEM, Matrigel® e Ágar e infectadas com dois tipos de sorovares L. interrogans sv. Canicola e sv. Copenhageni. As células foram infectadas em diferentes concentrações (102, 104 e 106). As culturas foram analisadas após 2, 24, 48, 72 horas e 5 dias. As células foram fixadas em paraformoldeído 4% e em seguida efetuadas as imunohistoquímicas, utilizando IgG conjugado a FITC, DAPI e azul de Evans, seguida de analises em microscopia confocal. Nossos resultados mostraram que a concentração inicial de bactérias é um parâmetro crucial para a infecção. Além disso, os dois sorovores apresentaram comportamento de invasão de maneira oposta nos períodos iniciais. Observamos Copenhageni dentro das células em poucas horas, diferentemente do sorovar Canícola, onde foi visualizado um maior número de bactérias dentro das células nos períodos mais tardios. Os testes utilizando Agar e matrigel mostraram-se promissores e podem ser um modelo alternativo e econômico para estudos da virulência de Leptospira. Estudos mais detalhados são necessários a fim de tornar a técnica um modelo padrão nos estudos de virulência desse patógeno em cultura tridimensional.