Ação da disintegrina insularina (GST-INS) na expressão de genes pró-metastáticos de células de melanoma (SK-MEL-28) estimuladas por plaquetas

ABSTRACT

The αIIbβ3 integrin expressed on the surface of platelets and the αvβ3 integrin, expressed in tumor cells, mainly melanomas, modulate cell adhesion, migration, cell growth and survival. In addition, it generates activation of tumorigenic factors, that is, genes expressed by the tumor machinery capable of generating aggressive phenotypes favoring adhesion, angiogenesis and tumor proliferation. Therefore, this study aimed to evaluate the ability of activated platelet membranes to stimulate SK-MEL-28 melanoma cells to express pro-metastatic genes such as αV, MCAM, β3, MMP9, MMP2, NFκb and PIK3 and to identify the ability of the recombinant disintegrin, insularin GST-INS to negatively modulate these mechanisms. For this, real-time PCR standardization assays were performed with cDNA extracted from the incubation of platelet membranes obtained from whole blood of healthy donors with SK-MeL-28 cells treated or not with Insularin (GST-INS) and GST (control protein).; the activated membrane was collected by centrifugation of PRP (platelet-rich plasma) followed by heat shock (37oC and PBS at 4oC). The results of real time PCR assays showed that platelet membranes stimulate the expression of αlphaV integrin, NFκb and PIK3 genes in melanoma cells, but do not stimulate MMP9, MMP2, MCAM and β3 genes, and the GST-INS does not appear to have a modulatory action in these mechanisms. We conclude that platelets are a major pro-metastatic modulating factor and further assays with consolidated standardization and evaluation of other genes expressed by the tumor that generate metastatic potentials are still needed.

RESUMO

A integrina αIIbβ3 expressa na superfície de plaquetas e a integrina αvβ3, expressa em células tumorais, principalmente melanomas, modulam adesão celular, migração, crescimento celular e sobrevivência. Além disso, gera ativação de fatores tumorigênicos, ou seja, genes expressos pela maquinaria tumoral capazes de gerar fenótipos agressivos favorecendo adesão, angiogênese e proliferação tumoral. Portanto, esse grupo busca avaliar a capacidade de membranas plaquetárias ativadas em estimular células de melanoma SK-MEL-28 a expressar genes pró-metastáticos como αV, MCAM, β3, MMP9, MMP2, NFκb e PIK3 e avaliar a capacidade da proteína recombinante insularina GST-INS em modular negativamente ou positivamente a comunicação entre célula tumoral-plaqueta. Para isso, foi realizado ensaios de padronização de PCR real time com o cDNA extraído da incubação de membranas plaquetárias obtidas de sangue total de doadores saudáveis com células SK-Mel-28 tratadas ou não com Insularina (GST-INS) e GST (proteína controle); a membrana ativada foi coletada a partir da centrifugação do PRP (plasma rico em plaquetas) seguida de choque térmico (37o C e PBS a 4oC). Os resultados dos ensaios de PCR real time demonstraram que membranas plaquetárias estimulam a expressão dos genes αV, NFκb e PIK3 em células melanoma, mas não estimulam genes MMP9, MMP2, MCAM e β3 e a proteína recombinante insularina parece não apresentar ação modulatória. Concluímos que plaquetas são um fator principal de modulação pró-metastático e, ainda será necessário novos ensaios com a padronização consolidada e avaliação de outros genes expressos pelo tumor que geram potenciais metastáticos.