Resumo
This study aimed at optimizing techniques for preparing clonal leaflet extracts and identifying buffers and migration conditions so as to achieve better resolution of electrophoretic patterns in rubber tree clones. Twenty-five enzymatic systems in eleven gel and electrode buffers were tested. Similar electrophoretic profiles were obtained from extracts of clones in different phenological stages, in samples submitted to different centrifugation conditions and in plants from the same clone. Extracts from liophylized leaflets showed the same electrophoretic resolution as nonliophylized leaflets after two days for Adh, Pgi, 6Pgdh, Lap-1, Skd, Acp, Mdh-1, ß-Glu, Pgm and Idh. Got and Est electrophoretic patterns were well resolved only in fresh leaflets extracts. The other enzymes studied did not show a good electrophoretic resolution. Employing different types of substrates, nine regions of esterase activity were observed under the conditions used, although genetic variation has been characterized for only three loci in the clones analysed. Est-7 phenotypes observed using naphtyl-esters were similar to patterns found using L-benzoyl--naphtylamide assubstrate, suggesting that this esterase is an endopeptidase. The use of fluorogenic substrates allows the detection of a new electrophoretic Acp variant in Hevea nitida and another Glu variant in Hevea rigidifolia leaflet extracts.
Este estudo foi conduzido no sentido de otimizar as técnicas de preparo de extratos de folíolos e identificar tampões e condições de corrida que proporcionassem uma boa definição dos perfis eletroforéticos de clones de seringueira. Foram testados 25 diferentes sistemas enzimáticos utilizando-se onze sistemas tamponantes. Não foram encontradas diferenças na qualidade dos zimogramas obtidos nos diferentes estádios fenológicos analisados, em amostras submetidas a diferentes condições de centrifugação e nas diferentes plantas de um mesmo clone. Extratos de folíolos liofilizados apresentaram resolução semelhante para Adh, Pgi, 6Pgdh, Lap-1, Skdh, Acp, Mdh, ßGlu, Pgm e Idh que homogenados de folíolos não liofilizados preparados até 2 dias pós-coleta. Os padrões de Got e Est apresentaram boa nitidez somente em extratos de folíolos frescos. As demais enzimas não apresentaram resolução satisfatória. Com o uso de diferentes substratos, foi possível detectar nove regiões de atividade esterásica nas condições empregadas, embora variação genética tenha sido caracterizada para apenas três locos nos clones analisados. Os fenótipos observados para esterase-7 utilizando-se ésteres derivados de naftol foram semelhantes aos padrões encontrados utilizando L-benzoil-ßnaftilamida como substrato, indicando que esta esterase seja, provavelmente, uma en-dopeptidase. A utilização de substratos fluorogênicos permitiu ainda a detecção de uma variante eletroforética de Acp em Hevea nítida e uma variante de ßGlu em Hevea rigidifolia.
Resumo
This study aimed at optimizing techniques for preparing clonal leaflet extracts and identifying buffers and migration conditions so as to achieve better resolution of electrophoretic patterns in rubber tree clones. Twenty-five enzymatic systems in eleven gel and electrode buffers were tested. Similar electrophoretic profiles were obtained from extracts of clones in different phenological stages, in samples submitted to different centrifugation conditions and in plants from the same clone. Extracts from liophylized leaflets showed the same electrophoretic resolution as nonliophylized leaflets after two days for Adh, Pgi, 6Pgdh, Lap-1, Skd, Acp, Mdh-1, ß-Glu, Pgm and Idh. Got and Est electrophoretic patterns were well resolved only in fresh leaflets extracts. The other enzymes studied did not show a good electrophoretic resolution. Employing different types of substrates, nine regions of esterase activity were observed under the conditions used, although genetic variation has been characterized for only three loci in the clones analysed. Est-7 phenotypes observed using naphtyl-esters were similar to patterns found using L-benzoyl--naphtylamide assubstrate, suggesting that this esterase is an endopeptidase. The use of fluorogenic substrates allows the detection of a new electrophoretic Acp variant in Hevea nitida and another Glu variant in Hevea rigidifolia leaflet extracts.
Este estudo foi conduzido no sentido de otimizar as técnicas de preparo de extratos de folíolos e identificar tampões e condições de corrida que proporcionassem uma boa definição dos perfis eletroforéticos de clones de seringueira. Foram testados 25 diferentes sistemas enzimáticos utilizando-se onze sistemas tamponantes. Não foram encontradas diferenças na qualidade dos zimogramas obtidos nos diferentes estádios fenológicos analisados, em amostras submetidas a diferentes condições de centrifugação e nas diferentes plantas de um mesmo clone. Extratos de folíolos liofilizados apresentaram resolução semelhante para Adh, Pgi, 6Pgdh, Lap-1, Skdh, Acp, Mdh, ßGlu, Pgm e Idh que homogenados de folíolos não liofilizados preparados até 2 dias pós-coleta. Os padrões de Got e Est apresentaram boa nitidez somente em extratos de folíolos frescos. As demais enzimas não apresentaram resolução satisfatória. Com o uso de diferentes substratos, foi possível detectar nove regiões de atividade esterásica nas condições empregadas, embora variação genética tenha sido caracterizada para apenas três locos nos clones analisados. Os fenótipos observados para esterase-7 utilizando-se ésteres derivados de naftol foram semelhantes aos padrões encontrados utilizando L-benzoil-ßnaftilamida como substrato, indicando que esta esterase seja, provavelmente, uma en-dopeptidase. A utilização de substratos fluorogênicos permitiu ainda a detecção de uma variante eletroforética de Acp em Hevea nítida e uma variante de ßGlu em Hevea rigidifolia.