Resumo
A dermatofitose e uma doenca fungica comumente vista no atendimento ambulatorial de felinos. A sua importancia clinica e epidemiologica reside no fato de ser uma dermatopatia cosmopolita, infecciosa, contagiosa e zoonotica. Atualmente, o cultivo fungico e a principal ferramenta de diagnostico utilizada, porem a sua morosidade na emissao do resultado indica a necessidade do desenvolvimento de novas estrategias de diagnostico. A aplicacao de tecnologias de imunodiagnostico, bem como tecnologias de sequenciamento da microbiota, tem um grande potencial para contribuir na identificacao e desenvolvimento de novos alvos diagnosticos. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar as proteinas imunodominantes do Microsporum canis para aplicabilidade no sorodiagnostico da dermatofitose felina. Alem disso, objetivou-se avaliar a composicao e a diversidade das microbiotas fungica e bacteriana de gatos com dermatofitose, gatos assintomaticos (carreadores de M. canis) e gatos higidos. Para os ensaios de caracterizacao das proteinas de M. canis, foram colhidas amostras cutaneas e de sangue de 70 felinos: sintomaticos (n= 20), assintomaticos (n= 20), negativos (n = 20) e negativos heterologos (n= 10). As amostras cutaneas foram submetidas a cultivos fungicos para confirmacao diagnostica e subsequente extracao de M. canis e as amostras de sangue foram avaliadas por Western blot uni e bidimensional. Para a realizacao dos ensaios de sequenciamento da microbiota, foram colhidas amostras cutaneas, pelos metodos carpete e escova de dentes, de 45 felinos: sintomaticos (n= 15), assintomaticos (n= 15) e negativos (n= 15). Essas amostras foram submetidas ao sequenciamento de alto rendimento na plataforma Illumina utilizando analise dos genes 16S rRNA e ITS1. Na avaliacao bidimensional das proteinas de M. canis, foi observado que elas se encontravam majoritariamente na faixa de pH de 7 a 3. Ainda, o WB revelou um amplo perfil antigenico com proteinas variando de 150 a 20 kDa em peso molecular. As proteinas de 30 e 42 kDa demonstraram intensa imunorreatividade em felinos sintomaticos e assintomaticos e baixa imunorreatividade nos negativos. O teste de Western blot conseguiu discriminar bem os gatos positivos dos gatos negativos para M. canis demonstrando elevados indices de sensibilidade (92,5%) e especificidade (90%) diagnosticas. Quanto aos resultados da analise de sequenciamento, foi observado que gatos sintomaticos e assintomaticos apresentaram um padrao semelhante na composicao e distribuicao da microbiota. Adicionalmente, nao foi observado diferenca estatistica na distribuicao relativa do Microsporum entre esses grupos. Os resultados do imunodiagnostico sugerem que as proteinas de 30 e 42 kDa apresentam elevada acuracia diagnostica e podem ser utilizadas em teste de WB, bem como sao potenciais candidatas a purificacao e subsequente utilizacao em ensaios enzimaticos. Adicionalmente, conclui-se que a atividade proteolitica do M. canis possui maior acao em ph acido. Em relacao aos dados do sequenciamento, conclui-se que o desencadeamento da dermatofitose esta mais relacionado a fatores intrinsecos referentes a imunidade do hospedeiro do que com fatores relacionados ao dermatofito ou com a distribuicao/composicao da microbiota comensal. Adicionalmente, conclui-se que embora o M. canis seja o agente causal e fator determinante para o desencadeamento da dermatofitose, sua acao isolada nao e suficiente para desencadear a enfermidade.
Dermatophytosis is a superficial fungal disease commonly seen in dermatological practice. This mycosis is an important skin disease of cats because it is contagious, infectious and can be transmitted to people. Currently, several diagnostic techniques are available to confirm clinical suspicion, and the fungal culture remains one of the most employed diagnostic tools. However, dermatophytes are slow-growing fungi and it may take several weeks for results. Therefore, the development of new diagnostic tests as immunodiagnostic, as well as microbiota sequencing Technologies can contribute to the proper identification and development of new diagnostic targets. The aim of this study was to identify the immunodominant proteins of Microsporum canis for the serological diagnosis of feline dermatophytosis. Additionally, this study aimed to evaluate the composition and diversity of skin fungal and bacterial communities of cats with dermatophytosis, asymptomatic cats (carriers of M. canis), and healthy cats. For the M. canis protein study, skin and blood samples were collected from 70 cats: symptomatic (n=20), asymptomatic (n=20), negative (n=20) and heterologous negative (n=10 ). Skin samples were submitted to fungal cultures for diagnostic confirmation and subsequent extraction of M. canis, and blood samples were evaluated by Western blot. For the microbiota study, skin samples were collected by combing the coat using a sterile polyester carpet and toothbrush, from 45 cats: symptomatic (n=15), asymptomatic (n=15) and negative (n=15). Samples were submitted to next-generation sequencing on the Illumina platform using 16S rRNA and ITS1 gene analysis. In the two-dimensional evaluation of M. canis proteins, it was observed that they were distributed in the pH range of 7 to 3. Furthermore, the WB revealed a broad antigenic profile with proteins ranging from 150 to 20 kDa. The 30 and 42 kDa proteins showed strong immunoreactivity in symptomatic and asymptomatic samples and low immunoreactivity in negative samples. The Western blot test was able to distinguish positive and negative cats for M. canis, showing high sensitivity (92.5%) and specificity (90%). The microbiota analysis showed that symptomatic and asymptomatic cats presented a similar pattern in the composition and distribution of skin microbiota. Additionally, no statistical difference was observed in the relative distribution of Microsporum between these groups. Immunodiagnostic results suggest that proteins of 30 and 42 kDa present high diagnostic accuracy and can be applied in WB tests, as well as being potential candidates for purification and subsequent application in serological assays. Additionally, it is concluded that the proteolytic activity of M. canis occurred mainly in acidic ph. Regarding the sequencing data, it is concluded that dermatophytosis is more linked to the host's immunity than to factors associated with the dermatophyte or distribution of the commensal microbiota. Additionally, it is concluded that although M. canis is the causative agent and responsible for triggering dermatophytosis, its isolated activity is not sufficient to trigger the disease.
Resumo
No Brasil, a casuística de dermatofitose de cães e gatos, atendida em hospitais escola e clínicas veterinárias oscila entre 1,7 à 11,5%. E embora o percentil de casos de dermatofitoses na rotina da clínica veterinária, seja reduzido, quando cotejado a outras dermatopatias, tem relevância pelo fato de tratar-se de uma antropozoonose, refletindo então sua grande importância em saúde pública. Relata-se que cerca de 15% dos casos de dermatofitose em humanos sejam de origem zoonótica. A dermatofitose animal é uma dermatopatia causada por fungos queratinofílicos e queratinolíticos pertencentes aos gêneros Microsporum e Trichophyton. Assim sendo, o fungo zoofilico M. canis é o dermatófito mais comumente isolado em carnívoros domésticos, sendo considerado como o agente causador de 90 a 100% dos casos de dermatofitose. Os dermatófitos são transmitidos por contato direto com pelos ou escamas infectadas por artrósporos, presentes nos animais, no ambiente ou por fômites. A diferenciação diagnóstica deve ser considerada em todo e qualquer caso de presença de lesões alopécicas, ceratóticas e escamocrostosas. A consecução diagnóstica é desafiadora e o emprego de cultivos fúngicos é bastante útil, porém requerem experiência laboratorial e necessitam de tempo, de cerca de 21 dias, para se obter o resultado final. Diante da escassez de trabalhos envolvendo procedimentos diagnósticos alternativos, a exemplo de técnicas sorológicas para a diagnose da microsporíase, e da necessidade de dispor de exames confiáveis e rápidos para um precoce diagnóstico, objetivou-se desenvolver e avaliar a eficácia diagnóstica dos testes imunoenzimáticos ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) e Western blot (WB), para o diagnóstico sorológico da dermatofitose felina causada por M. canis em gatos Persas assintomáticos. Para tanto, selecionou-se 70 felinos de idades variadas e de quaisquer dos sexos, os quais foram alocados em três Grupos: S (Sintomático) com 20 animais, AS (Assintomáticos) com 30 animais e N (Negativos) constituído por 20 felinos. Todos os animais foram submetidos à colheita de sangue para realização dos testes sorológicos, interposição pela Lâmpada de Wood e cultivo micológico. Comparando-se os valores de ELISA entre os grupos positivos e negativos, obtiveram-se 94% de sensibilidade e 75% especificidade. Obteve-se, também, área sob a curva ROC de 0,92. Observou-se que não houve diferença estatística entre os Grupos Sintomáticos e Assintomáticos (p<0,05). Ao WB detectou-se 13 bandas dos seguintes pesos moleculares: 132, 83, 75, 73, 57, 54, 50, 40, 35, 33, 32, 30 e 25 kDa. Considerou-se a proteína mais imunogênica a de 50 kDa, onde observou-se reatividade de 83,3% no Grupo sintomático e de 66,6% no Grupo assintomático. Conclui-se que a dermatofitose induz evidente resposta imune humoral, que se expressa pela elevação dos níveis de IgG anti-M.canis. Conclui-se, também, que as técnicas de ELISA e WB são eficazes para o diagnóstico sorológico da dermatofitose causada por M. canis em gatos Persas sintomáticos e assintomáticos.
The number of dogs and cats affected by ringworm seen at teaching hospitals and veterinary clinics in Brazil ranges from 1,7 to 11,5 %. And although the percentile of ringworm cases in veterinary practice routine is reduced when compared with other skin diseases, it has relevance because it is anthropozoonosis with public health significance. In humans, 15% of ringworms (tinea) cases come from zoonotic transmission and most of these cases are acquired through contact with affected cats. Animal dermatophytosis is a skin disease caused by keratinolytics and keratinophilics fungi belonging to the genera Microsporum and Trichophyton. The zoophilic fungus M. canis is the most frequently isolated dermatophyte in domestic carnivores, being regarded as the causative agent associated with 90 to 100% of ringworm cases. Dermatophytes are transmitted by direct contact with scales or hairs infected by arthrospores, present in the animals, in the environment or in fomites. The differential diagnosis for dermatophytosis should be considered in every case of alopecia, keratotic scales and crusty lesions. The diagnosis is challenging and the use of fungal cultures is quite useful but requires laboratorial experience and need at least 21 days to get the result. Given the scarcity of studies involving alternative diagnostic procedures, like serological techniques for the dermatophytosis's diagnosis, and the need for reliable and rapid tests for early diagnosis, this study aimed to develop and evaluate the diagnostic efficacy of enzyme immunoassays ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) and Western blot (WB), for the diagnosis of feline's dermatophytosis caused by M. canis in Persian cats. Seventy cats of various ages and any of the sexes were divided into three groups: S (symptomatic) with 20 animals, AS (asymptomatic) with 30 animals and N (negative) with other 20 cats. All animals were submitted to mycological cultivation, Wood lamp and blood samples for carrying out the serological tests. Comparing the ELISA values between positive and negative groups yielded 94% sensitivity and 75% specificity. There was no statistic difference between groups symptomatic and asymptomatic (p <0,05). The WB technique detected 13 bands of the following weights: 132, 83, 75, 73, 57, 54, 50, 40, 35, 33, 32, 30 and 25 kDa. The 50 kDa protein was considered the most immunogenic protein, observing reactivity in 83.3% in the symptomatic group and 66.6% in the asymptomatic group. The study concludes that the ringworm induces clear humoral immune response. In addition, the ELISA and WB techniques are effective for the diagnosis of dermatophytosis caused by M. canis in symptomatic and asymptomatic Persian cats.