Resumo
A criopreservação de tecido gonadal masculino pode ser usada na conservação de material genético, no intuito da formação de um banco de germoplasma permitindo a manutenção da variabilidade genética em animais pré-puberes e adultos. Diante disso, objetivou-se estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação de tecido testicular de catetos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 10 animais adultos, 5 em cada experimento, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. No experimento I, cinco pares de testículos foram fragmentados (9 mm3) e alocados em grupos não-vitrificados (controle) e vitrificados em superfície sólida (VSS), após a exposição a diferentes crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 3,0 M, etileno glicol - EG 3,0 M e a combinação 1,5 M DMSO/1,5 M EG). As amostras não-vitrificadas e vitrificadas foram avaliadas quanto à histomorfologia, ultraestrutura, viabilidade e potencial de capacidade proliferativa. A conservação adequada da organização ultraestrutural do túbulo seminífero em termos de presença de lúmen e junções celulares foi observada somente com o uso da combinação DMSO/EG. Independentemente do crioprotetor, a vitrificação conservou efetivamente a visualização e a condensação nuclear das células de maneira semelhante à observada no grupo não vitrificado. Além disso, a combinação DMSO/EG proporcionou uma melhor conservação das membranas basais dos túbulos seminíferos que o DMSO (P < 0,05). Somente a combinação DMSO/EG manteve o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia (3,69 Regiões Organizadoras de Nucléolos - NORs/célula) e célula de Sertoli (3,19 NORs/célula) semelhantes aos controles (3,46 e 3,31 NORS/célula, respectivamente). Portanto, DMSO/EG é melhor que o DMSO ou o EG sozinho para VSS de tecido testicular de cateto adulto. No experimento II, cinco pares de testículos foram fragmentados (3 mm3) e alocados a grupos não-criopreservados (controle) e criopreservados usando três métodos de criopreservação: congelação lenta (CL), vitrificação em criotubos (VC) e VSS, sendo então expostos a diferentes combinações de crioprotetores (1,5 M DMSO/1,5 M EG, 1,5 M DMSO/1,5 M glicerol G, e 1,5 M G/1,5 M EG). As amostras, não-criopreservadas e criopreservadas foram avaliadas quanto à fragmentação de DNA, viabilidade, potencial de capacidade proliferativa e histomorfologia. Apenas no uso de DMSO/EG durante a CL e VC foi possível conservar a integridade do DNA de modo similar ao controle (P>0,05). Em adição, observou-se que, independentemente do método de criopreservação, as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram capazes de conservar a viabilidade (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia de modo similar; entretanto, apenas o G/EG, nos métodos de CL e VSS, foram inferiores ao controle para célula de Sertoli (P>0,05). Finalmente, o protocolo de CL usando as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram melhores em evitar o aparecimento de edemas que G/EG CL e DMSO/G VSS (P<0.05). Assim, sugere-se a utilização da combinação DMSO/EG associada aos métodos de congelação lenta ou vitrificação para a criopreservação de tecido testicular de catetos adultos.
Cryopreservation of male gonadal tissue can be used in the conservation of genetic material, in order to form a germplasm bank allowing the maintenance of genetic variability in prepubertal and adult animals. Therefore, the aim was to establish an efficient protocol for cryopreservation of testicular tissue of collared peccaries. Therefore, the study was divided into two experiments, using 10 adult animals, 5 for each experiment, from the UFERSA Center for Wild Animals Multiplication. In experiment I, five pairs of testicles were fragmented (9 mm3) and allocated to non-vitrified (control) and vitrified solid-surface (SSV) groups following exposure to different cryoprotectants (3.0 M dimethyl sulfoxide (DMSO), 3.0 M ethylene glycol (EG) or 1.5 M DMSO/1.5 M EG). After warming, samples were evaluated for histomorphology, ultrastructure, viability, and proliferative capacity potential. The appropriate conservation of the ultrastructural organization of the seminiferous tubule in terms of lumen presence and cell junctions was only observed at the use of DMSO/EG combination. Regardless of the cryoprotectant, the vitrification effectively preserved cell nuclear visualization and condensation similarly as observed at the non-vitrified group. Moreover, DMSO/EG combination provided a better preservation of basal membranes of seminiferous tubules than DMSO (P < 0.05). Only the DMSO/EG combination maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia (3.69 Nucleolus Organizing Regions - NORs/cell) and Sertoli cell (3.19 NORs/cell) similar to controls (3.46 and 3.31 NORS/cell, respectively). In conclusion, DMSO/EG in combination is better than DMSO or EG alone for SSV of testicular tissue biopsies from adult collared peccaries. In experiment II, five pairs of testicles were also fragmented (3 mm3) and allocated to non-cryopreserved (control) and cryopreserved groups using three cryopreservation methods: slow freezing (SF), cryotube vitrification (CV) and solid surface vitrification (SSV), and then exposed to different combinations of cryoprotectants (1.5 M DMSO/1.5 M EG, 1.5 M DMSO/1.5 M glycerol - G, and 1.5 M G/1.5 M EG). Non-cryopreserved and cryopreserved samples were evaluated for histomorphology, viability, proliferative potential and DNA fragmentation. Only in the use of DMSO/EG during SF and CV, it was possible to preserve DNA integrity in a similar way to control (P> 0.05). In addition, it was observed that, regardless the cryopreservation method, the DMSO/EG and DMSO/G combinations were able to preserve viability (P> 0.05). All treatments maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia in a similar manner; however, G/EG in the SF and SSV methods impaired the proliferative potential of Sertoli cells (P> 0.05). Finally, the SF protocol using the DMSO/EG or DMSO/G combinations were better at preventing edema than G/EG for SF and DMSO/ G for SSV (P <0.05). In conclusion, we suggest the use of a DMSO/EG combination associated with slow freezing or vitrification in cryotubes for cryopreservation of testicular tissue of adult peccaries.
Resumo
O preá é um roedor silvestre que ocorre em todo o bioma caatinga. Bem adaptado ao cativeiro, pode ser utilizado como fonte de proteina animal pela população. Contudo há escassez de biotécnicas reprodutivas descritas para os machos dessa espécie. Desse modo, o objetivo do estudo foi estabelecer um protocolo de crioperservação de espermatozoides epididimário de preás. Para tanto, o trabalho foi dividido em dois experimentos. No primeito experimento foram utilizados 9 complexos testículo-epidídimo para coleta dos espermatozoides que foi feita pelo método de flutuação, no qual foi os espermatozoides foram colhidos pelos diluentes TES e TRIS, para avaliar qual seria ideal para colheita. Para o segundo experimento, foram usados 12 complexos testículo-epidídimo, submetidos a coleta dos espermatozoides epididimários pelo método de lavagem retrógrada com o diluente TRIS que proporcionou maior longevidade aos espermatozoides no primeiro experimento. As amostra foram criopreservadas em TRIS acrescido de 20% de gema de ovo, e adicionadas dos crioprotetores glicerol e DMSO em concentrações finais de 3%, 6% e 9%, atingindo-se uma concentração de 100 x 106 espermatozoides/ml. Os dados foram expressos em média e erro padrão e submetidos ao do teste de Fisher PLSD (P < 0,05). Os resultados indicam que o diluente TRIS foi mais eficiente que o TES (P < 0,05), o qual proporcional maior longevidade aos espermatozoides epididimarios. Ainda na criopreservação o glicerol, indepentede de sua concentração, foi mais eficiente na conservação dos gametas durane o processo de criopreservação. Em conclusão, indica-se o uso do diluente tris para a recuperação e a manutenção da longevidade de espermatozoides epididimários de preás. Ainda, sugerese o uso do diluente tris acrescido de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol para a criopreservação de espermatozoides epididimários de preás (Galea spixii).
The Spixs yellow-toothed cavies is a wild rodent that occurs throughout the savanna biome. Well adapted to captivity, could be used as source of animal protein for the population. However no shortage of reproductive biotechnologies described for the males of this species. Thus, the aim of the study was to establish a crioperservação protocol epididymal sperm of cavies. To this end, the work was divided into two experiments. In the experiment were used primeito 9 complex testicle-epididymis to collect the sperm that was taken by flotation method, which was the sperm were collected by TES and TRIS thinners to assess which would be ideal for harvesting. For the second experiment, they used 12 complex testicle-epididymis, sperm undergo collection of epididymal by retrograde washing method with TRIS diluent which provided greater longevity to sperm in the first experiment. The sample was cryopreserved in TRIS plus 20% egg yolk, and added to the cryoprotectant DMSO and glycerol in final concentrations of 3%, 6% and 9%, reaching a concentration of 100 X 106 sperm / ml. Data were expressed as mean and standard error and submitted to the Fisher PLSD test (P <0.05). The results indicate that the TRIS diluent was more efficient than the TES (P <0.05), which proportionally greater longevity to epididymal sperm. Still in cryopreservation glycerol, indepentede his concentration was more efficient in conserving gametes Durane the cryopreservation process. In conclusion, it indicates the use of the diluent tris to recovery and maintaining the longevity of epididymal sperm cavies. Still, it is suggested the use of tris diluent plus 20% egg yolk and 6% glycerol for cryopreservation of epididymal sperm of Spixs yellow-toothed cavies (Galea spixii)