What is known so far about bull sperm protamination: a review

Sperm routinary fitness evaluation is not sufficient to predict bull reproductive capacity as they present differences in fertility up to 40%. Among the defects which compromise spermatozoa functionality, new approaches consider the study of sperm chromatin, which is the core structure containing paternal genetic information. Sperm chromatin needs to be compacted to maintain the integrity of DNA, which occurs by binding nucleoproteins with high affinity to DNA. In the last stages of sperm maturation, chromatin is hyper-compacted by basic proteins called protamines in a process named protamination. In this review, we summarized intrinsic and extrinsic factors that are suggested to influence protamination in bull spermatozoa, considering old and new evidence from human and murine spermatozoa. Also, the current approaches to evaluate bull protamination and its relationship with fertility were described. Nevertheless, the physiological mechanisms of protamination are still poorly understood.(AU)

Sistema CRISPR/Cas9 e perspectivas de aplicações na cadeia produtiva animal / CRISPR/Cas9 system and perspectives for applications in the animal production chain

O melhoramento genético tem papel fundamental no aumento da eficiência da produção pecuária. Entretanto, programas tradicionais de melhoramento podem levar vários anos para atingir um determinado objetivo. Novas abordagens genômicas permitem acelerar esse processo e recentemente a edição gênica surgiu como nova alternativa, além de ter potencial para induzir outras modificações genéticas de interesse comercial e biomédico. A possibilidade de editar o genoma de diferentes espécies, de maneira simples e eficaz, tornou-se possível com a tecnologia do sistema CRISPR/Cas9. Esse sistema biológico foi identificado em bactérias e funciona como um mecanismo natural de defesa desses organismos. Baseando-se nos princípios biológicos, cientistas adaptaram esse sistema para atuar em células de mamíferos, incluindo humanas. Trabalhos científicos demonstraram a aplicabilidade da técnica, que permite novas abordagens na condução de estudos da função gênica, além de permitir diferentes experimentos de alteração específica da sequência do DNA. Do ponto de vista da produção animal, a utilização do sistema CRISPR traz novos conceitos e possibilidades para o melhoramento genético. O objetivo desta revisão é discutir os princípios da metodologia, associando resultados previamente conhecidos à possíveis aplicações com enfoque na cadeia produtiva animal.(AU)

Genetic improvement has a prominent role in increasing the efficiency of livestock production systems. However, traditional breeding programs may take several years to achieve a specific goal. New genomic approaches could accelerate this process and recently gene editing appeared as an alternative and still holds the potential to induce genetic alterations of commercial and biomedical interest. The possibility of editing the genome of different species, in a simple and effective way, became possible with the technology of the CRISPR / Cas9 system. This biological system was identified in bacteria and works as a natural defense mechanism for these organisms. Based on biological principles, scientists adapted this system to act on mammalian cells, including humans. Scientific studies demonstrated the applicability of the technique, which allows new approaches in conducting studies of gene function, in addition to different experiments of targeted modification of the DNA sequence. From the point of view of animal production, the use of the CRISPR brings new concepts and possibilities for genetic improvement. The purpose of this review is to discuss the principles of the methodology, associating previously known results to possible applications focusing on the animal production chain.(AU)

Sistema CRISPR/Cas9 e perspectivas de aplicações na cadeia produtiva animal / CRISPR/Cas9 system and perspectives for applications in the animal production chain

O melhoramento genético tem papel fundamental no aumento da eficiência da produção pecuária. Entretanto, programas tradicionais de melhoramento podem levar vários anos para atingir um determinado objetivo. Novas abordagens genômicas permitem acelerar esse processo e recentemente a edição gênica surgiu como nova alternativa, além de ter potencial para induzir outras modificações genéticas de interesse comercial e biomédico. A possibilidade de editar o genoma de diferentes espécies, de maneira simples e eficaz, tornou-se possível com a tecnologia do sistema CRISPR/Cas9. Esse sistema biológico foi identificado em bactérias e funciona como um mecanismo natural de defesa desses organismos. Baseando-se nos princípios biológicos, cientistas adaptaram esse sistema para atuar em células de mamíferos, incluindo humanas. Trabalhos científicos demonstraram a aplicabilidade da técnica, que permite novas abordagens na condução de estudos da função gênica, além de permitir diferentes experimentos de alteração específica da sequência do DNA. Do ponto de vista da produção animal, a utilização do sistema CRISPR traz novos conceitos e possibilidades para o melhoramento genético. O objetivo desta revisão é discutir os princípios da metodologia, associando resultados previamente conhecidos à possíveis aplicações com enfoque na cadeia produtiva animal.

Genetic improvement has a prominent role in increasing the efficiency of livestock production systems. However, traditional breeding programs may take several years to achieve a specific goal. New genomic approaches could accelerate this process and recently gene editing appeared as an alternative and still holds the potential to induce genetic alterations of commercial and biomedical interest. The possibility of editing the genome of different species, in a simple and effective way, became possible with the technology of the CRISPR / Cas9 system. This biological system was identified in bacteria and works as a natural defense mechanism for these organisms. Based on biological principles, scientists adapted this system to act on mammalian cells, including humans. Scientific studies demonstrated the applicability of the technique, which allows new approaches in conducting studies of gene function, in addition to different experiments of targeted modification of the DNA sequence. From the point of view of animal production, the use of the CRISPR brings new concepts and possibilities for genetic improvement. The purpose of this review is to discuss the principles of the methodology, associating previously known results to possible applications focusing on the animal production chain.

Acute exposure to hyperosmotic conditions reduces sperm activation by urine in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae, a freshwater teleost fish / Exposição aguda a condições hipereosmoticas reduz ativação do sêmen por urina em lambari do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae), um teleósteo de água doce

In freshwater fish with external fertilization, sperm sampling can be contaminated with urine, which triggers motility and gives rise to decreased fertilization success. The maintenance of freshwater fish in hyperosmotic conditions may reduce urine production and improve sperm quality. Thus, the aim of this work was to verify if acute exposure to various NaCl concentrations improves sperm quality in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae. Spermiation was induced using a single dose of carp pituitary gland (5 mg kg-1) and the males were maintained at various NaCl concentrations: NaCl 0.00% (control), NaCl 0.45% (hypoosmotic), NaCl 0.9% (isosmotic) and NaCl 1.0% (hyperosmotic) for 6 h at 26 °C. Sperm was collected and verified for activation by urine and motility traits. At 0.00%, 0.45%, and 0.90%, the sperm was motile just after sampling, indicating activation by urine. Surprisingly, at hyperosmotic conditions, no activation was observed. Other sperm and motility parameters did not show any statistical differences, including sperm viability (P = 0.7083), concentration (P = 0.9030), total motility (P = 0.6149), VCL (curvilinear velocity; P = 0.1216), VAP (average path velocity; P = 0.1231) and VSL (straight-line velocity; P = 0.1340). Our results indicate that acute maintenance at hyperosmotic conditions eliminates sperm activation by urine and maintains sperm quality. Such a new procedure is interesting for both basic and applied sciences, including reproductive practice in fish.(AU)

Em peixes de água doce com fertilização externa, a amostragem de espermatozoides pode ser contaminada pela urina, o que desencadeia motilidade e gera menor sucesso na fertilização. A manutenção de peixes de água doce em condições hiperosmóticas pode reduzir a produção de urina e melhorar a qualidade do esperma. Assim, o presente trabalho foi delineado para verificar se a exposição aguda a várias concentrações de NaCl melhora a qualidade do esperma no tetra-amarelo Astyanax altiparanae. A espermiação foi induzida usando uma dose única de hipófise da carpa (5 mg kg-1) e os machos foram mantidos em várias concentrações de NaCl: NaCl 0,00% (controle), NaCl 0,45% (hipoosmótico), NaCl 0,9% (isosmótico) e NaCl 1,0% (hiperosmótico) por seis horas a 26 °C. O esperma foi colhido e verificado quanto à ativação por urina e traços de motilidade. Em 0,00%, 0,45%, 0,90% os espermatozóides eram móveis logo após a amostragem, indicando ativação pela urina. Surpreendentemente, em condições hiperosmóticas, nenhuma ativação foi observada. Outros parâmetros espermáticos e de motilidade não mostraram diferenças estatísticas, incluindo viabilidade espermática (P = 0,7083), concentração (P = 0,9030), motilidade total (P = 0,6149), VCL (Velocidade Curvilinear; P = 0,1216), VMD (Velocidade Média de Deslocamento; P = 0,1230) e VLR (Velocidade em linha Reta; P = 0,1340). Nossos resultados indicam que a manutenção aguda em condições hiperosmóticas elimina a ativação do esperma pela urina e mantém a qualidade do esperma. Esse novo procedimento é interessante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo a prática reprodutiva em peixes.(AU)

Acute exposure to hyperosmotic conditions reduces sperm activation by urine in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae, a freshwater teleost fish / Exposição aguda a condições hipereosmoticas reduz ativação do sêmen por urina em lambari do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae), um teleósteo de água doce

In freshwater fish with external fertilization, sperm sampling can be contaminated with urine, which triggers motility and gives rise to decreased fertilization success. The maintenance of freshwater fish in hyperosmotic conditions may reduce urine production and improve sperm quality. Thus, the aim of this work was to verify if acute exposure to various NaCl concentrations improves sperm quality in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae. Spermiation was induced using a single dose of carp pituitary gland (5 mg kg-1) and the males were maintained at various NaCl concentrations: NaCl 0.00% (control), NaCl 0.45% (hypoosmotic), NaCl 0.9% (isosmotic) and NaCl 1.0% (hyperosmotic) for 6 h at 26 °C. Sperm was collected and verified for activation by urine and motility traits. At 0.00%, 0.45%, and 0.90%, the sperm was motile just after sampling, indicating activation by urine. Surprisingly, at hyperosmotic conditions, no activation was observed. Other sperm and motility parameters did not show any statistical differences, including sperm viability (P = 0.7083), concentration (P = 0.9030), total motility (P = 0.6149), VCL (curvilinear velocity; P = 0.1216), VAP (average path velocity; P = 0.1231) and VSL (straight-line velocity; P = 0.1340). Our results indicate that acute maintenance at hyperosmotic conditions eliminates sperm activation by urine and maintains sperm quality. Such a new procedure is interesting for both basic and applied sciences, including reproductive practice in fish.(AU)

Em peixes de água doce com fertilização externa, a amostragem de espermatozoides pode ser contaminada pela urina, o que desencadeia motilidade e gera menor sucesso na fertilização. A manutenção de peixes de água doce em condições hiperosmóticas pode reduzir a produção de urina e melhorar a qualidade do esperma. Assim, o presente trabalho foi delineado para verificar se a exposição aguda a várias concentrações de NaCl melhora a qualidade do esperma no tetra-amarelo Astyanax altiparanae. A espermiação foi induzida usando uma dose única de hipófise da carpa (5 mg kg-1) e os machos foram mantidos em várias concentrações de NaCl: NaCl 0,00% (controle), NaCl 0,45% (hipoosmótico), NaCl 0,9% (isosmótico) e NaCl 1,0% (hiperosmótico) por seis horas a 26 °C. O esperma foi colhido e verificado quanto à ativação por urina e traços de motilidade. Em 0,00%, 0,45%, 0,90% os espermatozóides eram móveis logo após a amostragem, indicando ativação pela urina. Surpreendentemente, em condições hiperosmóticas, nenhuma ativação foi observada. Outros parâmetros espermáticos e de motilidade não mostraram diferenças estatísticas, incluindo viabilidade espermática (P = 0,7083), concentração (P = 0,9030), motilidade total (P = 0,6149), VCL (Velocidade Curvilinear; P = 0,1216), VMD (Velocidade Média de Deslocamento; P = 0,1230) e VLR (Velocidade em linha Reta; P = 0,1340). Nossos resultados indicam que a manutenção aguda em condições hiperosmóticas elimina a ativação do esperma pela urina e mantém a qualidade do esperma. Esse novo procedimento é interessante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo a prática reprodutiva em peixes.(AU)

Acute exposure to hyperosmotic conditions reduces sperm activation by urine in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae, a freshwater teleost fish / Exposição aguda a condições hipereosmoticas reduz ativação do sêmen por urina em lambari do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae), um teleósteo de água doce

In freshwater fish with external fertilization, sperm sampling can be contaminated with urine, which triggers motility and gives rise to decreased fertilization success. The maintenance of freshwater fish in hyperosmotic conditions may reduce urine production and improve sperm quality. Thus, the aim of this work was to verify if acute exposure to various NaCl concentrations improves sperm quality in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae. Spermiation was induced using a single dose of carp pituitary gland (5 mg kg-1) and the males were maintained at various NaCl concentrations: NaCl 0.00% (control), NaCl 0.45% (hypoosmotic), NaCl 0.9% (isosmotic) and NaCl 1.0% (hyperosmotic) for 6 h at 26 °C. Sperm was collected and verified for activation by urine and motility traits. At 0.00%, 0.45%, and 0.90%, the sperm was motile just after sampling, indicating activation by urine. Surprisingly, at hyperosmotic conditions, no activation was observed. Other sperm and motility parameters did not show any statistical differences, including sperm viability (P = 0.7083), concentration (P = 0.9030), total motility (P = 0.6149), VCL (curvilinear velocity; P = 0.1216), VAP (average path velocity; P = 0.1231) and VSL (straight-line velocity; P = 0.1340). Our results indicate that acute maintenance at hyperosmotic conditions eliminates sperm activation by urine and maintains sperm quality. Such a

Em peixes de água doce com fertilização externa, a amostragem de espermatozoides pode ser contaminada pela urina, o que desencadeia motilidade e gera menor sucesso na fertilização. A manutenção de peixes de água doce em condições hiperosmóticas pode reduzir a produção de urina e melhorar a qualidade do esperma. Assim, o presente trabalho foi delineado para verificar se a exposição aguda a várias concentrações de NaCl melhora a qualidade do esperma no tetra-amarelo Astyanax altiparanae. A espermiação foi induzida usando uma dose única de hipófise da carpa (5 mg kg-1) e os machos foram mantidos em várias concentrações de NaCl: NaCl 0,00% (controle), NaCl 0,45%  (hipoosmótico), NaCl 0,9% (isosmótico) e NaCl 1,0% (hiperosmótico) por seis horas a 26 °C. O esperma foi colhido e verificado quanto à ativação por urina e traços de motilidade. Em 0,00%, 0,45%, 0,90% os espermatozóides eram móveis logo após a amostragem, indicando ativação pela urina. Surpreendentemente, em condições hiperosmóticas, nenhuma ativação foi observada. Outros parâmetros espermáticos e de motilidade não mostraram diferenças estatísticas, incluindo viabilidade espermática (P = 0,7083), concentração (P = 0,9030), motilidade total (P = 0,6149), VCL (Velocidade Curvilinear; P = 0,1216), VMD (Velocidade Média de Deslocamento; P = 0,1230) e VLR (Velocidade em linha Reta; P = 0,1340). Nossos resultados indicam que a m

Qualidade da cromatina espermática e sua implicação no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos / Sperm DNA quality and its implication on bovine early embryo development

Nas últimas décadas, a avaliação de rotina do sêmen bovino vem sendo estudada exaustivamente e inclui: volume seminal, padrão de motilidade retilínea, concentração e morfologia espermáticas. Tais análises têm sido utilizadas para a seleção de reprodutores e cálculo do rendimento de ejaculados de modo a melhorar a eficiência de biotécnicas como inseminação artificial e produção in vitro de embriões. No entanto, estes testes não apresentam resultados consistentes, principalmente para os casos de infertilidade idiopática. Assim, mesmo que a fertilidade de um indivíduo seja dependente de diversos fatores e que dificilmente um teste ou um conjunto de testes possa predizer esta característica, a utilização de técnicas funcionais mais avançadas poderia, em última análise, tornar esta avaliação mais completa e consistente. A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, e as alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos e os mais importantes são: processos semelhantes a apoptose, deficiência de protamina e danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Na espécie bovina, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e no desenvolvimento embrionário ainda são mais escassas. O presente trabalho tem como objetivo revisar as principais causas de dano de cromatina espermática que influenciam o desenvolvimento embrionário inicial.

The conventional evaluation of bovine semen has been studied for several decades, and it includes sperm volume, forward motility pattern, concentration and sperm morphology. These analyses have been routinely used for the selection of bulls and determination of ejaculates yield, aiming to improve the efficiency of biotechnologies such as artificial insemination and in vitro embryo production. Unfortunately, inconsistent results have been obtained, especially in cases of idiopathic infertility. Therefore, despite the fact that fertility is dependent of several factors and that one test or a set of tests could hardly be able to predict fertility, the use of new functional techniques, may lead to a more complete and robust evaluation. Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur due to several reasons, and the most important are apoptosis-like events, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS).Information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are scarce. This paper reviews the main causes of sperm chromatin damage that can influence the early embryo development.

Qualidade da cromatina espermática e sua implicação no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos / Sperm DNA quality and its implication on bovine early embryo development

Nas últimas décadas, a avaliação de rotina do sêmen bovino vem sendo estudada exaustivamente e inclui: volume seminal, padrão de motilidade retilínea, concentração e morfologia espermáticas. Tais análises têm sido utilizadas para a seleção de reprodutores e cálculo do rendimento de ejaculados de modo a melhorar a eficiência de biotécnicas como inseminação artificial e produção in vitro de embriões. No entanto, estes testes não apresentam resultados consistentes, principalmente para os casos de infertilidade idiopática. Assim, mesmo que a fertilidade de um indivíduo seja dependente de diversos fatores e que dificilmente um teste ou um conjunto de testes possa predizer esta característica, a utilização de técnicas funcionais mais avançadas poderia, em última análise, tornar esta avaliação mais completa e consistente. A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, e as alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos e os mais importantes são: processos semelhantes a apoptose, deficiência de protamina e danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Na espécie bovina, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e no desenvolvimento embrionário ainda são mais escassas. O presente trabalho tem como objetivo revisar as principais causas de dano de cromatina espermática que influenciam o desenvolvimento embrionário inicial.(AU)

The conventional evaluation of bovine semen has been studied for several decades, and it includes sperm volume, forward motility pattern, concentration and sperm morphology. These analyses have been routinely used for the selection of bulls and determination of ejaculates yield, aiming to improve the efficiency of biotechnologies such as artificial insemination and in vitro embryo production. Unfortunately, inconsistent results have been obtained, especially in cases of idiopathic infertility. Therefore, despite the fact that fertility is dependent of several factors and that one test or a set of tests could hardly be able to predict fertility, the use of new functional techniques, may lead to a more complete and robust evaluation. Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur due to several reasons, and the most important are apoptosis-like events, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS).Information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are scarce. This paper reviews the main causes of sperm chromatin damage that can influence the early embryo development.(AU)

Alterações celulares induzidas pelo estresse térmico em embriões bovinos / Cellular alterations induced by heat stress in bovine embryos

Condições ambientais adversas, tais como altas temperaturas e umidade relativa, causam aumento da temperatura cor- poral interna (hipertermia) de vacas lactantes, que resultam em estresse térmico e diminuição dos índices de gestação. A susceptibilidade embrionária à temperatura elevada já foi bem caracterizada tanto em experimentos in vivo quanto in vitro. A exposição de embriões bovinos em estágios de zigoto e duas células à temperatura elevada diminui o desenvol- vimento embrionário até o estágio de blastocisto. No entanto, o embrião torna-se mais resistente aos efeitos deletérios da temperatura elevada à medida que progride no desenvolvimento. A redução na competência de desenvolvimento embrionária causada pelo estresse térmico deve-se, em parte, às inúmeras alterações citoplasmáticas e nucleares in- duzidas pela temperatura elevada. No citoplasma embrionário, o choque térmico aumenta o número de mitocôndrias edemaciadas, desorganiza os microtúbulos e os filamentos de actina. No compartimento nuclear, a temperatura elevada induz a fragmentação de DNA característica de apoptose. Essa forma de morte celular é um fenômeno regulado ao lon- go do desenvolvimento embrionário pré-implantacional, visto que altas temperaturas não ativam a cascata de apoptose em embriões de duas ou quatro células. A apoptose embrionária induzida pelo choque térmico em embriões > 16 célu- las pode ser considerada um mecanismo de controle de qualidade para remoção dos blastômeros danificados, já que o bloqueio da apoptose nestes embriões aumenta ainda mais a susceptibilidade ao choque térmico. Além disso, o estresse térmico também pode afetar o estado redox do embrião, levando a um consequente estresse oxidativo.(AU)

Adverse environmental conditions such as high temperature and humidity increase internal body temperature (hyperthermia) of lactating dairy cows resulting in heat stress and decreased pregnancy rates. Embryonic suscepti-bility to elevated temperature has been well characterized both in vivo and in vitro. Exposure of zygote and two cells stage bovine embryos to elevated temperature decreases embryonic development to the blastocyst stage. However, the bovine embryo becomes more resistant to the deleterious effects of heat stress as it proceeds in its development. The heat-induced reduction in embryonic developmental competence is due, at least in part, to the numerous cytoplasmic and nuclear changes induced by high temperature. In the embryo cytoplasm heat shock increases the number of swollen mitochondria, disrupts microtubules and microfilaments. In the nuclear compartment, elevate temperature induces DNA fragmentation characteristic of apoptosis. This form of cell death is a phenomenon regulated throughout the preimplantation embryonic development, since high temperatures do not trigger apoptosis in embryos of two or four cells. Heat-induced apoptosis in embryos > 16 cells can be seen as a quality control mechanism for removing damaged blastomeres, since block apoptosis in these embryos increase its susceptibility to heat shock. Furthermore, heat stress can also affect the redox status of the embryo inducing a consequent oxidative stress.(AU)

Gene expression profile of Protamines and Transition Nuclear Proteins in bovine testis / Expressão gênica de protaminas e proteínas nucleares de transição em testículos bovinos

Protamines (PRM) are the major DNA-binding proteins in the sperms nucleus and can pack the DNA into than 5% of the volume of a somatic cell nucleus. It is already know that bulls only have the PRM1 protein on mature spermatozoa while most mammals also have the PRM2. Transition nuclear proteins (Tnps) and PRMs are fundamental to DNA integrity. It has already been reported the influence of PRM on chromatin structures, generating low fertility. However, molecular mechanisms underlying these effects are not known. The relative expression of PRM1, PRM2, PRM3, Tnp1 and Tnp2 was determined by real time RT-PCR, using bovine specific primers and β-actin as endogenous control. Quantification of mRNA relative expression showed a higher expression of PRM1 compared to the other genes. The PRM3 mRNA had the lowest relative expression. A significant (p < 0.05) and positive correlation was found between PRM1 and PRM2 (r = 0.518), PRM2 and Tnp1 (r = 0.750), PRM2 and Tnp2 (r = 0.706), PRM3 and Tnp1 (r = 0.542), PRM3 and Tnp2 (r = 0.731) and between Tnp1 and Tnp2 (r = 0.820). Since most of the knowledge about protamine 2 in bovine is based on a work from 1990 and according to new studies we know that PRM1 and PRM2 are important to bull fertility, more research is needed to elucidate the real function of protamines on bovines.(AU)

Protaminas (PRM) são as principais proteinas ligantes do DNA espermático e podem compactar o núcleo do espermatozóides em menos de 5% do volume de uma célula somática. Ká se sabe que o touro produz apenas a PRM1 em espermatozoide maduro, enquanto a maioria dos mamíferos também produz a PRM2. As proteínas nucleares de transição (Tnps) e as PRMs são fundamentais para a integridade do DNA. Já foi descrita a influência das protaminas na estrutura da cromatina e a associação destas com a fertilidade. Entretanto, os mecanismos moleculares que geram mudanças na cromatina espermática são desconhecidos. A expressão relativa da PRM1, PRM2, Tnp1 e Tnp2 foi determinada para dez testículos de touros oriundos de matadouros comerciais, utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real, com primers específicos para bovinos e a B-actina como controle endogeno. Ao quantificar a expressão relativa do RNAm, detectou-se alta expressão relativa da PRM1, em comparação aos outros genes. A expressão relativa da PRM3 foi a menor de todos os genes. Foram encontradas correlações positivas e significantes (p < 0,05) entre PRM1 e PRM2 (r = 0,518), PRM2 e Tnp1 (r = 0,750), PRM2 e Tnp2 (r = 0,706), PRM3 e Tnp1 (r = 0,542), PRM3 e Tnp2 (r = 0,731) e entre Tnp1 e Tnp2 (r = 0,820). Visto que a maioria dos conhecimentos sobre a PRM2 estão baseados em um trabalho de 1990 e, de acordo com recentes estudos se sabe que a PRM1 e a PRM2 são importantes para a fertilidade do touro, mais estudos são necessários para determinar a real função das protaminas em touros.(AU)

In vitro development of bovine embryos cultured under different fetal calf serum concentrations and cell types / Desenvolvimento in vitro de embriões bovinos cultivados sob diferentes concentrações de soro fetal bovino e tipos celulares

The present work was carried out to evaluate the in vitro development of bovine embryo co-cultured in granulosa, oviduct, BRL or VERO cells co-cultures, supplemented with 5% or 10% of Fetal Calf Serum (FCS). Cummulus oocyte complexes were aspirated, matured and fertilized in vitro. Embryonic structures were divided into eight treatments. They were placed in culture media TCM 199 containing granulosa, oviduct, BRL or VERO cells, each of them added with 5% or 10% FCS. The conditions for the co-culture were 38.5 ºC, 5% CO2 in air and high humidity for ten consecutive days. Cleavage, blastocyst and hatching rates did not differ (p > 0.05) in co-culture with primary cells (granulosa and oviduct) when FCS concentration increased from 5 to 10%. However, in continuous cells co-culture (BRL and VERO), when FCS concentration increased from 5% to 10%, the blastocyst development rate decreased significantly (p < 0.05) from 33.6 to 16.3% and from 40 to 16.5% in embryo co-culture with BRL and VERO cells, respectively. (AU)

O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o desenvolvimento in vitro de embriões bovinos co-cultivados em células da granulosa, do oviduto, BRL e VERO, suplementados com 5% ou 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Os complexos cummulus oócitos foram aspirados, maturados e fecundados in vitro. As estruturas embrionárias foram divididas em oito tratamentos: co-cultivo em TCM 199 contendo células da granulosa, do oviduto, BRL ou VERO adicionadas com 5% ou 10% de SFB. As condições de cultivo foram 38.5 ºC, 5% CO2 em ar e alta humidade por dez dias consecutivos. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão não diferiram (p > 0,05) no co-cultivo com células primárias (granulosa e oviduto) quando a concentração de SFB aumentou de 5 para 10%. Entretanto, no co-cultivo com células de linhagens contínuas (BRL e VERO), quando a concentração de SFB aumentou de 5% para 10%, os índices de blastocistos diminuíram significativamente (p < 0,05) de 33,6 para 16,3 % e de 40 para 16,5% nos embriões bovinos co-cultivados com células VERO e BRL, respectivamente. (AU)

Influence of Caffeine and Chondroitin Sulfate on Swine Sperm Capacitation and In Vitro Embryo Production

Background: The establishment of an in vitro production (IVP) of embryo in swine allows the generation of embryos with the same quality as in vivo produced embryos with less costs and time. In order to achieve successful fertilization under normal circumstances in vivo, mammalian spermatozoa must first undergo capacitation and then acrosome reaction. The purpose of this study was compared the efficacious of IP/CFDA fluorescence and Coomassie Blue G (CB) staining to detect capacitated sperm cells in refrigerated and fresh semen. Morever, it was investigated the efficacious of caffeine and chondroitin sulphate to promote in vitro sperm capacitation and in vitro embryo produced (IVP) of swine embryos. Materials, Methods & Results: A sperm-rich fraction from ejaculate was obtained using the gloved-hand method and the gel- free fraction was separated using sterile gauze. The semen was diluted in BTS at a final concentration of 1.5 x 10 8 cells/mL. The sperm suspension was incubated for 2 h at 25°C, refrigerated and maintained for 1 h at 15-18°C (refrigerated group) or used immediately (fresh group). Sperm capacitation was assessed by IP/CFDA fluorescence and CB staining for both fresh and refrigerated semen. For PI/CFDA evaluation, a final solution containing 1.7 mM formaldehyde, 7.3 mM PI and 20 mM CFDA in 950 μL saline was prepared. In the dark, 40 μL PI/CFDA final solution was added to 10 μL semen and after 8 min, slides were analyze d on epifluorescence microscopy. For CB evaluation, sperm cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min and centrifuged twice at 320 x g in ammonium acetate pH 9 for 8 min. A smear was made and stained with 2.75 mg/mL CB in solution containing 12.5% methanol, 25% glacial acetic acid and 62.5% water, for 2 min. The smear was washed in running water, air dried and sealed with Permount ® , diluted 2:1 in xilol to avoid staining oxidation. (...)

Maturação e desenvolvimento embrionário in vitro de oócitos bovinos após bloqueio da meiose com inibidores de MPF / In vitro maturation and embryo development of bovine oocytes after meiosis blockage with MPF inhibitors

O objetivo deste estudo foi avaliar a maturação e o desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos que tiveram a maturação bloqueada com Butirolactona I e Roscovitina em meio de pré-maturação suplementado com soro fetal bovino (SFB). Oócitos foram divididos em 4 grupos: Controle 0 hora, Controle (maturação por 24 horas), Butirolactona I (bloqueio da maturação com 150μM de Butirolactona I por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação) e Roscovitina (bloqueio da maturação com 50μM de Roscovitina por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação). Para avaliar a maturação nuclear, os oócitos foram fixados e corados em aceto orceína. Parte dos oócitos dos grupos Controle 24 horas, Roscovitina e Butirolactona I após o período de maturação, foi fecundado in vitro. O desenvolvimento embrionário foi avaliado pelos índices de clivagem (D3) e formação de blastocistos (D7). Oócitos do grupo Butirolactona I apresentaram índices de Vesícula Germinativa após o bloqueio e de Metáfase 2 após a maturação semelhantes ao dos grupos Controle 0 hora e Controle, respectivamente. Por outro lado, a Roscovitina apresentou menores índices de Vesícula Germinativa e Metáfase 2. Os grupos Controle e Butirolactona I apresentaram maiores índices de clivagens. O grupo Controle apresentou maior produção de blastocistos que o Roscovitina e não diferiu do grupo Butirolactona I. Conclui-se que a Butiroloactona I pode ser utilizada no sistema de pré-maturação em meio contendo SFB, pois apresentou resultados semelhantes ao do grupo Controle o mesmo não ocorrendo com a Roscovitina, que apresentou menores índices de maturação oocitária e de desenvolvimento embrionário.(AU)

This study evaluated the bovine oocyte maturation and embryo development after in vitro fertilization. The maturation of the oocytes was blocked using Butyrolactone I and Roscovitine using pre-maturation medium supplemented with fetal calf serum (FCS). The ocytes were divided in four groups: Control 0 hour, Control (24 hours of maturation), Roscovitine (maturation blockage with 50mM Roscovitine during 24 hours followed by 24 hours of maturation), and Butyrolactone I (maturation blockage with 150mM Butyrolactone I during 24 hours followed by 24 hours of maturation). The oocytes were fixed and stained with aceto orcein to evaluate the nuclear maturation. After the maturation period, the remaining oocytes of the Control group, Roscovitine, and Butyrolactone I were fertilized in vitro. Embryo development was assessed by the cleavage rate (D3) and blastocysts formation (D7). The Butyrolactone I group had similar rates of germinal vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation, comparing to Control group at 0 hour and Control group, respectively. On the other hand, the Roscovitine group had lower rates of vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation comparing to Control groups. After in vitro fertilization, higher rates of cleavage were observed in Control and Butyrolactone I groups. For the blastocyst formation rate, the Control group showed better results than Roscovitine group. In summary, Butyrolactone I group had similar results to the Control group, and for this reason, is suitable for pre-maturation of bovine oocytes using FCS. In contrast, Roscovitine group had lower oocyte maturation and embryo development.(AU)

Effect of Hormonal Supplementation Periods and In Vitro Maturation Media on Developmental Competence of Pig Oocytes

The oocyte ability to undergo successful fertilization, cleavage and embryonic development depends on meiotic maturation and developmental competence acquisition. In vitro maturation (IVM) protocols currently use eCG, hCG or a combination of both, the effect of these gonadotrophins during IVM and subsequent embryonic development is still controversial. Several media have been used for IVM of porcine oocytes: TCM199, Whitten’s and NCSU23 have also been shown to support pig oocyte IVM. This study was designed to determine the effect of hormonal supplementation period and maturation media during in vitro maturation of pig oocytes (1) and subsequent embryonic development (2).

Kinetics of changes in plasma membrane related to apoptosis and necrosis in bovine sperm cells at different incubation times / Cinética das alterações na membrana plasmática relacionadas com a apoptose e necrose em espermatozóides bovinos em diferentes tempos de incubação

Incubation time induce damages in sperm cells by necrosis and/or apoptosis. The aim of this study was the evaluation of changes in plasma membrane related to apoptosis and necrosis in bovine sperm cells through 2 hours of incubation. Sperm cells were incubated at 5% (v/v) CO subscribed to 2 in air for 0, 30, 60, 90 and 120 minutes. After each period, sperm cells were incubated with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide (PI) to detect change in plasma membrane related to apoptosis and necrosis respectively. Using Yo-pro/PI assay, three different subpopulations of sperm cells were detected by flow cytometry: a) necrotic sperm cells (PI superscript + and Yo-pro superscript to -/+); b) apoptotic sperm cells (Yo-pro superscript to+ and PI superscript to-) and c) living cells (Yo-pro superscript to- and PI superscript to-). The percentage of live cells (plasma membrane integrity) significantly decreases over 2 hour of incubation, on the other hand, the percentage of necrotic and apoptotic cells increase during incubation. Changes in plasma membrane integrity were correlated to incubation time. While live cells were negatively correlated with the increase of incubation time, necrosis and apoptosis were positively correlated. It was also observed that necrosis was the main damage in sperm cells in all incubation times. In conclusion, incubation time induces changes in plasma membrane integrity related to necrosis and apoptosis, whether necrosis is present in higher quantity in all incubation times.(AU)

O tempo de incubação causa danos nas células espermáticas relacionados a necrose e/ou apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar as mudanças na membrana plasmática relacionadas a apoptose e necrose em espermatozóides bovinos durante 2 horas de incubação. Os espermatozóides foram incubados a 5% (v/v) CO subscrito por 2 em ar por 0, 30, 60, 90 e 120 minutes. Depois de cada periodo, as células espermáticas foram incubadas com as sondas fluorescentes Yo-pro e iodito de propideo (PI) para detectar mudanças na membrana plasmática relacionadas a apoptose e a necrose, respectivamente. Usando Yo-pro/PI assay, três subpopulações diferentes de células espermáticas são detectadas pelo citômetro de fluxo: a) células espermáticas em necrose (PI elevado a+ and Yo-pro elevado a-/+); b) células espermáticas em apoptose (Yo-pro elevado a+ and PI elevado a-) e c) células espermáticas vivas (Yo-pro- and PI elevado a-). A porcentagem de células vivas (membrana plasmática integra) significativamente diminui durante 2 horas de incubação, por outro lado, a porcentagem de espermatozóides em necrose e apoptose aumentaram durante a incubação. As mudanças na integridade da membrana plasmática foram correlacionadas com o tempo de incubação. Enquanto as células vivas foram correlacionadas negativamente com o aumento do tempo de incubação, necrose e apoptose foram correlacionadas positivamente. Também foi observado que necrose foi o principal dano causado pelo tempo de incubação nas células espermáticas. Conclui-se que o tempo de incubação causa alteração na integridade da membrana plasmática relacionadas a necrose e apoptose nas células espermáticas, sendo que necrose foi observada em maior quantidade em todos os tempos de incubação.(AU)

Influência do glicerol e etilenoglicol e da criopreservação sobre o complexo DNA-Proteina de espermatozóides em garanhões / Glycerol, ethyleneglycol and cryopreservation influences on semen an sperm DNA-Protein complex in stallion

O processo de criopreservação causa estresse físico e químico aos espermatozóides, acarretando alterações bioquímicas, diminuição irreverssível da motilidade espermática, aumento da degeneração do DNA e liberação intracelular de enzimas e lipídeos. No presente estudo, foram estudadas a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões. Foi comparados o sêmen puro, o sêmen puro e congelado sem crioprotetores, o sêmen diluído e exposto aos crioprotetores sem congelação e o sêmen diluído e congelado com crioprotetores. Foram utilizados seis garanhões, colhendo 12 ejaculados cada. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em espermatozóides fixados com etanol-ácido-acético glacial 3: 1 (v/ v), tratados com HCL 4N a 25°C e corados com azul de toluidina a 0,025% em tampão McIlvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelados e não congelados (P<0,05). O sêmen congelado sem crioprotetor não apresentou aumento significativo de patologia do complexo DNA-Proteína em relação ao sêmen congelado com crioprotetores, mas ambos mostraram aumento em relação ao sêmen puro ou diluído e exposto aos crioprotetores. A influência da estação reprodutiva mostrou diferença significativa (P<0,05) somente no sêmen puro e no sêmen puro e congelado sem crioprotetor. Conclui-se que o processo de congelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões.(AU)

The cryopreservation process cause stress physical and chemical to the spermatozoa, causing biochemistry alteration, irreversible reduction of the spermatic motility, increase of the DNA degeneration and intracellular enzyme and lipids release. The aim of this study was to evaluate the influence of non-breeding and breeding seasons, glycerol and ethylene glycol, cryopreservation and thawing processes on stallion spermatozoa DN A -protein complexo It was compared fresh semen, diluted semen frozen without cryoprotectants, diluted semen exposured to cryoprotectants but not frozen and d) diluted semen frozen with cryoprotectants. Six stallions had 12 semen collections each. DNA-protein complex pathology was assessed by optical microscopy (1000x) using spermatozoa treated with ethanol-acetic acid 3:1 (v/v), HCl 4N at room temperature and toluidin blue 0,025% in McIlavaine buffer. Results showed that DNA-protein complex were different between frozen and not frozen spermatozoa groups (P<0,05). Frozen semen without cryoprotectants had no increasing of DNA-protein complex pathology compared to semen cryopreserved with cryoprotectant, but both showed increasing in relation to fresh and diluted semen exposured to cryoprotectants. The influence of non breeding and breeding season showed significant difference (P<0,05) in the fresh semen and fresh semen frozen without cryoprotectants. Cryopreservation process had negative influence on spermatozoa DNA-protein complex.(AU)

Criopreservação e desenvolvimento in vitro de embriões bovinos / Cryopreservation and in vitro survival of bovine embryos

O objetivo deste trabalho foi estudar a remoção do crioprotetor, em duas ou três etapas, em embriões bovinos produzidos in vitro após a congelação em vapor de Nirtogênio. Blastocistos expandidos (1329) foram mantidos em co-cultivo (controle) ou criopreservados em 3 protocolos de congelação em vapor de nitrogênio. Os embriões foram equilibrados na solução de 10% de EG por 10 minutos e em 17%, 22% ou 28% de EG por 30 segundos. Após o envase, as palhetas foram mantidas em vapor de nitrogênio por 2 minutos e armazenadas em nitrogênio líquido. Após a descongelação, os crioprotetores foram diluídos em duas etapas, usando 0,3M de sacarose e solução isotônica ou em três etapas usando 0,3M de sacarose + 10% de EG; 0,3M de sacarose e solução isotônica. Os embriões foram co-cultivados com células da granulosa, avaliando as taxas de re-expansão após 24 horas e de eclosão após 24, 48, 72 e 96 horas. Para os grupos congelados no vapor e diluição do crioprotetor em duas etapas, as taxas de eclosão foram de 1,94; 11,88 e 6,06% para EG17, EG 22 e EG 28 respectivamente. Já para os grupos com diluição do crioprotetor em três etapas, as taxas de eclosão foram de 4,67; 9,90 e 10,78% para EG17, EG22 e EG28 respectivamente.(AU)

The aim of this study was to evaluate the dilution of cryoprotectant in 2 or steps of bovine in vitro-produced embryos after quick-freezing. A total of 1329 expanded blastocyst were kept in co-culture as control group or cryopreserved by 3 quick-freezing protocols. The embryos were exposed to 10% EG for 10 minutes then to 17%, 22% or 28% for 30 seconds. After loading, the straws were held in nitrogen vapor for 2 minutes and then plunged and stored in liquid nitrogen. After warming, cryoprotectants were diluted in two steps using 0.3 M sucrose and isotonic solution, or three steps using 0.3 M sucrose + 10% EG then 0.3 M sucrose and isotonic solution. Embryos were co-cultured on a granulosa cell monolayer and evaluated after 24 hours for re-expansion and at 24, 48, 72 and 96 hours of co-culture for hatching rates. The in vitro survival rates of embryos cryopreserved by the quick-freezing method and two-step cryoprotectant dilution were 1.94; 11.88 and 6.06%, for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively. At the three step dilution, the in vitro survival rates were 4.67; 9.90 and 10.78% for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively

Acute exposure to hyperosmotic conditions reduces sperm activation by urine in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae, a freshwater teleost fish / Exposição aguda a condições hipereosmoticas reduz ativação do sêmen por urina em lambari do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae), um teleósteo de água doce

In freshwater fish with external fertilization, sperm sampling can be contaminated with urine, which triggers motility and gives rise to decreased fertilization success. The maintenance of freshwater fish in hyperosmotic conditions may reduce urine production and improve sperm quality. Thus, the aim of this work was to verify if acute exposure to various NaCl concentrations improves sperm quality in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae. Spermiation was induced using a single dose of carp pituitary gland (5 mg kg-1) and the males were maintained at various NaCl concentrations: NaCl 0.00% (control), NaCl 0.45% (hypoosmotic), NaCl 0.9% (isosmotic) and NaCl 1.0% (hyperosmotic) for 6 h at 26 °C. Sperm was collected and verified for activation by urine and motility traits. At 0.00%, 0.45%, and 0.90%, the sperm was motile just after sampling, indicating activation by urine. Surprisingly, at hyperosmotic conditions, no activation was observed. Other sperm and motility parameters did not show any statistical differences, including sperm viability (P = 0.7083), concentration (P = 0.9030), total motility (P = 0.6149), VCL (curvilinear velocity; P = 0.1216), VAP (average path velocity; P = 0.1231) and VSL (straight-line velocity; P = 0.1340). Our results indicate that acute maintenance at hyperosmotic conditions eliminates sperm activation by urine and maintains sperm quality. Such a

Em peixes de água doce com fertilização externa, a amostragem de espermatozoides pode ser contaminada pela urina, o que desencadeia motilidade e gera menor sucesso na fertilização. A manutenção de peixes de água doce em condições hiperosmóticas pode reduzir a produção de urina e melhorar a qualidade do esperma. Assim, o presente trabalho foi delineado para verificar se a exposição aguda a várias concentrações de NaCl melhora a qualidade do esperma no tetra-amarelo Astyanax altiparanae. A espermiação foi induzida usando uma dose única de hipófise da carpa (5 mg kg-1) e os machos foram mantidos em várias concentrações de NaCl: NaCl 0,00% (controle), NaCl 0,45%  (hipoosmótico), NaCl 0,9% (isosmótico) e NaCl 1,0% (hiperosmótico) por seis horas a 26 °C. O esperma foi colhido e verificado quanto à ativação por urina e traços de motilidade. Em 0,00%, 0,45%, 0,90% os espermatozóides eram móveis logo após a amostragem, indicando ativação pela urina. Surpreendentemente, em condições hiperosmóticas, nenhuma ativação foi observada. Outros parâmetros espermáticos e de motilidade não mostraram diferenças estatísticas, incluindo viabilidade espermática (P = 0,7083), concentração (P = 0,9030), motilidade total (P = 0,6149), VCL (Velocidade Curvilinear; P = 0,1216), VMD (Velocidade Média de Deslocamento; P = 0,1230) e VLR (Velocidade em linha Reta; P = 0,1340). Nossos resultados indicam que a m