Resumo
A rodococose equina manifesta-se principalmente através da ocorrência de pneumonia em potros, representando um grande desafio para a criação de equinos no Brasil e no mundo. Seu agente etiológico é uma bactéria intracelular facultativa, denominada Rhodococcus equi, cuja patogenicidade está associada à capacidade de replicar no interior de macrófagos. Os genes vapA e rhbC são necessários para sobrevivência intracelular de R. equi, uma vez que codificam a proteína associada à virulência A (VapA) e o sideróforo rhequichelin, respectivamente. A homeostasia do ferro (Fe) é regulada com precisão pelos micro-organismos, pois sua restrição limita a replicação destes, enquanto o excesso pode ser tóxico. R. equi é capaz de adquirir Fe através da transferrina (Tf), porém o mecanismo responsável por esta interação ainda não está elucidado.A aquisição de Fe ligado à Tf através da proteína Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) foi recentemente descrita em Mycobacterium tuberculosis, um patógeno intracelular similar ao R. equi. Em células eucarióticas, a GAPDH atua tanto na aquisição quando no efluxo de Fe. Nesse contexto, torna-se importante entender os mecanismos envolvidos na homeostasia do Fe por R. equi e buscar por alternativas terapêuticas e profiláticas com potencial para modular à imunidade nutricional. A presente dissertação descreve as alterações no crescimento bacteriano e na expressão dos genes GAPDH, rhbC e vapA em R. equi cultivado em diferentes concentrações de Fe, bem como na presença de apo-Tf (Tf insaturada) e holo-Tf (Tf saturada). Os cultivos bacterianos foram realizados em meio mínimo com lactato (controle) e suas variações (excesso de Fe, restrição de Fe e suplementação com apo-Tf e holo-Tf). O crescimento bacteriano foi avaliado através da contagem de unidades formadoras de colônias após 24 e 48 horas de incubação. Após o crescimento bacteriano foi realizada o isolamento do RNA e a síntese do cDNA, que posteriormente foi quantificado através da reação da cadeia polimerase em tempo real (PCR-RT). Em restrição de Fe observou-se a redução das taxas de crescimento de R. equi,onde em níveis extremos observou-se a sua morte. A taxa de transcrição dos genes GAPDH, vapA e rhbC elevaram-se em ambiente de restrição de Fe, quando comparadas ao controle. Todavia, para rhbC esta elevação é observada apenas em níveis críticos de restrição. Por outro lado, rhbC e vapA também aumentaram sua expressão em meio com excesso de Fe. Com base nestes resultados, acreditamos que além da função na aquisição de Fe, o sideróforo rhequichelin possivelmente desempenhe um papel antioxidante em R. equi, promovendo o sequestro deste micronutriente quando em excesso. Os resultados obtidos indicam que GAPDH participa da homeostasia de Fe em R. equi, possivelmente de forma similar a sua atuação em Mycobacterium tuberculosis. Futuros estudos são necessários a fim de elucidar os mecanismos pelos quais GAPDH e rhequichelin atuam na homeostasia do Fe e na sobrevivência intracelular de R. equi. É importante ressaltar que esses mecanismos podem representar potenciais alvos terapêuticos e de prevenção da rodococose em equinos jovens.
Pneumonia in foals is the main clinical manifestation of equine rhodococosis, and represents an important challenge in equine production in Brazil and world-wide. The etiologic agent is an intracellular facultative bacterium, named Rhodococcus equi. Its pathogenicity is associated to its ability to replicate inside macrophages. The genes vapA e rhbC, which encode virulence associated protein A (VapA) and the siderophore rhequichelin, respectively, are required for intracellular survival of R. equi. Iron (Fe) homeostasis is precisely regulated by microorganisms: its restriction limits cell replication, and its excess might be toxic. R. equi acquires Fe from holo-tranferrin, however, the mechanisms involved are unknown. The acquisition of Fe bound to Tf by the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was described on Mycobacterium tuberculosis, a pathogen similar to R. equi. In eukaryotic cells, GAPDH has a role in both up-take and efflux of Fe. It is important to understand the mechanisms involved in R. equi Fe homeostasis in order to develop therapeutic and prophylactic alternatives with potential to modulate nutritional immunity. The present dissertation describes the changes in bacterial growth rates and in gene expression of GAPDH, rhbC and vapA in R. equi cultures under different concentration of Fe as well as presence or absence of apo-Tf (unsaturated-Tf) and holo-Tf (saturated-Tf). Quantitative culture of R. equi was performed in lactate minimal media (control) e its variations (Fe excess, Fe deprivation, and apo-Tf and holo-Tf supplementation). Bacterial growth rates were measured at 24 and 48 hours postincubation, by counting the number of colony-forming units. The RNA was isolated from the bacterial culture and the cDNA synthesized for latter quantification by real-time polymerase chain reaction (PCR-RT). Under Fe deprivation, there were a decrease in R. equi growth rates and in the critical level bacterial death were observed. It was found that GAPDH, rhbC and vapA transcription increase in a Fe deprived environment, however, the rhbC gene expression increase was observed only in critical levels of Fe starvation. Conversely, rhbC and vapA were also up regulated in media with Fe excess. Based on these results, we believe that in addition to the role in the Fe acquisition, rhequichelin might have an antioxidant role in R. equi by sequestration of this micronutrient in excessive concentration. The results indicate that GAPDH participate on Fe homeostasis in R. equi, possibly with similar function as observed in Mycobacterium tuberculosis in which the GAPDH expression increased in Fedepleted environment, indicating a possible role R. equi Fe acquisition. Further studies are needed to elucidate the mechanisms involved in GAPDH and rhequichelin functions in Fe homeostasis and in intracellular survival of R. equi. It is important to highlight that these mechanisms might be potential targets for rhodococcosis prevention and therapy in young foals.