Resumo
A constante busca pelo aperfeiçoamento nos processos que garantam a segurança dos alimentos impulsionam estudos com o intuito de conhecer melhor as características de patógenos, que, quando presentes, causam impactos negativos ao setor avícola. Salmonella Heidelberg (SH) é o sorovar que se destacou nos últimos anos devido sua alta prevalência e multirresistência aos antimicrobianos. Buscou-se nesse trabalho informações quanto à formação de biofilmes, à suscetibilidade antimicrobiana, e à detecção de genes de virulência, permitindo, assim, melhor entendimento e maneiras alternativas de eliminação da SH. Encontramos variados perfis genotípicos (56), diferentes graus de formação de biofilme e altas taxas de multirresistência (125/126 - 99,2%), sugerindo que há uma diversidade de isolados de SH em produtos avícolas, o que pode indicar a existência de fontes de contaminação variáveis na indústria de alimentos. Atualmente, o mundo está enfrentando um crescente surgimento de bactérias resistentes aos antibióticos e a necessidade de reduzir o seu uso indiscriminado é fundamental. A procura de novos compostos antimicrobianos a partir de espécies vegetais, como óleos essenciais (OEs), e o uso de bacteriófagos (fagos), tem se mostrado bastante expressiva. Os fagos são predadores naturais de bactérias, onipresentes no ambiente e com alta especificidade ao hospedeiro, inofensivo para homens e animais. Os OEs são utilizados desde a idade média nos mais diferentes ramos das indústrias farmacêutica, sanitária, agrícola e de alimentos, e sua atividade bactericida também é tida como destaque. Nesse contexto, ambos são considerados alternativas valiosas e uma oportunidade de reduzir o uso de antimicrobianos. Avaliou-se a capacidade de biocontrole com o uso de três bacteriófagos (UPF_BP1, UPF_BP2, UPF_BP3) isolados ou combinados (pool) para prevenção e remoção de biofilmes de SH em superfície de poliestireno, em tempos de 3, 6 e 9 horas de ação. Os fagos individuais e em combinação demonstraram reduções na adesão de SH em até 83,4%, e remoção do biofilme pré-formado de até 64,0%. Ressalta-se que o uso de combinações sinérgicas entre os fagos é a mais indicada por potencializar a redução, bem como o uso no condicionamento de superfícies ser mais eficaz do que em biofilmes pré-formados. No teste com os OEs, avaliou-se a ação in vitro de cinco óleos (orégano, canela, tomilho, cravo e gengibre) sobre os isolados de SH, avaliando atividade antimicrobiana em ágar difusão e concentração inibitória mínima (CIM). O orégano e a canela obtiveram ação antimicrobiana em baixas concentrações sobre os isolados. Além disso, o efeito do OE de orégano foi testado em matriz cárnea nas temperaturas de 12±1ºC e a 4±1ºC por 0, 1, 3 e 5 dias, sendo eficiente para redução da carga microbiana em diferentes temperaturas e tempo de contato com a matriz confrontada, enfatizando a importância da associação à baixas temperaturas. Com esses resultados temos disponíveis métodos naturais que podem ser alternativas para o controle desse patógeno, e contribuem para o futuro uso de bacteriófagos como medida de condicionamento de superfícies no biocontrole de biofilmes de SH.
The constant search for improvement in processes that guarantee food safety, stimulate studies in order to better understand pathogens characteristics, if present, causes negative impacts to poultry sector. Salmonella Heidelberg (SH) is the sorovar that has stood out in recent years due to its high prevalence and antimicrobials resistence. The objective of this research was to find information regarding the biofilm formation, antimicrobial susceptibility, and virulence genes detection, thus allowing a better understanding and alternative ways to eliminate SH. We found varied genotypic profiles (56), different biofilm formation degrees and high multi-resistance rates (125/126 -99.2%), suggesting that there is a diversity of SH isolates in poultry products, which may indicate existence of sources contamination at food industry. Currently, the world is facing an increasing emergence of antibiotic resistant bacteria and the need to reduce their indiscriminate use is fundamental. The search for new antimicrobial compounds from plant species, such as: the essential oils (EOs) and also the use of bacteriophages (phages), has been shown to be expressive. Phages are natural predators of bacteria, they are ubiquitous in environment and with high specificity to the host, harmless to man and animals. EOs have been used since middle ages in most different branches of pharmaceutical, sanitary, agricultural and food industries, and their bactericidal activity is also highlighted. In this context, both are considered valuable antimicrobial alternatives and an opportunity to reduce the use of antimicrobials. The biocontrol ability was evaluated using three bacteriophages (UPF_BP1, UPF_BP2, UPF_BP3) isolated or combined (pool) to prevent and remove SH biofilms on polystyrene surfaces, in 3, 6 and 9 h of action. Individual and combined phages showed reductions in SH adherence up to 83.4%, and preformed biofilm removal up to 64.0%. It´s noteworthy that the use of synergistic combinations between phages is most indicated, since it has enhanced reduction, as well as use in surface conditioning to be more effective than in preformed biofilms. In test with EOs, in vitro action of five oils (oregano, cinnamon, thyme, cloves and ginger) on SH isolates was evaluated, evaluating antimicrobial activity in diffusion agar, minimum inhibitory concentration (MIC). Oregano and cinnamon obtained antimicrobial action in low concentrations on isolates. In addition, the effect of EO of oregano was tested in a meat matrix at temperatures of 12±1ºC and at 4±1ºC for 0, 1, 3 and 5 days, being efficient for reducing the microbial load at different temperatures and time of contact with the confronted matrix, emphasizing the importance of association with low temperatures. With these results we have available natural methods that can be alternatives for pathogen control and contribute to future use of bacteriophages as a measure of surface conditioning in SH biofilms biocontrol. With these results we have available natural methods that can be alternatives for pathogen control and contribute to future use of bacteriophages as a measure of surface conditioning in SH biofilms biocontrol.
Resumo
A Salmonella Enteritidis vem se destacando como o sorotipo mais comum nos seres humanos em âmbito mundial, sendo o principal causador de surtos de doenças transmitidas por alimentos. A Salmonella spp. pode aderir e formar biofilmes em superfícies inertes de processamento de alimentos que, uma vez formados, agem como pontos de contaminação constante. Microrganismos na forma séssil resistem significativamente mais aos agentes empregados nos procedimentos de higienização, que consistem no uso de água quente, detergentes e sanificantes, visando reduzir os microrganismos até níveis seguros e obter um produto de boa qualidade higiênico-sanitária. Com base na relevância destes temas, esta dissertação foi elaborada com dois artigos científicos. No Capitulo 1 foram comparados dois métodos laboratoriais para remover biofilmes de Salmonella spp., cultivadas in vitro em superfície de aço inoxidável proveniente de indústria de alimentos. Utilizaram-se, na etapa de remoção, o turbilhonamento com vórtex por 2 min, e o método de sonicação por 10 min (banho de ultrassom, com frequência de 40 kHz e potência de 81 W). Apesar de não encontrarmos diferença estatística entre os métodos, o uso do ultrassom foi escolhido como padrão para a desadesão devido à facilidade de uso e às propriedades hidrodinâmicas que desestabilizam a estrutura do biofilme. No Capitulo 2 avaliou-se a capacidade da SE formar biofilme em diferentes superfícies e processos de higienização. Nos procedimentos de higienização os cupons permaneceram por 3 minutos imersos em água estéril aquecida a 45ºC e a 85ºC, e nas soluções de ácido peracético 0,5% e amônia quaternária 1%, por 5 minutos. A aderência bacteriana indicou que ambas as SE aderiram ao polietileno, poliuretano e no aço inoxidável. Entre as temperaturas de exposição, a SE 84 e a SE 106 aderiram sob todas as temperaturas de exposição, 3°C, 9°C, 25°C, 36°C e 42°C, aumentando a adesão conforme subia a temperatura, mas sem diferença estatística. O ácido peracético e a água a 85ºC tiveram ação semelhante na remoção do biofilme. Já a água a 45ºC não foi eficaz, ficando próximo do controle. O outro sanitizante testado, a amônia quaternária, removeu o biofilme, mas com menor eficácia comparado ao ácido peracético. De maneira geral, os resultados demonstraram que esses materiais, utilizados na indústria de alimentos, propiciaram a aderência das SE nas diferentes condições ambientais. Enfatiza-se a formação de biofilmes em temperaturas de refrigeração, principalmente a 3°C, até então não descrita como possível para crescimento de Salmonella spp. nestas superfícies. Nossos resultados são, portanto, importantes para o desenvolvimento de estratégias de controle de biofilmes de Salmonella e pode auxiliar a indústria avícola a ter um maior conhecimento das reais condições dos abatedouros, levando a um aprimoramento das condições higiênicas destes estabelecimentos.
Salmonella Enteritidis is the most common serotype in humans worldwide, being the main cause of foodborne illness outbreaks. Salmonella spp. can adhere and form biofilms on inert surfaces of food processing, and once formed, they act as constant contamination points. Sessile microorganisms resist significantly more to agents used in cleaning procedures, consisting in the use of hot water, detergent and sanitizing, aiming to reduce microorganisms to safe levels, so as to obtain a product of good sanitary conditions. On the basis of relevance of these themes, this dissertation was drawn up on two scientific papers. In Chapter 1, we compared two laboratory methods to remove biofilms Salmonella spp., grown in vitro on stainless steel surface from the food industry. Were used, in the removal stage, the vortexing performed for 2 min, and sonication method, with coupons maintained for 10 min in ultrasound bath, at a frequency of 40 kHz and potency 81 W. Although there was no statistical difference between the tested methods, the use of ultrasound, will be used for the standard detachment, due to their ease of use and hydrodynamic properties that destabilize the structure of the biofilm. In Chapter 2, we evaluated the SE's ability to form biofilms on different surfaces and cleaning processes. Stainless steel coupons, polyethylene and polyurethane were immersed with bacterial culture of each strain SE 84 and SE 106, both coming from the poultry environment. Was incubated at 42±1°C, 36±1°C, 25±1°C, 9±1°C and 3±1°C, at 0, 4, 8, 12 and 24 hours. In the hygiene procedures, coupons immersed for 3 minutes in sterile heated water to 45°C and 85°C, and peracetic acid 0,5% solutions and quaternary ammonium 1%, for 5 minutes. The bacterial adherence indicated that both SE adhered to the polyethylene, polyurethane and stainless steel. Among the exposure temperatures, SE 84 and SE 106 adhered to all exposure temperatures 3°C, 9°C, 25°C, 36°C and 42°C, increasing the adherence as the temperature rise, but with no statistical difference. The peracetic acid and water at 85°C were similar action in biofilm removal. Since the water at 45°C was not effective, getting close to the control. Other sanitizer tested, quaternary ammonia, removed the biofilm, but with lower efficacy compared to peracetic acid. Overall, the results demonstrated that these materials used in the food industry, propitiated the adherence of SE serovars in different environmental conditions. Emphasizes the biofilms formation in refrigeration temperatures, especially at 3°C, not previously described possible for growth of Salmonella spp. on these surfaces. Our results are, therefore, important for development Salmonella biofilm control strategies and may assist the poultry industry to have a greater knowledge of the actual conditions of slaughterhouses, leading to an improvement of hygienic conditions these establishments.