Resumo
A alta pressão gasosa (HGP, do inglês high gaseous pressure) tem sido descrita como um agente estressante capaz de induzir respostas ao estresse subletal, fornecendo proteção celular e estímulos positivos a desafios subsequentes, como a criopreservação, produção in vitro de embriões (PIVE) , entre outras biotécnicas da reprodução, embora os mecanismos celulares, a modulação epigenética e as modificações no padrão de expressão gênica envolvidos ainda não estejam totalmente elucidados. Este princípio foi investigado em gametas bovinos e embriões murinos no presente trabalho. Foram realizados dois experimentos independentes. No primeiro, avaliou-se o efeito da exposição de oócitos bovinos no estádio de vesículas germinativa à HGP na eficiência e cinética de desenvolvimento da PIVE por fecundação in vitro (FIV). Os resultados revelaram que oócitos expostos a HGP em temperatura ambiente apresentaram taxa de maturação in vitro (MIV) e cinética de desenvolvimento até o estádio de blastocisto semelhantes ao controle mantido em condições ideais durante o tratamento do grupo experimental, diferentemente do observado no grupo com CCOs mantidos em temperatura ambiente durante a exposição à HGP. Em um segundo experimento, observou-se as alterações no padrão de expressão gênica de blastocistos murinos expostos previamente à alta pressão gasosa no estádio de embrião de 8-células, bem como se este desafio alterava a taxa de sobrevivência destes blastocistos após serem submetidos ao processo de criopreservação. A análise do padrão de transcrição revelou que um gene associado ao estresse oxidativo (Sod2) teve sua expressão aumentada, enquanto genes de proliferação e desenvolvimento (Igf2 e Igf2R) tiveram sua expressão reduzida, quando comparados com os embriões no estádio de 8-células, embora a relação Igf2/Igf2R não demonstrou ser afetada. O tratamento por HGP mostrou-se eficiente no aumento da taxa de sobrevivência de blastocistos após a criopreservação. Os experimentos permitiram concluir que a resposta ao estresse subletal estimulada pela HGP é eficiente na melhora da performance de gametas femininos e embriões submetidos a novas situações estressantes.
High gaseous pressure (HGP) has been described as stressor, providing cell protection and positive stimuli to subsequent challenges like cryopreservation, embryo in vitro production (IVP), among other reproduction biotechnologies, although cells mechanisms, epigenetic modulation and transcriptional modifications are not totally elucidated. This principle was investigated in bovine gametes and murine embryos in this report at two independent studies. First, the effect of bovine oocyte exposure to HGP in germinal vesicle stage was evaluated to efficiency and development kinect of IVP by in vitro fertilization (IVF). Results showed that oocytes exposed to HGP at room temperature had in vitro maturation (IVM) rate and developmental kinect to reach the blastocyst stage similar to control group kept in ideal conditions during experimental group treatment, differently that what was observed in the group with COCs just kept at room temperature during HGP exposure. In the second experiment, modifications in transcriptional response were observed in murine blastocysts previously exposed to HGP when embryo 8-cells stage, as well if this challenge modified survival rate of this blastocysts after cryopreservation procedures. The analysis of the transcriptional pattern revealed that a gene associated to oxidative stress (Sod2) was upregulated, while genes of proliferation and development (Igf2 and Igf2R) were downregulated, when compared with 8- cells embryos, even though the ratio Igf2/Igf2R appeared not be affected. HGP treatment showed to be efficient to improve blastocyst survival rate to cryopreservation. The experiments enable inferring that subletal response stimulated by HGP was efficient to enhance performance of female gametes and embryos exposed to new stressor situations.
Resumo
A alta pressão gasosa (high gaseous pressure, HGP) tem sido descrita como um agente estressante capaz de induzir resposta ao estresse subletal, fornecendo proteção celular a estresses subsequentes, como a criopreservação, embora os mecanismos celulares envolvidos ainda não estejam elucidados. Este princípio foi investigado em blastocistos murinos expostos a diferentes tratamentos utilizando-se HGP, seguidos ou não de criopreservação. De um total de 427 fêmeas de Mus musculus domesticus superovuladas, 308 (72,1%) produziram 3070 blastocistos viáveis (média de 7,2 ± 11,5 blastocistos/fêmea superovulada e de 10,0 ± 12,5 blastocistos/fêmea responsiva ao tratamento superovulatório) que foram expostos a tratamentos de distintas pressões e tempos de exposição, em quatro grupos experimentais: (a) 20,7 MPa por 2 h (P20.T2); (b) 20,7 Mpa por 4 h (P20.T4); (c) 27,6 Mpa por 2 h (P27.T2); e (d) 34,5 Mpa por 2 h (P34.T2). Todos os grupos foram pareados com controles não expostos à HGP. No primeira parte do experimento, embriões foram expostos à HGP, conforme os grupos experimentais acima, e posteriormente submetidos ao cultivo in vitro por 72 h com o objetivo de verificar a influência dos protocolos de HGP sobre a taxa de eclosão. Não houve diferença nas taxas de eclosão e na morfologia entre os grupos experimentais e os controles. Já na segunda parte do experimento, os embriões foram expostos à HGP, conforme os grupos experimentais acima, e posteriormente criopreservados por curva de congelamento clássica (rápida). Após o descongelamento, os embriões foram cultivados in vitro por 72 h para a avaliação das taxas de eclosão entre os grupos. A taxa de eclosão do Grupo P34.T2 foi significativamente maior do que a dos controles criopreservados não expostos à HGP (70,2% vs. 58,6%, p < 0,05). Conclui-se que a HGP pode ser usada como agente estressor subletal sem perda da viabilidade embrionária, e que o uso da HGP de 34,5 MPa por 2 h prévio à criopreservação modificou positivamente a taxa de sobrevivência in vitro de blastocistos murinos criopreservados.
High gaseous pressure (HGP) has been reported as a sublethal stressor able to induce "sublethal stress response, providing cell protection to subsequent stress, such as cryopreservation, although the involved cellular mechanisms are little understood. This principle was investigated on murine blastocysts exposed to different HGP treatments with and without subsequent cryopreservation. A total of 308 (72.1%) out of 427 superovulated Mus musculus domesticus females produced 3,070 viable blastocysts (7.2 ± 11.5 blastocysts/superovulated mouse and 10.0 ± 12.5 blastocysts/female responsive to superovulation) that were exposed to distinct pressure intensities and exposure times, according to four experimental groups: (a) 20.7 MPa for 2 h (P20.T2); (b) 20.7 MPa for 4 h (P20.T4); (c) 27.6 MPa for 2 h (P27.T2); and (d) 34.5 MPa for 2 h (P34.T2). All groups were compared with non-exposed HGP controls. In the first part of the experiment, embryos were exposed to HGP treatments, according to the experimental groups as above, and subsequently in vitro-cultured for 72 h aiming to compare the effects of the HGP protocols on subsequent hatching rates. No differences in hatching rates and morphology were observed between experimental and control groups. In the second parto of the experiment, embryos were exposed to HGP treatments, according to the experimental groups as above, and subsequently cryopreserved by rapid (classic) freezing. After thawing, embryos were in vitro-cultured for 72 h to compare hatching rates between groups. Hatching rates in the P34.5.T2 group were significantly higher than for the cryopreserved control embryos with no HGP treatment (70.2% vs. 58.6%, p < 0.05). Therefore, we conclude that HGP can be used as a stressor without compromising subsequent in vitro embryo viability, and the use of HGP at 34.5 MPa for 2 h prior to cryopreservation improved the in vitro survival of cryopreserved murine blastocysts compared with control counterparts.